HXY基因工程的載體和工具酶課件

1、HXY基因工程的載體和工具酶1第二章第二章基因工程的載體基因工程的載體HXY基因工程的載體和工具酶2 載體載體在基因工程操作中，把能攜帶外源在基因工程操作中，把能攜帶外源DNA進入受進入受體細胞的體細胞的DNA分子叫分子叫載體（載體（vector）。）。HXY基因工程的載體和工具酶3基因工程對載體基因工程對載體 的要求的要求（1）在宿主細胞內能獨立復制。 復制子：載體上有特殊的復制起點，使其能夠攜帶外源基因在宿主細胞中獨立復制繁殖（2）有利于檢測篩選的標記。（3）有一段多克隆位點。 便于外源DNA插入載體而不影響載體的復制。（4）分子量小，拷貝數多。 （5）容易從宿主細胞中分離純化。HXY基因

2、工程的載體和工具酶4載體的種類載體的種類按照來源分為：按照來源分為：按照功能分為：按照功能分為：質粒（質粒（plasmid） 單鏈單鏈DNA噬菌體噬菌體M13 噬菌體的衍生物噬菌體的衍生物 柯斯質粒（柯斯質粒（cosmid） 動物病毒（動物病毒（virus） 克隆載體克隆載體: : 克隆一個基克隆一個基因或因或DNADNA片斷片斷表達載體表達載體: : 用于一個基用于一個基因編碼的蛋白表達因編碼的蛋白表達整合載體整合載體: : 把一個基因把一個基因插入到染色體組中插入到染色體組中HXY基因工程的載體和工具酶5 載體的分類載體的分類分類依據分類依據 類類 別別舉舉 例例1.1.按功能分成按功能分

3、成（1 1）克隆載體）克隆載體（2 2）表達載體）表達載體pBR322pBR322pCDN3pCDN32.2.按進入受體細胞類型分按進入受體細胞類型分（1 1）原核載體）原核載體（2 2）真核載體）真核載體（3 3）穿梭載體）穿梭載體pUC18pUC18pBUDCE41pBUDCE41YECYEC3.3.按載體來源分按載體來源分質粒（質粒（plasmidplasmid） 單鏈單鏈DNADNA噬菌體噬菌體M13 M13 噬菌體的衍生物噬菌體的衍生物 柯斯質粒（柯斯質粒（cosmidcosmid） 動物病毒（動物病毒（virusvirus） 4.4.按克隆片段得大小（克隆能按克隆片段得大?。寺∧?/p>

4、力）分力）分(1)1kb (1)1kb (2)10kb (2)10kb (3)22kb(3)22kb(4)50kb (4)40 oC）時，拷貝數會很快增）時，拷貝數會很快增加到加到1000個以上。個以上。如如pBEU1、pBEU2。runaway plasmid vectors1979年年B. E. Uhlin等構建。等構建。HXY基因工程的載體和工具酶36（4） 插入失活型質粒載體插入失活型質粒載體載體的克隆位點位于其某一個選擇性載體的克隆位點位于其某一個選擇性標記基因內部。標記基因內部。如如pDF41、pDF42、pBR329?？咕乜剐钥咕乜剐酝庠赐庠碊NA無抗菌素抗性無抗菌素抗性HX

5、Y基因工程的載體和工具酶37正選擇的質粒載體正選擇的質粒載體如如pUR2、pTR262等。等。只有帶有選擇標記基因的轉化菌細胞才只有帶有選擇標記基因的轉化菌細胞才能在選擇培養(yǎng)基上生長。能在選擇培養(yǎng)基上生長。直接選擇轉化后的細胞。直接選擇轉化后的細胞。目前通用的絕大部分質粒載體都是正目前通用的絕大部分質粒載體都是正選擇載體。選擇載體。Direct selection vectorsHXY基因工程的載體和工具酶38（6） 表達型質粒載體表達型質粒載體主要用來使外源基因表達出蛋白質產物。主要用來使外源基因表達出蛋白質產物。如果在大腸桿菌里表達，必須把所克隆如果在大腸桿菌里表達，必須把所克隆的真核生物

6、的基因置于大腸桿菌的轉錄的真核生物的基因置于大腸桿菌的轉錄翻譯信號控制之下。翻譯信號控制之下。注意啟動子的性質，終止子、起始注意啟動子的性質，終止子、起始密碼、終止密碼的閱讀正確。密碼、終止密碼的閱讀正確。HXY基因工程的載體和工具酶39復制起始點復制起始點ORI、 選擇標記、選擇標記、 多克隆位點多克隆位點MCS2）大腸桿菌操縱子元件）大腸桿菌操縱子元件阻遏基因阻遏基因 I 操縱基因操縱基因O 啟動基因啟動基因P 核糖體結合位點序列（核糖體結合位點序列（SD） 轉錄終止信號區(qū)。轉錄終止信號區(qū)。1）普通載體元件）普通載體元件 表達載體的表達載體的結構結構HXY基因工程的載體和工具酶40HXY基

7、因工程的載體和工具酶41重要的質粒載體重要的質粒載體pBR322pBR322pUC18/19pUC18/19HXY基因工程的載體和工具酶42pSP2124質粒的質粒的Ampr基因基因1. pBR322：（1）元件來源）元件來源F. Bolivar和和R.L. Rodriguez人工構建載體。人工構建載體。 復制起點復制起點 oripMB1系列（來源于系列（來源于ColE1）的的高拷貝高拷貝型復制起點型復制起點 Ampr基因基因 Tetr基因基因pSC101的的Tetr 基因?；?。HXY基因工程的載體和工具酶43（2）長度）長度4363bp（3）選擇標記）選擇標記氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。氨芐青

8、霉素和四環(huán)素抗性。（4）克隆位點）克隆位點其中其中9個會導致個會導致Tetr基因失活（如基因失活（如BamH I、Hind 、Sal I）；）； 3個會導致個會導致Ampr基因失活（基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。）。24個克隆位點。個克隆位點。HXY基因工程的載體和工具酶44HXY基因工程的載體和工具酶45（5）pBR322的優(yōu)點的優(yōu)點 雙抗菌素抗性選擇標記雙抗菌素抗性選擇標記 插入失活，分兩次先后選擇：插入失活，分兩次先后選擇：沒有獲得載體的寄主細胞沒有獲得載體的寄主細胞 在在Amp或或Tet中中都都死亡。死亡。獲得載體的寄主細胞獲得載體的寄主細胞 在在Amp或或Tet其中之

9、一其中之一中死亡。中死亡。HXY基因工程的載體和工具酶46外源基因外源基因BamH IAmp中存活中存活但在但在Tet中死亡中死亡外源基因外源基因Pst ITet中存活中存活但在但在Amp中死亡中死亡HXY基因工程的載體和工具酶47氯霉素擴增之后，每個細胞可達氯霉素擴增之后，每個細胞可達10003000copy 安全安全失去了轉移蛋白基因失去了轉移蛋白基因mob（mobilization）。）。不能通過接合轉移。不能通過接合轉移。 高拷貝數高拷貝數 分子小，克隆能力大分子小，克隆能力大載體越小越好。載體越小越好。 10kb的的DNA在純化過程中容易斷裂。在純化過程中容易斷裂。HXY基因工程的載

10、體和工具酶48保留了轉移蛋白（保留了轉移蛋白（mob）的）的作用位點作用位點。能夠被能夠被ColK質粒編碼的質粒編碼的mob蛋白識別，蛋白識別，如果再有如果再有F質粒的參與，就有可能轉移！質粒的參與，就有可能轉移！HXY基因工程的載體和工具酶49 刪除刪除mobmob識別位點識別位點（如質粒（如質粒pBR327、pAT153等）。等）。pAT153：從從pBR322上切去上切去HaeII片斷，既除片斷，既除去了去了mob識別位點，又增加質粒的識別位點，又增加質粒的拷貝數。拷貝數。（7）PBR322的改進的改進HXY基因工程的載體和工具酶50pBR325：在在pBR322位點上接入一段來自噬菌位

11、點上接入一段來自噬菌體體PICm的的HaeII酶切片斷（帶有氯霉酶切片斷（帶有氯霉素抗性基因素抗性基因cmlr）。）。 cmlr上也帶一個上也帶一個EcoRI位點位點。使使EcoRI 也成為插入失活型位點。也成為插入失活型位點。 改造改造EcoR I 位點位點HXY基因工程的載體和工具酶51University of California的的J. Messing和和J. Vieria于于1978年，在年，在pBR322的基礎上改的基礎上改造而成。造而成。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19HXY基因工程的載體和工具酶52 復制起點復制起點pBR322的的

12、 ori但其上失去了克隆位點。但其上失去了克隆位點。 Ampr 基因基因（1）元件來源）元件來源 lacZ的啟動子的啟動子大腸桿菌大腸桿菌 lacZ基因基因大腸桿菌大腸桿菌lacZ的的 -肽鏈序列，肽鏈序列， 是是LacZ 的氨基端片斷。的氨基端片斷。pBR322的的Ampr基因基因HXY基因工程的載體和工具酶53（2）長度）長度約約2.7kb（3）克隆位點）克隆位點10個連續(xù)的單一限制酶切位個連續(xù)的單一限制酶切位點，位于點，位于lacZ基因的基因的5端。端。HXY基因工程的載體和工具酶54HXY基因工程的載體和工具酶55HXY基因工程的載體和工具酶56Ampicillin 抗性抗性和和 la

13、cZ的的 肽互補肽互補（藍白（藍白斑）相結合。斑）相結合。（4）選擇標記）選擇標記藍白斑選擇原理：藍白斑選擇原理： Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactoside）HXY基因工程的載體和工具酶57 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶能把無色的化合物能把無色的化合物Xgal分解成半乳糖和一個分解成半乳糖和一個深藍色深藍色的物的物質質5-溴溴-4-氯靛藍。氯靛藍。Xgal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛藍氯靛藍 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶Xgal顯色反應：顯色反應：HXY基因工程的載體和工具酶58lacZ的的 肽互補肽互補1） -肽（肽（ la

14、cZ ）：）： -半乳糖苷酶半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片斷（端的一段氨基酸片斷（11-41氨基酸）。氨基酸）。lacZ只有在只有在4 4聚體的狀態(tài)下才有功能聚體的狀態(tài)下才有功能. .C端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aa4聚體聚體HXY基因工程的載體和工具酶592）受體菌：）受體菌：lacZ突變（突變（lacZM15）受體菌基因組的受體菌基因組的 -半乳糖苷酶基因的半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失氨基端有缺失（缺失 肽），只編碼肽），只編碼C端序列，不能形成活性酶

15、，因而不能端序列，不能形成活性酶，因而不能分解分解Xgal 受體菌株：受體菌株：JM系列系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5aHXY基因工程的載體和工具酶60pUC質粒載體上的質粒載體上的lacZ 編碼編碼 肽與這個肽與這個缺失突變的缺失突變的 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶“互補互補”，使，使它能形成它能形成4聚體。又能分解聚體。又能分解Xgal。產。產生藍色物質。生藍色物質。C端大部分端大部分N端的端的11-41aapUC lacZ 受體菌受體菌lacZ3）載體）載體lacZ與與 互補互補HXY基因工程的載體和工具酶614） 互補的插入

16、失活互補的插入失活pUC載體上載體上LacZ的的5端有一段多克隆位端有一段多克隆位點點(MCS)區(qū)，本身雖不干擾區(qū)，本身雖不干擾LacZ的合的合成，但插入外源基因就會阻止成，但插入外源基因就會阻止LacZ的的合成。不能互補。合成。不能互補。 lacZ 5 3 肽移碼突變肽移碼突變lacZ 5 3 肽肽不互補不互補互補互補MCS外源外源DNAHXY基因工程的載體和工具酶62IPTG ( Isopropyl -D-1-Thiogalactopyranoside )是乳糖的類似物。能誘導是乳糖的類似物。能誘導lac操縱子的啟動轉錄，使操縱子的啟動轉錄，使受體菌基因組中的受體菌基因組中的lacZ 的的

17、C端部分端部分和載體的和載體的lacZ 肽肽都表達。從而互補。都表達。從而互補。但載體但載體MCSMCS上插入外源上插入外源DNADNA后，仍然后，仍然不能產生不能產生 肽！肽！IPTGHXY基因工程的載體和工具酶63通過看培養(yǎng)皿上的菌斑的顏色就能直接知道通過看培養(yǎng)皿上的菌斑的顏色就能直接知道是否有是否有DNADNA插入。插入。MCS無插入時，互補，藍菌斑。無插入時，互補，藍菌斑。 MCS有插入時，不互補，白菌斑。有插入時，不互補，白菌斑。IPTG誘導的結果：誘導的結果：HXY基因工程的載體和工具酶64無質粒的無質粒的 受體菌受體菌 - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶部分缺失，不部分缺失，不能分解能分

18、解XgalXgal；無抗菌素抗性無抗菌素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培養(yǎng)基上培養(yǎng)養(yǎng)基上培養(yǎng)無菌斑無菌斑生長生長質粒轉化質粒轉化的受體菌的受體菌 - -半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的缺失被載體產物缺失被載體產物 互補，能分解互補，能分解XgalXgal。且有抗菌。且有抗菌素抗性素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培養(yǎng)基上培養(yǎng)養(yǎng)基上培養(yǎng)有藍色有藍色菌斑生菌斑生長長帶外源帶外源DNADNA插插入的質粒轉化入的質粒轉化的受體菌的受體菌載體產物失活，載體產物失活，不能互補不能互補 - -半半乳糖苷酶乳糖苷酶的缺的缺失。不能分解失。不能分解XgalXgal，但有抗，但有抗菌

19、素抗性菌素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培養(yǎng)基上培養(yǎng)養(yǎng)基上培養(yǎng)有白色有白色菌斑生菌斑生長長HXY基因工程的載體和工具酶65HXY基因工程的載體和工具酶66 更小的分子量：更小的分子量：如如pUC18為為2682bp，pUC8為為2750bp。 選擇方便選擇方便X-gal顯色、抗菌素雙重直接選擇。顯色、抗菌素雙重直接選擇。 克隆便利克隆便利具有多克隆位點（具有多克隆位點（MCS），使有兩個不），使有兩個不同粘性末端的外源同粘性末端的外源DNA方便地插入。方便地插入。 測序方便測序方便HXY基因工程的載體和工具酶67pUC的的MCS與與M13噬菌體載體的噬菌體載體的MCS完完全

20、相同，便于把外源全相同，便于把外源DNA轉移到轉移到M13載載體上測序。體上測序。HXY基因工程的載體和工具酶68六、其它質粒載體六、其它質粒載體1. pGEM-3Z由由pUC派生而來。派生而來。與與pUC的主要區(qū)別是在的主要區(qū)別是在MCS的兩側分別的兩側分別加了一個噬菌體加了一個噬菌體啟動子啟動子T7和和SP6。T7啟動子啟動子SP6啟動子啟動子MCSlacZ Amprori可被可被T7和和SP6的的RNA聚合酶識別轉錄。聚合酶識別轉錄。HXY基因工程的載體和工具酶69 如果加入純化的如果加入純化的T7或或SP6 RNA聚合酶，聚合酶，在試管里就可以轉錄在試管里就可以轉錄mRNA 外源基因正

21、接反接都可以轉錄。外源基因正接反接都可以轉錄。 MCS與與pUC18的完全一樣。的完全一樣。2. pGEM-4Z：與與pGEM-3Z相同，只是相同，只是T7啟動子和啟動子和SP6啟動子的啟動子的位置互換位置互換。（1 1）pGEM-3Z的特點：的特點：HXY基因工程的載體和工具酶70（1 1）穿梭質粒載體的結構）穿梭質粒載體的結構人工構建的、具有兩種不同復制起人工構建的、具有兩種不同復制起點和選擇標記、可以在兩種不同的點和選擇標記、可以在兩種不同的寄主細胞中存活和復制的質粒載體寄主細胞中存活和復制的質粒載體。HXY基因工程的載體和工具酶71Yeast復制起點復制起點E.coli復制起點復制起點

22、E.coli選擇標記選擇標記Yeast選擇標記選擇標記MCS大腸桿菌大腸桿菌枯草桿菌穿梭載體枯草桿菌穿梭載體 大腸桿菌大腸桿菌釀酒酵母穿梭載體釀酒酵母穿梭載體 大腸桿菌大腸桿菌動物細胞穿梭載體動物細胞穿梭載體（2 2）常用的穿梭質粒載體）常用的穿梭質粒載體HXY基因工程的載體和工具酶72（3 3）穿梭載體的優(yōu)點）穿梭載體的優(yōu)點 也能利用其它細胞系統(tǒng)（酵母、枯草桿也能利用其它細胞系統(tǒng)（酵母、枯草桿菌、哺乳動物細胞等）進行基因表達。菌、哺乳動物細胞等）進行基因表達。 可以自如地在兩種不同寄主細胞之可以自如地在兩種不同寄主細胞之間來回轉移基因。間來回轉移基因?？寺?、構建克隆、構建表達表達E.coli

23、Animal cell 利用大腸桿菌進行基因克隆、表達利用大腸桿菌進行基因克隆、表達HXY基因工程的載體和工具酶73HXY基因工程的載體和工具酶74pAM267313 bpPGAL1T7 promoterAmpicillinURA3f1 oriSrPCS1pUC ori2 originCYC1TTBamHI (1977)KpnI (512)HXY基因工程的載體和工具酶75七、質粒載體的不穩(wěn)定性七、質粒載體的不穩(wěn)定性1. 質粒穩(wěn)定遺傳必須的兩個條件：質粒穩(wěn)定遺傳必須的兩個條件：（1）每個世代、每個質粒至少要復制一次）每個世代、每個質粒至少要復制一次（2）在細胞分裂時，復制過的質粒必須分）在細胞分

24、裂時，復制過的質粒必須分 配到兩個子細胞中。配到兩個子細胞中。HXY基因工程的載體和工具酶76有主動分配和隨機分配兩種假說。有主動分配和隨機分配兩種假說。（1）主動分配）主動分配天然質粒。天然質粒。具有一個控制質粒拷貝分配的功能區(qū)具有一個控制質?？截惙峙涞墓δ軈^(qū)（Par），能以主動分配的方式確保質），能以主動分配的方式確保質粒能正確分配到兩個子細胞中。粒能正確分配到兩個子細胞中。HXY基因工程的載體和工具酶77人工構建的質粒載體人工構建的質粒載體缺失了缺失了par區(qū)區(qū)，只，只能以隨機分配方式分到子細胞中。能以隨機分配方式分到子細胞中。人工質粒。人工質粒。（一般情況下也能保證質粒的穩(wěn)定遺傳）（一

25、般情況下也能保證質粒的穩(wěn)定遺傳）（2）隨機分配）隨機分配但在一定條件下會出現質粒丟失的現象。但在一定條件下會出現質粒丟失的現象。HXY基因工程的載體和工具酶78在寄主菌細胞分裂的過程中，有一個細在寄主菌細胞分裂的過程中，有一個細胞沒有獲得質?？截悾⒆罱K繁殖成無胞沒有獲得質粒拷貝，并最終繁殖成無質粒的優(yōu)勢群體。質粒的優(yōu)勢群體。3. 分離的不穩(wěn)定性分離的不穩(wěn)定性（segregation instability）HXY基因工程的載體和工具酶794. 結構的不穩(wěn)定性結構的不穩(wěn)定性（structural instability）寄主基因組的寄主基因組的IS序列插入質粒、質粒序列插入質粒、質粒間的同源重

26、組等都會使質粒發(fā)生插入間的同源重組等都會使質粒發(fā)生插入或缺失。或缺失。ISdimer重組重組HXY基因工程的載體和工具酶80（1）新陳代謝負荷：）新陳代謝負荷：5. 影響質粒載體穩(wěn)定性的主要因素影響質粒載體穩(wěn)定性的主要因素使寄主細胞生長減緩：使寄主細胞生長減緩：質粒載體使寄主的世代時間延長約質粒載體使寄主的世代時間延長約15%。 復制負荷復制負荷減緩的程度與質粒的分子量成正比。減緩的程度與質粒的分子量成正比。 轉錄和翻譯負荷轉錄和翻譯負荷丟失質粒的細胞反而會成為優(yōu)勢群體！丟失質粒的細胞反而會成為優(yōu)勢群體！HXY基因工程的載體和工具酶81每個菌體中所擁有的質?？截悢挡煌昝總€菌體中所擁有的質?？截?/p>

27、數不完全相同，稱差度。全相同，稱差度。（2）質粒載體的拷貝數）質粒載體的拷貝數低拷貝數的質粒的差度小，遺傳穩(wěn)定。低拷貝數的質粒的差度小，遺傳穩(wěn)定。差度（差度（variance）：）：是產生無質粒細胞的重要原因。是產生無質粒細胞的重要原因。高拷貝數的質粒載體差度大，擁有少量拷高拷貝數的質粒載體差度大，擁有少量拷貝數的菌體多，發(fā)生丟失的可能性大。貝數的菌體多，發(fā)生丟失的可能性大。HXY基因工程的載體和工具酶82野生型野生型E.coli中，質粒在寄主的中，質粒在寄主的重組酶重組酶作作用下會發(fā)生重組形成用下會發(fā)生重組形成二聚體質粒二聚體質粒。（3）寄主菌的重組體系）寄主菌的重組體系二聚體災難（二聚體災

28、難（dimer catastrophe）：）：含有大分子量插入片斷的質粒載體普遍含有大分子量插入片斷的質粒載體普遍能形成質粒寡聚體。能形成質粒寡聚體。二聚體質粒的復制速度是單體的二倍！二聚體質粒的復制速度是單體的二倍！導致質粒失控。導致質粒失控。HXY基因工程的載體和工具酶83第二節(jié)第二節(jié) 噬菌體載體噬菌體載體噬菌體是一類細菌病毒（噬菌體是一類細菌病毒（Bacteriophage）。）。一、噬菌體的一般特性一、噬菌體的一般特性結構：結構： 蛋白質外殼內包裹蛋白質外殼內包裹著著DNA（雙鏈、單（雙鏈、單鏈、線性、環(huán)狀鏈、線性、環(huán)狀等）。等）。HXY基因工程的載體和工具酶84HXY基因工程的載體和

29、工具酶85single linear DNA (about 182,000 bp)T2 Genomic DNAHXY基因工程的載體和工具酶86HXY基因工程的載體和工具酶87噬菌體的一般生物特性 可脫離寄主細胞生存，但不能進行復制。可脫離寄主細胞生存，但不能進行復制。 除了對寄主的依賴性，還具備其它的功能：除了對寄主的依賴性，還具備其它的功能： 1 1、保護自己的核苷酸分子（、保護自己的核苷酸分子（DNADNA、RNARNA）免遭）免遭環(huán)境化學物質的破壞；環(huán)境化學物質的破壞； 2 2、將其核苷酸分子注入到被感染的細菌細胞；、將其核苷酸分子注入到被感染的細菌細胞； 3 3、將被感染的細菌細胞轉變

30、成制造噬菌體的、將被感染的細菌細胞轉變成制造噬菌體的體系，從而長生出大量的子代噬菌體顆粒；體系，從而長生出大量的子代噬菌體顆粒； 4 4、使感染的細菌細胞釋放出子代的噬菌體顆、使感染的細菌細胞釋放出子代的噬菌體顆粒粒HXY基因工程的載體和工具酶88 噬菌體的結構和其核酸類型噬菌體的結構和其核酸類型： 結構：結構：無尾部結構的二十面體型、無尾部結構的二十面體型、 具尾部結構的二十面體型、具尾部結構的二十面體型、 線狀體型線狀體型 核酸類型：最常見的是雙鏈線性核酸類型：最常見的是雙鏈線性DNADNA、 雙鏈環(huán)形雙鏈環(huán)形DNADNA、 單鏈環(huán)形單鏈環(huán)形DNADNA、 單鏈線形單鏈線形DNADNA、

31、單鏈單鏈RNARNA。HXY基因工程的載體和工具酶89分為兩種：分為兩種：1. 溶菌周期：溶菌周期：二、噬菌體的生活周期二、噬菌體的生活周期感染細菌后立即在菌體內復制和合成蛋感染細菌后立即在菌體內復制和合成蛋白質外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并白質外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并導致細菌細胞解體，釋放出大量子代噬導致細菌細胞解體，釋放出大量子代噬菌體。菌體。烈性噬菌體（烈性噬菌體（virulent phage)HXY基因工程的載體和工具酶90HXY基因工程的載體和工具酶91HXY基因工程的載體和工具酶922. 溶原周期：溶原周期：感染細菌后，將自己的感染細菌后，將自己的DNA整合到細菌整合到細菌的

32、染色體的染色體DNA中。形成這一過程稱為溶中。形成這一過程稱為溶源化（源化（lysogenization)。整合到細菌染色體的整合到細菌染色體的噬菌體噬菌體DNA稱為稱為原原噬菌體噬菌體，隨細菌的染色體復制而復制。，隨細菌的染色體復制而復制。溫和噬菌體（溫和噬菌體（temperate phage)原噬菌體（原噬菌體（prophage)：HXY基因工程的載體和工具酶93溫和噬菌體：既能進入溶菌生命周期又能進入溶 源生命周期。溶源性細菌：具有一種完整的噬菌體基因組的細菌溶源化： 用溫和噬菌體感染細菌培養(yǎng)物使之形成溶 源性細菌的過程整合： 噬菌體的DNA是被包容在寄主細胞染色體 DNA中原噬菌體：在

33、溶源細菌內存在的整合的或非整合的 噬菌體超感染免疫性：溶源性細菌不能夠被頭一次感染并 使之溶源化的同種噬菌體再感染HXY基因工程的載體和工具酶94HXY基因工程的載體和工具酶95溶源周期的主要特征：溶源周期的主要特征：噬菌體噬菌體特征：特征： 1 1、噬菌體的、噬菌體的DNADNA分子注入細菌細胞分子注入細菌細胞 2 2、經過短暫的轉錄之后，需要合成一種整合酶，、經過短暫的轉錄之后，需要合成一種整合酶，于是轉錄活性便被一種阻遏物所關閉于是轉錄活性便被一種阻遏物所關閉 3 3、噬菌體的、噬菌體的DNADNA分子插入到細菌染色體基因組分子插入到細菌染色體基因組DNADNA上，變成原噬菌體上，變成原

34、噬菌體 4 4、細菌繼續(xù)生長、增殖，噬菌體的基因作為細菌、細菌繼續(xù)生長、增殖，噬菌體的基因作為細菌染色體的一部分進行復制。染色體的一部分進行復制。HXY基因工程的載體和工具酶96三、單鏈噬菌體載體三、單鏈噬菌體載體單鏈環(huán)狀單鏈環(huán)狀DNA的絲狀大腸桿菌噬菌體：的絲狀大腸桿菌噬菌體：HXY基因工程的載體和工具酶97（2）復制型（）復制型（RF）是雙鏈環(huán)狀）是雙鏈環(huán)狀DNA。1. 單鏈單鏈DNA噬菌體的特點噬菌體的特點（3）RF DNA和和ssDNA都能轉染感受態(tài)都能轉染感受態(tài) 大腸桿菌。并產生噬菌斑。大腸桿菌。并產生噬菌斑。（5）可產生大量的含有外源）可產生大量的含有外源DNA插入片插入片 斷的斷

35、的單鏈分子單鏈分子，便于作探針或測序。，便于作探針或測序。（1）+DNA。（。（ssDNA）（4）不存在包裝限制。）不存在包裝限制。HXY基因工程的載體和工具酶98RF dsDNA在寄主細胞內以高拷貝形式在寄主細胞內以高拷貝形式存在。存在。成熟的噬菌體里只包裝有成熟的噬菌體里只包裝有 + DNA，也，也容易提取。容易提取。M13噬菌體只感染噬菌體只感染雄性雄性大腸桿菌。大腸桿菌。 但但M13 DNA可以轉染雌性大腸桿菌?？梢赞D染雌性大腸桿菌。6407 bp。（2）DNA長度長度（3）DNA提純提純（1）寄主）寄主HXY基因工程的載體和工具酶99HXY基因工程的載體和工具酶100（4）M13的生

36、活周期的生活周期雖然不導致溶菌，但使菌斑混濁（細菌生雖然不導致溶菌，但使菌斑混濁（細菌生長變慢，約為正常的長變慢，約為正常的1/21/23/43/4）M13通過雄性細菌的通過雄性細菌的F性須性須注入其注入其+DNA+DNA合成合成DNA，形成，形成RF dsDNADNA轉錄轉錄mRNA、合成、合成+DNA、翻譯形、翻譯形成噬菌體蛋白成噬菌體蛋白組裝成新的噬菌體組裝成新的噬菌體M13，擠出寄主細胞擠出寄主細胞HXY基因工程的載體和工具酶101+DNA-DNAmRNAM13外殼蛋白外殼蛋白組裝成子代組裝成子代M13+DNA注入大腸桿菌注入大腸桿菌復制復制轉錄轉錄翻譯翻譯+DNA指導合成指導合成+D

37、NA200個個 RF DNA每個細胞可以放出約每個細胞可以放出約10001000個個M13M13顆粒！顆粒！HXY基因工程的載體和工具酶1023. M13載體的構建：載體的構建：M13基因組中只有基因基因組中只有基因II與基因與基因IV之間之間存在一段存在一段507bp的基因間隔區(qū)。的基因間隔區(qū)。（1）克隆區(qū)域的選定）克隆區(qū)域的選定 基因間隔區(qū)（基因間隔區(qū)（inter genic region, IG區(qū)）區(qū)）IG區(qū)內只有一個區(qū)內只有一個 BsuI 切點。切點。其余其余9個個BsuI限制性位點分布在其它部位。限制性位點分布在其它部位。 酶切位點酶切位點HXY基因工程的載體和工具酶103M13J.

38、 Messing證明，證明，IG區(qū)存在區(qū)存在M13的的復制起復制起點點，但可以插入外源，但可以插入外源DNA而不影響而不影響M13噬菌體的活力。噬菌體的活力。HXY基因工程的載體和工具酶104在在IG區(qū)內插入一個大腸桿菌的區(qū)內插入一個大腸桿菌的LacZ（ -肽序列肽序列)。 利用利用 -肽序列中的三個單一酶切位肽序列中的三個單一酶切位點（點（Bgl II、Ava II 和和 Pvu I）。）。（2）加入酶切位點）加入酶切位點 在在IG區(qū)內加入單一內切酶位點區(qū)內加入單一內切酶位點第一個第一個M13載體：載體：M13mp1：HXY基因工程的載體和工具酶105M13 RFBsuI不完全消化不完全消化

39、各種長度的線性片斷各種長度的線性片斷（其中應有只在（其中應有只在IGIG上切開的線性上切開的線性全長全長M13M13）E.coli lac基因的基因的HindII片斷片斷(lacI、lacP、lacO、lacZ）連接連接M13mp1JM101宿主宿主只有在只有在IG區(qū)插入區(qū)插入lacZ才能存活并才能存活并在在Xgal上出現互補的藍噬菌斑上出現互補的藍噬菌斑HXY基因工程的載體和工具酶106（3）M13載體系列載體系列加上常用的酶切位點。加上常用的酶切位點。 M13載體系列的命名載體系列的命名M13mpn n代表系列數字代表系列數字 對對M13mp1的改進的改進B. Gronenborn和和J.

40、 Messing1978年把年把LacZ 5端的第端的第13個核苷酸個核苷酸G突變成突變成A，產生了一個產生了一個EcoR I切點。切點。M13mp2：HXY基因工程的載體和工具酶1075ATGACCATGATTACGGATTCA-Me用用N-甲基甲基-N-亞硝基脲亞硝基脲 把把G甲基化甲基化 5ATGACCATGATTACGGATTCA-轉染轉染E.coli。mG與與T配對，復制兩次后配對，復制兩次后 5ATGACCATGATTACGAATTCA-EcoRI切點切點用用EcoRI切切M13mp1M13mp2選擇能切開的選擇能切開的 線性分子線性分子再環(huán)化再環(huán)化M13mp1HXY基因工程的載體

41、和工具酶108 對對M13mp2的進一步改進的進一步改進在在M13mp2的的LacZ的的5端加上一段人工端加上一段人工合成的多克隆位點（合成的多克隆位點（MCS）。）。M13mp7、M13mp8、M13mp9、M13mp10、M13mp11、M13mp18、M13mp19對應有相同對應有相同MCS的的pUC系列載體：系列載體：pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19成為成為M13mp系列載體：系列載體：HXY基因工程的載體和工具酶109HXY基因工程的載體和工具酶110與與pUC18相同相同HXY基因工程的載體和工具酶111（1）有）有MCS，便于克隆不同的

42、酶切片段，便于克隆不同的酶切片段（2） Xgal顯色反應，可供直接選擇顯色反應，可供直接選擇（3）無包裝限制，克隆能力大）無包裝限制，克隆能力大（4）可以克隆雙鏈）可以克隆雙鏈DNA分子中的每一條鏈分子中的每一條鏈子代子代M13噬菌體中包含的是單連噬菌體中包含的是單連+DNA。HXY基因工程的載體和工具酶112MCS+-+-+-編碼鏈編碼鏈非編碼鏈非編碼鏈外源外源DNA不同的酶切不同的酶切不同的酶切不同的酶切插入插入M13 vectorHXY基因工程的載體和工具酶113M13 RF+-+-+-外源外源DNA轉染轉染E. coli成熟的子代成熟的子代M13中中+HXY基因工程的載體和工具酶114

43、Phage M13 replication in the host cell:+RNA polDNA polIIIRFNicked by gene 2 protein+ss-Rolling circle replication, then cut and ligateCoated with gene 5 protein Gene 5 protein is replaced by gene 8 protein ect. Linear M13 phage released from the cell.HXY基因工程的載體和工具酶115 插入外源插入外源DNA后，遺傳穩(wěn)定性顯著下降后，遺傳穩(wěn)定性顯著

44、下降 實際克隆能力小于實際克隆能力小于1500bp1500bp。雖無包裝限制，雖無包裝限制，并非無限包裝！并非無限包裝！5. M13載體的缺點載體的缺點HXY基因工程的載體和工具酶116由由質粒載體質粒載體與與單鏈噬菌體載體單鏈噬菌體載體的復制起點的復制起點結合而成的新型載體系列。結合而成的新型載體系列。MCS噬菌體噬菌體ori質粒質粒oriAmprlacZ lacIHXY基因工程的載體和工具酶117約約3000bp（比（比M13?。┬。┛寺∧芰Υ罂寺∧芰Υ竽懿迦肽懿迦?0kb的外源的外源DNA。兩種復制形式兩種復制形式分子量小分子量?。?）噬菌粒載體的特點）噬菌粒載體的特點既具有質粒的復制起

45、點，又具有噬菌體既具有質粒的復制起點，又具有噬菌體的復制起點。的復制起點。既能在大腸桿菌中以質粒的形式雙鏈復制，既能在大腸桿菌中以質粒的形式雙鏈復制，又能在噬菌體內進行單鏈復制。又能在噬菌體內進行單鏈復制。HXY基因工程的載體和工具酶118（2）常見的噬菌粒載體）常見的噬菌粒載體噬菌粒載噬菌粒載體體質粒部分質粒部分單鏈噬菌單鏈噬菌體部分體部分輔助噬菌輔助噬菌體體大腸桿菌大腸桿菌寄主寄主pEMBL8pUC8f1IR171/18pRSA101 VXM13M13變異變異株株XS127，XS101pUC118/pUC119pUC18/ pUC19M13M13K07MV1184pBSpUCf1M13K0

46、7XL1-Blue輔助噬菌體用來復制和包裝噬菌粒載體。輔助噬菌體用來復制和包裝噬菌粒載體。HXY基因工程的載體和工具酶119（3）pUC118/pUC119 構成構成1）M13的基因間隔區(qū)（的基因間隔區(qū)（IG）2）pUC18/pUC19質粒載體：質粒載體：帶有帶有M13復制起點。復制起點。質粒復制起點質粒復制起點 Ampr lacZ MCSHXY基因工程的載體和工具酶120MCSpUC18/pUC19 oriAmprlacZ lacIM13 ori3.2kbpUC118/119HXY基因工程的載體和工具酶121 pUC118/119的復制模式的復制模式兩種不同的復制模式兩種不同的復制模式1）雙

47、鏈質粒復制模式）雙鏈質粒復制模式受受pUC本身的復制起點（來源于本身的復制起點（來源于ColE1）的控制。）的控制。每個細胞能達到每個細胞能達到500500個拷貝。個拷貝。HXY基因工程的載體和工具酶122來源于來源于M13的復制起點被的復制起點被輔助噬菌體輔助噬菌體的基因的基因II產物控制。產物控制。2）單鏈滾環(huán)噬菌體復制模式）單鏈滾環(huán)噬菌體復制模式外殼蛋白外殼蛋白復制蛋白復制蛋白輔助輔助M13包裝包裝當寄主細胞被當寄主細胞被輔助噬菌體輔助噬菌體M13感染后。感染后。HXY基因工程的載體和工具酶123 噬菌粒載體的包裝噬菌粒載體的包裝1）輔助噬菌體：）輔助噬菌體：自身的自身的復制起點發(fā)生了突

48、變復制起點發(fā)生了突變，復制效率，復制效率低下，但感染細菌后能表達出低下，但感染細菌后能表達出外殼蛋白外殼蛋白和復制蛋白和復制蛋白，幫助噬菌粒載體復制。，幫助噬菌粒載體復制。如如M13K07等。等。2）包裝：）包裝：輔助噬菌體輔助噬菌體外殼蛋白和外殼蛋白和 復制蛋白復制蛋白噬菌粒載體噬菌粒載體ssDNA噬菌體噬菌體HXY基因工程的載體和工具酶124（4）pBluescript 噬菌粒載體（噬菌粒載體（pBS）Stratagene公司發(fā)展的一類噬菌粒載體。公司發(fā)展的一類噬菌粒載體。由由pUC質粒載體、質粒載體、f1噬菌體的復制起點和噬菌體的復制起點和T3、T7噬菌體的啟動子噬菌體的啟動子組成。組成

49、。 特點特點 組成組成MCS兩側分別加上兩側分別加上T3和和T7噬菌體的噬菌體的啟動子。加入適當的噬菌體啟動子。加入適當的噬菌體RNA聚聚合酶，就可以定向體外轉錄。合酶，就可以定向體外轉錄。1）定向體外轉錄）定向體外轉錄HXY基因工程的載體和工具酶1252）兩種復制模式）兩種復制模式既能以質粒的形式復制，又能以噬既能以質粒的形式復制，又能以噬菌體的形式復制包裝。菌體的形式復制包裝。3）選擇方便）選擇方便有有Ampr和和lacZ，可以進行，可以進行Amp抗性抗性選擇和選擇和Xgal-IPTG藍白斑選擇。藍白斑選擇。4）插入方便）插入方便18個單一酶切位點的個單一酶切位點的MCSHXY基因工程的載

50、體和工具酶126SK：表示：表示lacZ的的轉錄方向轉錄方向是沿是沿MCS上的上的 SacI KpnI +（f1+）：單鏈）：單鏈復制起始方向復制起始方向背離背離 lacZ，能回收能回收lacZ 的編碼鏈（的編碼鏈（+）pBluescript SK（+/-）/pBluescript KS（+/-）KS：反向（：反向（ KpnI SacI ，MCS相反）相反）-（f1-）：能回收）：能回收lacZ的非編碼鏈（的非編碼鏈（-）1）pBluescript SK/KS（+/-）區(qū)分：）區(qū)分： 常用的常用的 pBluescript 載體載體HXY基因工程的載體和工具酶127pBS SK+HXY基因工程的

51、載體和工具酶128pBS KS-HXY基因工程的載體和工具酶129HXY基因工程的載體和工具酶130HXY基因工程的載體和工具酶131（5）PCR產物克隆載體產物克隆載體 T 載體載體pCR系列載體系列載體Invitrogen公司開發(fā)的公司開發(fā)的線性線性噬菌粒載體。噬菌粒載體。 結構結構pUC的質粒部分、的質粒部分、fi噬菌體噬菌體ori、Kanr和和Ampr抗性?？剐浴CS的中部已經切開，各有一個的中部已經切開，各有一個3端突出的端突出的T。 特點特點PCR產物往往在產物往往在3端突出一個端突出一個A，所，所以能與這個載體直接連接。以能與這個載體直接連接。HXY基因工程的載體和工具酶132

52、HXY基因工程的載體和工具酶133克隆的克隆的PCR產物能被兩側的產物能被兩側的EcoRI切下來回收。切下來回收。HXY基因工程的載體和工具酶134HXY基因工程的載體和工具酶135HXY基因工程的載體和工具酶136pGEM-T vectorHXY基因工程的載體和工具酶137G418抗性抗性可在真核生物表達可在真核生物表達外顯子捕捉外顯子捕捉HXY基因工程的載體和工具酶138AATTT vectorPCR productT4 DNA ligaseAAHXY基因工程的載體和工具酶139Phage display vector）（1）噬菌體展示（）噬菌體展示（Phage display）將外源蛋白

53、（多肽、酶、抗體、將外源蛋白（多肽、酶、抗體、DNA結結合蛋白）結合到噬菌體的外殼蛋白上形合蛋白）結合到噬菌體的外殼蛋白上形成融合蛋白，表達于成融合蛋白，表達于噬菌體的外表面噬菌體的外表面。G. P. Smith1985年發(fā)明。年發(fā)明。絲狀噬菌體（絲狀噬菌體（M13、f1等）外殼顆粒的等）外殼顆粒的一端，有一端，有3-5個基因個基因編碼的蛋白質編碼的蛋白質（g3p），在識別和吸附大腸桿菌的過），在識別和吸附大腸桿菌的過程中起作用。程中起作用。HXY基因工程的載體和工具酶140M13HXY基因工程的載體和工具酶141（2）噬菌體展示載體的構建）噬菌體展示載體的構建把外源把外源DNA片斷插入基因片

54、斷插入基因的序列的序列前端前端，并保持兩者的閱讀框正確，表達出融合并保持兩者的閱讀框正確，表達出融合蛋白。蛋白。啟動子啟動子外源外源DNAM13基因基因oriM13 display vector外源外源多肽多肽HXY基因工程的載體和工具酶142四、雙鏈噬菌體載體四、雙鏈噬菌體載體 載體載體（1）長度為）長度為48502 bp； （2）雙鏈線性）雙鏈線性DNA； （3）但在兩端有）但在兩端有cos位點，可以環(huán)化。位點，可以環(huán)化。 DNA兩端各有兩端各有12bp的粘性末端，粘性末的粘性末端，粘性末端形成的雙鏈區(qū)域稱為端形成的雙鏈區(qū)域稱為cos位點。位點。1. DNA分子的特點分子的特點 cos位點

55、（位點（cohensive-end site）：）：HXY基因工程的載體和工具酶143 phage48.5 kb in lengthLinear or circular genome (cos ends) 溶菌階段溶菌階段 ( (復制和釋放復制和釋放) ) 溶源階段溶源階段 ( (整合到寄主染色體上整合到寄主染色體上) )HXY基因工程的載體和工具酶144 DNA進入細菌體內后，可形成雙鏈環(huán)狀進入細菌體內后，可形成雙鏈環(huán)狀DNA復制型（復制型（RF DNA）。）。HXY基因工程的載體和工具酶145HXY基因工程的載體和工具酶146DNA上有至少上有至少61個基因，有一半是必須的，個基因，有一半

56、是必須的，與自身的活動有關，成簇排列。與自身的活動有關，成簇排列。 其他約其他約1/3是是非必須基因（非必須基因（位于尾部合成至阻位于尾部合成至阻遏之間的區(qū)段）。遏之間的區(qū)段）。2. 噬菌體的基因組特點噬菌體的基因組特點 HXY基因工程的載體和工具酶147A W B C D E F Z U V G H M L K I J b2 cI cro cII O P Q S R att int xis gam red cIII NCOS COS 頭部基因頭部基因 尾部基因尾部基因 功能不明區(qū)功能不明區(qū) 溶源化溶源化 重組重組 早期控制早期控制 阻遏阻遏 DNADNA合成合成 溶菌溶菌生長非必須區(qū)段生長非

57、必須區(qū)段cI cI基因：溶源過程控制基因?；颍喝茉催^程控制基因。噬菌體的基因組結構噬菌體的基因組結構HXY基因工程的載體和工具酶148DNAProtein coatcoscosNonessential regionLong (left)armshort (right)armExogenous DNA(20-23 kb) phage12bpHXY基因工程的載體和工具酶149 HXY基因工程的載體和工具酶150HXY基因工程的載體和工具酶151 噬菌體感染細菌的早期：雙鏈進行噬菌體感染細菌的早期：雙鏈進行 型復制。型復制。3. DNA的復制的復制 模型模型（1） 型復制型復制HXY基因工程的載體

58、和工具酶152（2）滾環(huán)復制）滾環(huán)復制 感染的晚期：啟動滾環(huán)復制機制。感染的晚期：啟動滾環(huán)復制機制。形成多聯(lián)體形成多聯(lián)體 DAN分子。分子。HXY基因工程的載體和工具酶153這種多聯(lián)體分子必須在這種多聯(lián)體分子必須在cos位點被切斷位點被切斷成單體分子才能被包裝起來。成單體分子才能被包裝起來。HXY基因工程的載體和工具酶154（1）構建原理：）構建原理：4. 噬菌體載體的構建噬菌體載體的構建（2）構建過程）構建過程在這個非必須區(qū)內制造限制酶切點在這個非必須區(qū)內制造限制酶切點 引進某些突變表型，作為選擇標記引進某些突變表型，作為選擇標記 突變某些基因，使它成為安全載體突變某些基因，使它成為安全載體

59、 刪除刪除 DNA必須區(qū)段上常用的限制酶切點必須區(qū)段上常用的限制酶切點 噬菌體噬菌體DNA上本身有上本身有5個個 EcoR I 和和7 個個Hind III切點！切點！刪除刪除 噬菌體的非必需區(qū)，留出插入空間。噬菌體的非必需區(qū)，留出插入空間。HXY基因工程的載體和工具酶155（3）人工構建的人工構建的 噬菌體載體有兩種類型：噬菌體載體有兩種類型： 插入型載體（插入型載體（insertion vectors)：如如 gt10、 gt11、 BV2、 NM540、 NM1590、 NM6071）免疫功能失活型：）免疫功能失活型：插入位點位于載體合成活性插入位點位于載體合成活性阻遏物區(qū)阻遏物區(qū)域域（

60、cI基因）內?；颍﹥?。EcoR IcI gt10HXY基因工程的載體和工具酶156插入導致載體不能合成阻遏物，插入導致載體不能合成阻遏物， 載體載體DNA不能進入溶源期，受體菌全部裂解，形成不能進入溶源期，受體菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。清晰的噬菌斑。 沒有外源沒有外源DNA插入的插入的 載體感染受體菌形成載體感染受體菌形成混濁噬菌斑混濁噬菌斑。如如 NM1149載體的兩個克隆位點（載體的兩個克隆位點（EcoR I 和和Hind III）都是位于）都是位于cI基因內部?；騼炔俊XY基因工程的載體和工具酶1572） -半乳糖苷酶失活型載體：半乳糖苷酶失活型載體：在在 基因組中引入了基因組