第六章外源目的基因表達(dá)與調(diào)控2

1、第四節(jié)第四節(jié) 目的基因表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)目的基因表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)與分離純化與分離純化一、外源目的基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)一、外源目的基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè) 外源目的基因的表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)階外源目的基因的表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)階段。外源基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)過程就是對(duì)特異段。外源基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)過程就是對(duì)特異性性mrna或蛋白質(zhì)的檢測(cè)。或蛋白質(zhì)的檢測(cè)。 特異性特異性mrna的檢測(cè)的檢測(cè): northern雜交雜交 特異性蛋白質(zhì)的檢測(cè)特異性蛋白質(zhì)的檢測(cè): elisa, western雜交雜交1.northern 印跡雜交印跡雜交(northern blot) 檢測(cè)檢測(cè)rna（主要是（主要是mrna）的方法）的方法

2、 與與southern雜交的區(qū)別雜交的區(qū)別 靶核酸：rna rna電泳: 在變性條件下進(jìn)行,以去除rna中的二級(jí)結(jié)構(gòu),保證rna完全按分子大小分離。 變性電泳主要有3種:乙二醛變性電泳、甲醛變性電泳和羥甲基汞變性電泳。 轉(zhuǎn)膜：不需變性2.elisa2.elisa 1971年瑞典學(xué)者年瑞典學(xué)者 engvall 和和perlmann，荷蘭學(xué)者荷蘭學(xué)者van weeman和和 schuurs分別報(bào)道分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法，稱為酶聯(lián)免疫吸附實(shí)固相免疫測(cè)定方法，稱為酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（驗(yàn)（enzyme-linked immunoso

3、rbent assay, elisa）。）。 elisa原理原理 使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性其免疫活性 使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性酶的活性 結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本

4、中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)的量直接相關(guān) elisa原理圖原理圖 固相的抗原或抗體（固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）免疫吸附劑） 酶標(biāo)記的抗原或抗體（酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）標(biāo)記物）酶作用的底物（酶作用的底物（顯色劑）顯色劑）elisa可以分為直接法、間接法和夾心法等幾種。可以分為直接法、間接法和夾心法等幾種。直接法： 直接法是指酶標(biāo)抗原或抗體直接與包被在酶標(biāo)板上的抗體或抗原直接法是指酶標(biāo)抗原或抗體直接與包被在酶標(biāo)板上的抗體或抗原結(jié)合形成酶標(biāo)抗原結(jié)合形成酶標(biāo)抗原抗體復(fù)合物，加入酶反應(yīng)底物，測(cè)定產(chǎn)物的吸抗體復(fù)合物，加入酶反應(yīng)底物，測(cè)定產(chǎn)物的吸光值，計(jì)算出包被在酶標(biāo)上的抗體或抗原的量。見圖光值，計(jì)算出

5、包被在酶標(biāo)上的抗體或抗原的量。見圖a間接法： 是將酶標(biāo)記在二抗上，當(dāng)抗體（一抗）和包被在酶標(biāo)板的抗原結(jié)是將酶標(biāo)記在二抗上，當(dāng)抗體（一抗）和包被在酶標(biāo)板的抗原結(jié)合形成復(fù)合物后，再以酶標(biāo)二抗和復(fù)合物結(jié)合，通過測(cè)定酶反應(yīng)產(chǎn)合形成復(fù)合物后，再以酶標(biāo)二抗和復(fù)合物結(jié)合，通過測(cè)定酶反應(yīng)產(chǎn)物的顏色可以（間接）反應(yīng)一抗和抗原的結(jié)合情況，進(jìn)而計(jì)算出抗物的顏色可以（間接）反應(yīng)一抗和抗原的結(jié)合情況，進(jìn)而計(jì)算出抗原或抗體的量。見圖原或抗體的量。見圖b夾心法： 是先將未標(biāo)記的抗體包被在酶標(biāo)板上，用于捕獲抗原，再用酶標(biāo)是先將未標(biāo)記的抗體包被在酶標(biāo)板上，用于捕獲抗原，再用酶標(biāo)的抗體與抗原反應(yīng)形成抗體的抗體與抗原反應(yīng)形成抗體-

6、抗原抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物；也可以象間接酶標(biāo)抗體復(fù)合物；也可以象間接法一樣應(yīng)用酶標(biāo)二抗和抗體法一樣應(yīng)用酶標(biāo)二抗和抗體-抗原抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合，形成抗體抗體復(fù)合物結(jié)合，形成抗體-抗原抗原-抗體抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物，見圖酶標(biāo)二抗復(fù)合物，見圖c。前者稱為直接夾心法，后者稱為。前者稱為直接夾心法，后者稱為間接夾心法。間接夾心法。elisa基本的實(shí)驗(yàn)過程基本的實(shí)驗(yàn)過程 包被：將已知抗原或抗體通過物理吸附到固相載包被：將已知抗原或抗體通過物理吸附到固相載體表面，使抗原或抗體固相化體表面，使抗原或抗體固相化 抗原抗體反應(yīng)：先后加入被檢標(biāo)本和酶結(jié)合物，抗原抗體反應(yīng)：先后加入被檢標(biāo)本和酶結(jié)合物，使之與固相抗原或

7、抗體發(fā)生免疫反應(yīng)而被結(jié)合固使之與固相抗原或抗體發(fā)生免疫反應(yīng)而被結(jié)合固定定 酶促反應(yīng)：在反應(yīng)體系中加入酶作用的底物，使酶促反應(yīng)：在反應(yīng)體系中加入酶作用的底物，使發(fā)生酶促反應(yīng)而顯色發(fā)生酶促反應(yīng)而顯色elisa基本的實(shí)驗(yàn)過程基本的實(shí)驗(yàn)過程3. western blot 要檢測(cè)一個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)物是否正確，或者比要檢測(cè)一個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)物是否正確，或者比較表達(dá)產(chǎn)物量的相對(duì)變化，首選方法是較表達(dá)產(chǎn)物量的相對(duì)變化，首選方法是western blot。 western blot 是生物學(xué)、生物化學(xué)、分子生物是生物學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。 we

8、stern blot整個(gè)過程主要包括：整個(gè)過程主要包括：page電泳、電泳、轉(zhuǎn)膜及蛋白檢測(cè)轉(zhuǎn)膜及蛋白檢測(cè)3個(gè)階段。個(gè)階段。聚丙烯酰胺凝膠的組成及特點(diǎn)聚丙烯酰胺凝膠的組成及特點(diǎn) 組成：組成：主要由丙烯酰胺丙烯酰胺(acr)和交聯(lián)劑n,n-甲叉甲叉(亞甲基亞甲基) 雙丙烯酰胺雙丙烯酰胺(bis)聚合而成。 聚合：聚合：?jiǎn)为?dú)或混合時(shí)穩(wěn)定，出現(xiàn)自由基團(tuán)時(shí)會(huì)聚合。 化學(xué)法的引發(fā)劑：過硫酸銨過硫酸銨（aps or ap)， 催化劑：四甲基乙二胺四甲基乙二胺（temed) 特點(diǎn)：特點(diǎn)：凝膠濃度越大，交聯(lián)度越大，凝膠孔徑越小。 故根據(jù)分離蛋白質(zhì)的大小選擇不同濃度的凝膠。聚丙烯酰胺凝膠電泳（page）的原理 聚

9、丙烯酰胺凝膠的特點(diǎn)聚丙烯酰胺凝膠的特點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：聚丙烯酰胺凝膠電泳具有機(jī)械強(qiáng)度好、彈性大、 透明、化學(xué)穩(wěn)定性高、無電滲作用、設(shè)備簡(jiǎn)單、 用樣量少(1100g)和分辨率高等優(yōu)點(diǎn)。 用途：用途：蛋白質(zhì)，核酸等物質(zhì)的分離、定性和定量分析。 western blot 基本原理基本原理 經(jīng)過經(jīng)過pagepage分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變?；钚圆蛔?。 以固相載體上的蛋

10、白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)特定蛋白質(zhì)的應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)特定蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。表達(dá)情況。western blot基本原理基本原理 figure 1a. in the direct detection method, labeled primary antibody binds to antigen on the membrane and reacts with substrate, creating a

11、detectable signal. 1b. in the indirect detection method, unlabeled primary antibody binds to the antigen. then, a labeled secondary antibody binds to the primary antibody and reacts with the substrate.a. direct detection b. indirect detectionwestern blot操作的過程操作的過程 蛋白樣品的制備 sds聚丙烯酰胺 凝膠電泳l轉(zhuǎn)膜l封閉l一抗雜交l二抗

12、雜交l底物顯色gel electrophoresistips: separate proteins by gel electrophoresis 1-d gels 2-d gelstransfer(wet tank transfer system and semi-dry transfer system)blocking and detectiontips: one step and two steps二、外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化二、外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化 （一）細(xì)胞收集 1.離心法收集細(xì)胞離心法收集細(xì)胞 2.過濾法收集細(xì)胞過濾法收集細(xì)胞 3.絮凝法收集細(xì)胞絮凝法收集細(xì)胞(二)細(xì)胞破碎

13、對(duì)于非分泌型表達(dá)的細(xì)胞，其表達(dá)產(chǎn)物需要先對(duì)于非分泌型表達(dá)的細(xì)胞，其表達(dá)產(chǎn)物需要先破碎細(xì)胞才可提純。破碎細(xì)胞才可提純。 破碎方法有變性劑裂解法、超聲波破碎法、機(jī)破碎方法有變性劑裂解法、超聲波破碎法、機(jī)械破碎法、酶裂解法。械破碎法、酶裂解法。 變性劑裂解法：變性劑裂解法：sds 超聲波破碎法：將電能通過換能器轉(zhuǎn)換為聲能，這種能超聲波破碎法：將電能通過換能器轉(zhuǎn)換為聲能，這種能量通過液體介質(zhì)量通過液體介質(zhì)(如水如水)而變成一個(gè)個(gè)密集的小氣泡，這些而變成一個(gè)個(gè)密集的小氣泡，這些小氣泡迅速炸裂，產(chǎn)生的象小炸彈一樣的能量，從而起到小氣泡迅速炸裂，產(chǎn)生的象小炸彈一樣的能量，從而起到破碎細(xì)胞等物質(zhì)的作用破碎細(xì)胞等物質(zhì)的作用(俗稱俗稱“空化效應(yīng)空化效應(yīng)”)。 機(jī)械破碎法：液氮凍干細(xì)胞再研磨，高壓勻漿器機(jī)械破碎法：液氮凍干細(xì)胞再研磨，高壓勻漿器細(xì)胞漿細(xì)胞漿液通過止逆閥進(jìn)入泵體內(nèi)，在高壓下迫使其在排出閥的小液通過止逆閥進(jìn)入泵體內(nèi)，在高壓下迫使其在排出閥的小孔中高速?zèng)_出，并射向撞擊環(huán)上，由于突然減壓和高速?zèng)_孔中高速?zèng)_出，并射向撞擊環(huán)上，由于突然減壓和高速?zèng)_擊，使細(xì)胞受到高的液相剪切力而破碎。擊，使細(xì)胞受到高的液相剪切力而破碎。 酶裂解法：