掃描電鏡生物樣品制備技術(shù)

1、Features of SEMFeatures of SEMFeatures of SEMFeatures of SEM生物、醫(yī)學(xué)、動(dòng)物、材料、 化學(xué)、物理、地質(zhì)、冶金、礦物、污泥 (桿菌)、機(jī)械、電機(jī)及導(dǎo)電性樣品如半導(dǎo)體電子材料等材料學(xué)土聚水泥 制備掃描電鏡樣品的總要求 在不損傷樣品原始結(jié)構(gòu)狀態(tài)的情況下，保證樣品的體積和表面積不發(fā)生改變，充分暴露樣品表面的微細(xì)結(jié)構(gòu) 。掃描電鏡生物樣品要求： 不含水份 具有較高的二次電子發(fā)射率 良好的導(dǎo)電性 耐熱性 最大限度的保持樣品的形貌 1. 取 材 2. 清 洗 3. 固 定 4. 脫 水 5. 干 燥（置換） 6. 粘 托 7. 鍍 膜（導(dǎo)電處理） 一

2、、 要 點(diǎn)： 確定觀察樣品的目標(biāo)要求及注意事項(xiàng)： 做好充分準(zhǔn)備（試劑、儀器、器械等） 保護(hù)觀察面，作好標(biāo)記 速度要快 ，每次取材數(shù)量不宜過多 大小要合適 10 10 5毫米 避免拉割、擠壓二、目的：去除觀察面的雜質(zhì)，充分暴露觀察面方法：物理方法: 漂洗、換洗、加壓沖洗、振蕩超聲。 化學(xué)方法: 用酶消化法注意事項(xiàng)： 在保證不破壞觀察面的條件下，充分暴露觀察面 不要損傷觀察面或者使樣品膨脹、收縮等 不要將樣品裸露在空間，防止樣品皺縮變型清洗液的選擇 一般組織：等滲生理鹽水 游離組織細(xì)胞：緩沖液、等張液 表面覆有大量黏液的組織（如胃腸粘膜）：低濃度蛋白水解酶 組織培養(yǎng)細(xì)胞：組織培養(yǎng)液 特殊樣品：特殊

3、洗液（如生藥表面的蠟質(zhì)，選用去垢劑Triton X-100）三、 固定目的： 保存樣品表面的真實(shí)結(jié)構(gòu)； 硬化組織，減少脫水干燥時(shí)水的表面張力對(duì)樣品的損傷； 提高樣品的二次電子發(fā)射率； 提高樣品的耐熱性和導(dǎo)電性。常用的固定劑： 2.5%戊二醛 （13h) 1.0%四氧化鋨(301h)固定溫度： 室 溫，一般以4為宜。四、脫水 要求：不改變樣品的體積和表面積的情況 下，去除樣品中的水份。常用的脫水劑：乙醇、丙酮 方法：梯度脫水時(shí)間：視樣品大小而定注意事項(xiàng)：避免裸露，夾傷五、目的：去除樣品中的脫水劑 方法：空氣干燥法、冷凍干燥法、 叔丁醇干燥法、臨界點(diǎn)干燥法等常用干燥法：叔丁醇干燥法、臨界點(diǎn)干燥法空

4、氣干燥法 方法：脫水至無水狀態(tài)，為減緩其揮發(fā)速度，退回至85%脫水劑，取出，空氣中自然干燥。 優(yōu)點(diǎn)：脫水劑為低表面張力物質(zhì)，揮發(fā)過程中減少了樣品的收縮及損傷 缺點(diǎn)：常常使樣品發(fā)生變形收縮 適用范圍：鑄型或體表比較堅(jiān)硬的甲殼昆蟲等含水量較少的樣品冷凍干燥法 方法：將含大量水分的生物樣品迅速投入液氮中，使樣品冷凍固化，而后將樣品移入真空鍍膜儀內(nèi)，在高真空狀態(tài)下升華，脫水劑直接由固態(tài)轉(zhuǎn)為氣態(tài)，樣品隨之得到干燥。 優(yōu)點(diǎn)：不存在氣相與液相間的表面張力問題，故對(duì)樣品損傷較小。 缺點(diǎn)：需特殊的低溫條件，易出現(xiàn)冰晶損傷，費(fèi)時(shí)。 適用范圍：含水量較多的生物樣品（1）乙醇梯度脫水至100/ 2次 （2） 叔丁醇與

5、乙醇混合液置換至100%叔丁醇 70、 80、 90 、95和 100/ 2次 5 - 10min/次（3）在樣品表面滴上 100%叔丁醇（4）將標(biāo)本置于4以下使樣品快速固化（5）移入鍍膜儀中讓樣品在真空下升華干燥。臨界點(diǎn)干燥法 原理：利用物質(zhì)在臨界狀態(tài)時(shí)，氣相與液相 的界面消失，樣品在沒有表面張力的 情況下進(jìn)行干燥。步驟：脫水 置換（醋酸異戊酯） 預(yù)冷 放入樣品 注入液態(tài)CO2 CO2置換 CO2加溫氣化 排除CO2溫度：31.4度壓力：73個(gè)大氣壓臨界點(diǎn)干燥法空氣干燥法 Comparison between critical point drying and air drying 六、粘托

6、 SEM樣品在干燥處理或金屬鍍膜之前，需用特制導(dǎo)電膠或雙面膠將樣品粘貼在金屬樣品臺(tái)上。 導(dǎo)電膠一般具有黏著力較強(qiáng)、容易揮發(fā)固化、干燥后表面電阻率低、導(dǎo)電性能好等特點(diǎn)。 要點(diǎn)：穩(wěn)，鈍角樣 品 粘 托Fixing the specimen 七、鍍膜（樣品的導(dǎo)電處理）目的：使樣品導(dǎo)電，增加二次電子的發(fā)射率金屬鍍膜技術(shù)：包括真空噴鍍法和離子濺射法真空噴鍍法 方法：在高真空中使金屬加熱蒸發(fā)，在 樣品表面沉積形成一層金屬膜。缺點(diǎn)：金屬損耗大，容易產(chǎn)生污染和熱 損傷，容易形成“死角”。離子濺射法原理： 利用氣體在低真空中的輝光放電所產(chǎn)生的高能離子，對(duì)靶極產(chǎn)生撞擊，從靶極上打出金屬粒子，金屬粒子在電場(chǎng)的作用下

7、飛向樣品。在到達(dá)樣品前，金屬粒子之間以及金屬粒子與氣體分子之間要發(fā)生相互撞擊，改變了金屬粒子飛向樣品的方向，具有“繞射”效應(yīng)，所以在樣品表面能形成一層連續(xù)的、厚度均勻的金屬膜。離子濺射的優(yōu)點(diǎn)： 要求的真空低 工作溫度低 金屬粒子無方向 連續(xù)的、厚度均勻 甲 蟲 3kV大腸桿菌耳蝸尿酸鈉結(jié)晶紅細(xì)胞巨噬細(xì)胞吞噬上左：兔腎小體細(xì)胞上右：血細(xì)胞發(fā)生下圖：十二指腸絨毛 TRRT T. harzianum (T)寄生在立枯絲核菌寄生在立枯絲核菌(R)菌株上的情形菌株上的情形 特殊生物樣品制備主要有： （1）管道鑄型樣品 （2）冷凍斷裂樣品 （3）游離細(xì)胞樣品 （4）組織消化樣品2 冷凍斷裂樣品 用于實(shí)質(zhì)性

8、臟器內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)的研究，觀察組織細(xì)胞內(nèi)部各種復(fù)雜的細(xì)胞器及相互之間的關(guān)系。步驟：取材 固定 清洗 防凍 冷凍 包埋 割斷 軟化 后固定 導(dǎo)電 及終末固定 脫水 臨界點(diǎn)干燥 鍍膜 觀察要求：取材迅速 ，大小為1 1 5mm， 用具要 預(yù)冷，切忌夾持觀察面，冷凍的速度要 快，外力要輕3 游離細(xì)胞樣品樣品制備要點(diǎn)： 將相對(duì)低濃度、分散、游離的細(xì)胞濃縮、集中、固定步驟：預(yù)固定 離心 涂片 固定 脫水 干燥 鍍膜血細(xì)胞4 組織消化樣品 用化學(xué)腐蝕或酶消化方法，來充分暴露和顯示被檢樣品結(jié)構(gòu)的表面形態(tài)。 步驟： 固定 清洗 消化 表面穩(wěn)定 后固定 脫水 干燥 鍍膜 觀察謝 謝！謝 謝！Features of SEMFeatures of SEM（1）乙醇梯度脫水至100/ 2次 （2） 叔丁醇與乙醇混合液置換至100%叔丁醇 70、 80、 90 、95和 100/ 2次 5 - 10min/次（3）在樣品表面滴上 100%叔丁醇（4）將標(biāo)本置于4以下使樣