蛋白質(zhì)的表征

1、第一章第一章 蛋白質(zhì)的表征蛋白質(zhì)的表征第一節(jié)第一節(jié) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本概念蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本概念蛋白質(zhì)是一類重要的生物高分子，英文為蛋白質(zhì)是一類重要的生物高分子，英文為“protein，該詞從希臘文，該詞從希臘文轉(zhuǎn)化而來，意思是轉(zhuǎn)化而來，意思是“最原始的最原始的”，可見當時人們對蛋白質(zhì)的認識已有相，可見當時人們對蛋白質(zhì)的認識已有相當當?shù)幕A(chǔ)。的基礎(chǔ)。 蛋白質(zhì)有成千上萬種，不同的蛋白質(zhì)具有不同的生物功能。蛋白質(zhì)是蛋白質(zhì)有成千上萬種，不同的蛋白質(zhì)具有不同的生物功能。蛋白質(zhì)是20種種氨基酸通過酰胺鍵氨基酸通過酰胺鍵(肽鍵肽鍵)聯(lián)成的長鏈分子，這種長鏈即所謂的聯(lián)成的長鏈分子，這種長鏈即所謂的肽鏈。許多蛋白

2、質(zhì)還包含有非肽鏈結(jié)構(gòu)的其他組成成分，這種成分稱為肽鏈。許多蛋白質(zhì)還包含有非肽鏈結(jié)構(gòu)的其他組成成分，這種成分稱為配基或輔基。配基或輔基。 作為蛋白質(zhì)組成成分的氨基酸一共有作為蛋白質(zhì)組成成分的氨基酸一共有20種，它們的名稱和結(jié)構(gòu)列在表種，它們的名稱和結(jié)構(gòu)列在表1.1中。為了表達蛋白質(zhì)和肽結(jié)構(gòu)的需要，每個氨基酸都有相應(yīng)的符號表中。為了表達蛋白質(zhì)和肽結(jié)構(gòu)的需要，每個氨基酸都有相應(yīng)的符號表示，常用符號通常由氨基酸英文名的三個字母組成。一個蛋白質(zhì)由上百示，常用符號通常由氨基酸英文名的三個字母組成。一個蛋白質(zhì)由上百個甚至上千個氨基酸組成，為了表達的方便，又設(shè)計出單字符號。個甚至上千個氨基酸組成，為了表達的方

3、便，又設(shè)計出單字符號。 除了列出的除了列出的20種基本氨基酸外，實際上種基本氨基酸外，實際上還有幾百種不常見的氨基酸參與某些蛋白質(zhì)還有幾百種不常見的氨基酸參與某些蛋白質(zhì)的組分，可稱為稀有氨基酸；另一些氨基酸的組分，可稱為稀有氨基酸；另一些氨基酸出現(xiàn)頻率要高些，如羥脯氨酸、甲基組氨出現(xiàn)頻率要高些，如羥脯氨酸、甲基組氨酸和甲基賴氨酸、丁酸和甲基賴氨酸、丁羧基谷氨酸等，但它羧基谷氨酸等，但它們是在蛋白質(zhì)生物合成后轉(zhuǎn)變而來的，因此們是在蛋白質(zhì)生物合成后轉(zhuǎn)變而來的，因此不計入基本氨基酸之列。不計入基本氨基酸之列。 這是一個鏈狀的結(jié)構(gòu)，經(jīng)水解后，將肽鍵斷裂，轉(zhuǎn)變成一系列的氨基酸。鏈中相當于氨基酸的單元結(jié)構(gòu)

4、稱為殘基。而上述鏈稱為肽鏈。肽鏈的氨基一端稱為n端或氨基端，羧基一端稱為c端或羧基端。習(xí)慣上將n端列在左邊，c端列在右邊。 從氨基酸的結(jié)構(gòu)看，半胱氨酸的側(cè)鏈上有巰基(一sh)。巰基的穩(wěn)定性較差，在堿性ph下易氧化成二硫鍵。如果一條肽鏈上的兩個半胱氨酸的巰基形成二硫鍵，肽鏈形成鏈內(nèi)二硫鍵。假如兩條肽鏈間形成二硫鍵，就出現(xiàn)由兩條肽鏈組成的蛋白質(zhì)(如胰島素)。蛋白質(zhì)分子有兩對以上的二硫鍵，或者是蛋白質(zhì)分子有一對二硫鍵和一個半胱氨酸，二硫鍵可能有不同的連接方式，于是出現(xiàn)了異構(gòu)體。異構(gòu)體的數(shù)目因半胱氨酸含量不同而異，但是在天然的蛋白質(zhì)分子中沒有這種異構(gòu)體，只有一種連接方式。而在重組蛋白質(zhì)的復(fù)性中，可能出

5、現(xiàn)二硫鍵的錯配對。 一級結(jié)構(gòu)是指肽鏈中的氨基酸排列序列，二硫鍵的定位也是一級結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)是指肽鏈中的氨基酸排列序列，二硫鍵的定位也是一級結(jié)構(gòu)的重要內(nèi)容。的重要內(nèi)容。 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)也可稱為構(gòu)象單元，因為它們是蛋白質(zhì)復(fù)雜的空間蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)也可稱為構(gòu)象單元，因為它們是蛋白質(zhì)復(fù)雜的空間構(gòu)象的基礎(chǔ)。一些構(gòu)象單元的結(jié)構(gòu)不是不可改變的，構(gòu)象的基礎(chǔ)。一些構(gòu)象單元的結(jié)構(gòu)不是不可改變的，ph、溫度、溶劑極、溫度、溶劑極性等環(huán)境因素可以影響單元的變化。性等環(huán)境因素可以影響單元的變化。 具有二級結(jié)構(gòu)的肽鏈在空間走向，形成具有空間三級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，具有二級結(jié)構(gòu)的肽鏈在空間走向，形成具有空間三級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，如所

6、謂球蛋白類，它們幾乎都有生物功能和活性，其中有些還能進一步如所謂球蛋白類，它們幾乎都有生物功能和活性，其中有些還能進一步相互作用，形成更高層次的結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)之所以有功能，是因為分子表相互作用，形成更高層次的結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)之所以有功能，是因為分子表面有可以進一步作用的基團，不同的蛋白質(zhì)由于分子表面結(jié)構(gòu)不同，可面有可以進一步作用的基團，不同的蛋白質(zhì)由于分子表面結(jié)構(gòu)不同，可作用的基團分布和組合也不同，這種特定的結(jié)構(gòu)就是各種蛋白質(zhì)具有不作用的基團分布和組合也不同，這種特定的結(jié)構(gòu)就是各種蛋白質(zhì)具有不同的功能和活性的分子基礎(chǔ)。同的功能和活性的分子基礎(chǔ)。 四級結(jié)構(gòu)可以認為是一些特定三級結(jié)構(gòu)的折疊肽鏈通過非共價

7、鍵而形四級結(jié)構(gòu)可以認為是一些特定三級結(jié)構(gòu)的折疊肽鏈通過非共價鍵而形成的大分子體系，也可稱為亞基的裝配成的大分子體系，也可稱為亞基的裝配(assembly)。裝配是一個非常復(fù)。裝配是一個非常復(fù)雜的過程，它能使各亞基間相互調(diào)節(jié)，使蛋白質(zhì)分子的功能更完善。雜的過程，它能使各亞基間相互調(diào)節(jié)，使蛋白質(zhì)分子的功能更完善。 蛋白質(zhì)的分離純化是研究蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)和起點。蛋白質(zhì)的來源是多樣蛋白質(zhì)的分離純化是研究蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)和起點。蛋白質(zhì)的來源是多樣的，主要來自動物、植物的各種組織和微生物，取材要采用含量豐富的的，主要來自動物、植物的各種組織和微生物，取材要采用含量豐富的器官。器官。 抽提蛋白質(zhì)的第一步是將組織粉碎

8、，破壞細胞，以便于抽提出蛋白抽提蛋白質(zhì)的第一步是將組織粉碎，破壞細胞，以便于抽提出蛋白質(zhì)；抽提液的選擇也因蛋白質(zhì)而異。一般用低濃度的緩沖液，有時在從質(zhì)；抽提液的選擇也因蛋白質(zhì)而異。一般用低濃度的緩沖液，有時在從肌肉抽提時也用稀堿，因肌肉中含有乳酸，最后抽提液的肌肉抽提時也用稀堿，因肌肉中含有乳酸，最后抽提液的ph卻是中性卻是中性的。在提取膜蛋白或包含體內(nèi)的蛋白質(zhì)時，還加入的。在提取膜蛋白或包含體內(nèi)的蛋白質(zhì)時，還加入(非離子型非離子型)表面活性表面活性劑或變性劑以增加溶解度。各種細胞中普遍存在各種蛋白水解酶，會導(dǎo)劑或變性劑以增加溶解度。各種細胞中普遍存在各種蛋白水解酶，會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的降解，低溫操

9、作和加一些相應(yīng)蛋白酶抑制劑致蛋白質(zhì)的降解，低溫操作和加一些相應(yīng)蛋白酶抑制劑(如如dfp、pcmb、pmsf等等)、螯合劑、螯合劑(edta等等)是有益的。是有益的。 將蛋白質(zhì)抽提出來后，就要進一步純化。將蛋白質(zhì)抽提出來后，就要進一步純化。純化不外乎兩方面：一是將純化不外乎兩方面：一是將大體積變成小體積；二是把多組分蛋白質(zhì)只留下單一種的蛋白質(zhì)。大體積變成小體積；二是把多組分蛋白質(zhì)只留下單一種的蛋白質(zhì)。前者前者有吸附法、超濾法、凍干等。后者有根據(jù)蛋白質(zhì)的分子形狀和分子質(zhì)量有吸附法、超濾法、凍干等。后者有根據(jù)蛋白質(zhì)的分子形狀和分子質(zhì)量大小、電離性質(zhì)、溶解度和疏水性、生物功能專一性等，常用有各種鹽大小

10、、電離性質(zhì)、溶解度和疏水性、生物功能專一性等，常用有各種鹽析法、超離心沉降、結(jié)晶、電泳、凝膠過濾，離子交換色譜、親和色譜析法、超離心沉降、結(jié)晶、電泳、凝膠過濾，離子交換色譜、親和色譜等。近年來發(fā)展的等。近年來發(fā)展的fplc和和hplc大大促進了許多蛋白質(zhì)在毫克級的純大大促進了許多蛋白質(zhì)在毫克級的純化，其量足夠用于蛋白質(zhì)的化學(xué)研究?；?，其量足夠用于蛋白質(zhì)的化學(xué)研究。第二節(jié)第二節(jié) 蛋白質(zhì)的純度蛋白質(zhì)的純度 蛋白質(zhì)的純度是一個重要的指標，尤其在重組蛋白的質(zhì)量控制中。但它也是蛋白質(zhì)的純度是一個重要的指標，尤其在重組蛋白的質(zhì)量控制中。但它也是一個相對的指標，而純度要求一個相對的指標，而純度要求95、99

11、或或99.9需根據(jù)實際要求而制定。需根據(jù)實際要求而制定。 蛋白質(zhì)的純度一般指是否含有其他雜蛋白，而不包括鹽、緩沖液離子、十二蛋白質(zhì)的純度一般指是否含有其他雜蛋白，而不包括鹽、緩沖液離子、十二烷基硫酸鈉烷基硫酸鈉(sds)等小分子在內(nèi)。一些蛋白質(zhì)在硫酸銨糊中相當穩(wěn)定，一些酶在等小分子在內(nèi)。一些蛋白質(zhì)在硫酸銨糊中相當穩(wěn)定，一些酶在甘油中保存則很穩(wěn)定。甘油中保存則很穩(wěn)定。 蛋白質(zhì)純度如用百分數(shù)表示，有時還和檢測方法、定量方法、所選用儀器的蛋白質(zhì)純度如用百分數(shù)表示，有時還和檢測方法、定量方法、所選用儀器的參數(shù)有關(guān)。例如在參數(shù)有關(guān)。例如在hplc分析蛋白質(zhì)純度時，一般要求以分析蛋白質(zhì)純度時，一般要求以2

12、80nm檢測，這是蛋白檢測，這是蛋白質(zhì)的吸收高峰，而很可能不是非蛋白質(zhì)雜質(zhì)的紫外吸收峰，甚至小分子物質(zhì)在質(zhì)的吸收高峰，而很可能不是非蛋白質(zhì)雜質(zhì)的紫外吸收峰，甚至小分子物質(zhì)在280nm處沒有吸收，因此都以處沒有吸收，因此都以280nm的光吸收來定量處理，檢測不到非蛋白質(zhì)的光吸收來定量處理，檢測不到非蛋白質(zhì)雜質(zhì)和小分子物質(zhì)的存在，表明所得的蛋白質(zhì)純度會偏高。雜質(zhì)和小分子物質(zhì)的存在，表明所得的蛋白質(zhì)純度會偏高。 在色譜中普遍采用積分面積的方法，這也不是很妥當?shù)?。而且在用計算機或在色譜中普遍采用積分面積的方法，這也不是很妥當?shù)?。而且在用計算機或積分儀在線檢出時，儀器的參數(shù)設(shè)置與所得的報告很有關(guān)系，設(shè)置

13、不妥往往導(dǎo)積分儀在線檢出時，儀器的參數(shù)設(shè)置與所得的報告很有關(guān)系，設(shè)置不妥往往導(dǎo)致結(jié)果不夠準確。致結(jié)果不夠準確。 目前常用的鑒定蛋白質(zhì)純度方法有：目前常用的鑒定蛋白質(zhì)純度方法有：聚丙烯酰胺凝膠電泳和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳(sds-page)；毛細管電泳毛細管電泳(ce)；等電聚焦等電聚焦(ief)；高效液相色譜高效液相色譜(hplc)，包括凝膠過濾、各種反相色譜、，包括凝膠過濾、各種反相色譜、離子色譜、疏水色譜等；離子色譜、疏水色譜等；質(zhì)譜質(zhì)譜(ms)。 一些新的有效方法也在引入分析蛋白質(zhì)的純度，如質(zhì)譜一些新的有效方法也在引入分析蛋白

14、質(zhì)的純度，如質(zhì)譜等。由于它測定分子質(zhì)量的精確度可達萬分之一，因此丟失等。由于它測定分子質(zhì)量的精確度可達萬分之一，因此丟失一個氨基酸殘基一個氨基酸殘基(平均分子質(zhì)量約平均分子質(zhì)量約110da)就可以檢出；如有就可以檢出；如有氨基酸的取代形成突變株氨基酸的取代形成突變株(可能分子質(zhì)量有幾十道爾頓的差可能分子質(zhì)量有幾十道爾頓的差異異)，也非常容易被發(fā)現(xiàn)。，也非常容易被發(fā)現(xiàn)。 按照嚴格的要求，用電泳法證明蛋白質(zhì)的純度，按照嚴格的要求，用電泳法證明蛋白質(zhì)的純度，在一種在一種ph下電泳說明該蛋白質(zhì)是純的，這是不夠充下電泳說明該蛋白質(zhì)是純的，這是不夠充分的。應(yīng)該取兩種分的。應(yīng)該取兩種ph緩沖液，它們分布在蛋

15、白質(zhì)等緩沖液，它們分布在蛋白質(zhì)等電點的兩側(cè)，在這兩種電點的兩側(cè)，在這兩種ph下電泳都證明此蛋白質(zhì)是下電泳都證明此蛋白質(zhì)是純的，這樣才可靠。純的，這樣才可靠。 應(yīng)該指出，只用一種方法鑒定蛋白質(zhì)純度是不夠應(yīng)該指出，只用一種方法鑒定蛋白質(zhì)純度是不夠的，至少應(yīng)該用兩種以上的方法，而且是兩種不同的，至少應(yīng)該用兩種以上的方法，而且是兩種不同的分離機理的方法來判斷蛋白質(zhì)純度才比較可靠。的分離機理的方法來判斷蛋白質(zhì)純度才比較可靠。因為常常發(fā)現(xiàn)某一樣品在凝膠過濾中是純的，而在因為常常發(fā)現(xiàn)某一樣品在凝膠過濾中是純的，而在離子色譜中卻分辨為兩個組分，反之亦然。離子色譜中卻分辨為兩個組分，反之亦然。 又如，一種樣品用

16、凝膠過濾法和又如，一種樣品用凝膠過濾法和sdspage電電泳證明是純的，但這仍不充分，因為這兩種方法的泳證明是純的，但這仍不充分，因為這兩種方法的機制是相同的。機制是相同的。第三節(jié)第三節(jié) 蛋白質(zhì)的定量蛋白質(zhì)的定量 測定蛋白質(zhì)的量是研究蛋白質(zhì)的最基本的一步，而對蛋白質(zhì)定量方法測定蛋白質(zhì)的量是研究蛋白質(zhì)的最基本的一步，而對蛋白質(zhì)定量方法的原理、適用范圍、靈敏度和可靠性程度有一些了解是必要的。的原理、適用范圍、靈敏度和可靠性程度有一些了解是必要的。 溶液中蛋白質(zhì)的濃度測定方法很多，最早的經(jīng)典方法是克氏定氮法，溶液中蛋白質(zhì)的濃度測定方法很多，最早的經(jīng)典方法是克氏定氮法，因為每一種蛋白質(zhì)都有其恒定的含氮

17、量因為每一種蛋白質(zhì)都有其恒定的含氮量(1416)。 其方法是將一定量的蛋白質(zhì)用濃硫酸消化分解，使其中的氮變成銨其方法是將一定量的蛋白質(zhì)用濃硫酸消化分解，使其中的氮變成銨鹽，再與濃鹽，再與濃naoh作用，使氨氣放出而被吸收于標準酸液中，用反滴定作用，使氨氣放出而被吸收于標準酸液中，用反滴定法滴定殘余的酸，或用硼酸吸收后，再用標準酸直接滴定，求得該蛋白質(zhì)法滴定殘余的酸，或用硼酸吸收后，再用標準酸直接滴定，求得該蛋白質(zhì)樣品中的含氮量。樣品中的含氮量。 此法雖有普遍性，但操作繁瑣，目前應(yīng)用較少。稍后應(yīng)用較廣泛的方法此法雖有普遍性，但操作繁瑣，目前應(yīng)用較少。稍后應(yīng)用較廣泛的方法是雙縮脲法、福林是雙縮脲法

18、、福林酚法和紫外吸收法，近年來大多數(shù)人用考馬斯亮藍酚法和紫外吸收法，近年來大多數(shù)人用考馬斯亮藍法。法。 選擇哪一種方法，一般考慮的選擇哪一種方法，一般考慮的原則是準確、操作方便、影響因素少原則是準確、操作方便、影響因素少一、光吸收法一、光吸收法 蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)在280nm左右有吸收高峰，這主要是由于蛋白質(zhì)中左右有吸收高峰，這主要是由于蛋白質(zhì)中的芳香族氨基酸的芳香族氨基酸(trp和和tyr)的緣故，因此可以用的緣故，因此可以用280nrn光吸光吸收值來定量溶液中的蛋白質(zhì)。但是每種蛋白質(zhì)中的芳香族氨收值來定量溶液中的蛋白質(zhì)。但是每種蛋白質(zhì)中的芳香族氨基酸含量是不同的，而且有較大的差別。最簡單的方法

19、是采基酸含量是不同的，而且有較大的差別。最簡單的方法是采用用280nm光吸收為光吸收為1時等于時等于lmg/ml來計算。這樣簡單的處來計算。這樣簡單的處理在準確性上有不足之處，但其測定時間短，用量極少，而理在準確性上有不足之處，但其測定時間短，用量極少，而且不消耗樣品，故被廣泛采用。且不消耗樣品，故被廣泛采用。 最準確的方法是用蛋白質(zhì)的摩爾消光系數(shù)計算。在蛋白質(zhì)最準確的方法是用蛋白質(zhì)的摩爾消光系數(shù)計算。在蛋白質(zhì)純化后，將此純的蛋白質(zhì)對水充分透析，然后凍于或在真空純化后，將此純的蛋白質(zhì)對水充分透析，然后凍于或在真空干燥器中干燥，繼而在干燥器中干燥，繼而在105下恒重，精確稱量下恒重，精確稱量11

20、0mg，再定量溶于一定體積中再定量溶于一定體積中(通常為通常為1mg/ml)，測量，測量280nm下的下的光吸收，從而得出該蛋白質(zhì)的摩爾消光系數(shù)。這種方法最為光吸收，從而得出該蛋白質(zhì)的摩爾消光系數(shù)。這種方法最為方便、準確，適于微量測定。方便、準確，適于微量測定。二、考馬斯亮藍二、考馬斯亮藍g250法法 此法適合于定量此法適合于定量10100g，操作簡單，應(yīng)用廣泛?？捡R，操作簡單，應(yīng)用廣泛。考馬斯亮藍斯亮藍g-250又叫又叫“homemade”試劑，每個實驗室可以試劑，每個實驗室可以方方便地自行配制。便地自行配制。三、雙縮脲法三、雙縮脲法 此法是基于蛋白質(zhì)之肽鍵一此法是基于蛋白質(zhì)之肽鍵一cd-n

21、h-有雙縮脲反應(yīng)，在堿有雙縮脲反應(yīng)，在堿性溶液中與性溶液中與cu2絡(luò)合顯藍色。該法受蛋白質(zhì)之特異性影響絡(luò)合顯藍色。該法受蛋白質(zhì)之特異性影響較小，適用于較大量蛋白質(zhì)較小，適用于較大量蛋白質(zhì)(毫克級毫克級)的測定。的測定。四、福林一酚法四、福林一酚法 此法靈敏度和準確性都較高，但操作較繁瑣，此外，影響此法靈敏度和準確性都較高，但操作較繁瑣，此外，影響因素因素(譬如去垢劑干擾這一方法譬如去垢劑干擾這一方法)也較多。也較多。smith提出一種新提出一種新的的bca測定蛋白質(zhì)的方法，靈敏度和重復(fù)性均佳，受干擾測定蛋白質(zhì)的方法，靈敏度和重復(fù)性均佳，受干擾少，少，pierce公司有商品供應(yīng)。公司有商品供應(yīng)。

22、第四節(jié)第四節(jié) 蛋白質(zhì)的脫鹽蛋白質(zhì)的脫鹽(除去鹽和非除去鹽和非共價結(jié)合的小分子共價結(jié)合的小分子) 用凝膠過濾法(sephadexg-25或類似的介質(zhì))和hplc的凝膠柱脫鹽。應(yīng)用這類技術(shù)時首先要考慮蛋白質(zhì)的回收，特別對少量蛋白質(zhì)，尤其是堿性蛋白質(zhì)，則常常因載體對蛋白質(zhì)的吸附作用而導(dǎo)致回收差。此時的流動相一般不能用水，而推薦用0.1mol/l醋酸或0.1mol/l碳酸氫銨，因為可以在凍干過程中除去這些揮發(fā)性的鹽。 在蛋白質(zhì)純化的最后階段，常用揮發(fā)性溶劑(例0.1tfa/acn)的反相hplc，則可得到無鹽的蛋白質(zhì)樣品。 如果對某些蛋白質(zhì)的回收低，建議用短柱(例pe-abd公司的rp-300柱，30

23、mmx2.1mm)較為理想。 比hplc更簡單的方法是用c-18的sek-pak，或用millipore公司的超濾離心過濾管，但耗費較大。 如果蛋白質(zhì)是用sds-page純化的，則非共價結(jié)合的分子往往可以有效地除去，但又引入了sds和其他一些分子(tris，glycine等)。從sds-page電泳的凝膠中回收蛋白質(zhì)的方法很多，但不盡如人意。 如采用電印跡，往往很有效。因為pvdf膜結(jié)合蛋白質(zhì)的親和力大大高于鹽、去垢劑等小分子物質(zhì)，從而達到蛋白質(zhì)脫鹽的目的。 stone推薦用三氯醋酸(tca)沉淀蛋白質(zhì)而脫鹽，蛋白質(zhì)濃度100g/ml(如果蛋白質(zhì)濃度太低，得不到沉淀，這時可用真空離心濃縮蛋白質(zhì)

24、的方法)，加總體積19的100tca，tca最后濃度為10，在冰浴放置30rain后離心收集沉淀物，用100l冷丙酮洗兩次，氣流干燥。 第五節(jié)第五節(jié) 蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量測定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量測定 近年來由于解決了分離介質(zhì)的剛性問題，有了近年來由于解決了分離介質(zhì)的剛性問題，有了hplc的凝膠過濾系的凝膠過濾系統(tǒng)統(tǒng)(例如例如waters的的1-60、1-125、1-250和和beckman或或toyosoda的的tsk2000sw，3000sw， 4000sw)，這樣測定分子質(zhì)量只需，這樣測定分子質(zhì)量只需1h即可。即可。 但在一般實驗室應(yīng)用的常規(guī)方法是但在一般實驗室應(yīng)用的常規(guī)方法是sds-pagel，

25、刊，原理是在，刊，原理是在sds存在條件下，蛋白存在條件下，蛋白 質(zhì)表面都攜帶了大量負電荷，呈桿狀分子，在此質(zhì)表面都攜帶了大量負電荷，呈桿狀分子，在此情況下，不是根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷而是根據(jù)其分子形狀和大小來進行分情況下，不是根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷而是根據(jù)其分子形狀和大小來進行分離。用量為離。用量為0.1lg，這種方法誤差為，這種方法誤差為5一一10，但極為簡便。，但極為簡便。 凝膠過濾是測定完整蛋白質(zhì)分子的分子質(zhì)量，而凝膠過濾是測定完整蛋白質(zhì)分子的分子質(zhì)量，而sds-page是測定蛋是測定蛋白質(zhì)亞基的分子質(zhì)量，同時用這兩種方法測定同一蛋白質(zhì)分子質(zhì)量，可白質(zhì)亞基的分子質(zhì)量，同時用這兩種方法測定同一蛋白質(zhì)

26、分子質(zhì)量，可以方便地判斷樣品蛋白質(zhì)是否寡聚蛋白質(zhì)。以方便地判斷樣品蛋白質(zhì)是否寡聚蛋白質(zhì)。 較新方法是用毛細管電泳較新方法是用毛細管電泳(凝膠篩分或無膠篩分凝膠篩分或無膠篩分)測定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)測定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量，僅需納克量，而且還可用積分儀或電腦聯(lián)機精確定量。同時此法對蛋量，僅需納克量，而且還可用積分儀或電腦聯(lián)機精確定量。同時此法對蛋白質(zhì)的分辨率和準確性優(yōu)于白質(zhì)的分辨率和準確性優(yōu)于sds-page方法。在某一批方法。在某一批il-3產(chǎn)品的分子質(zhì)產(chǎn)品的分子質(zhì)量測定中，用量測定中，用sds-page得到均一的區(qū)帶，但在毛細管篩分電泳中為兩個得到均一的區(qū)帶，但在毛細管篩分電泳中為兩個毗鄰的峰。兩個

27、峰的分子質(zhì)量也有約毗鄰的峰。兩個峰的分子質(zhì)量也有約1 000da的差異，教材作者進一步用的差異，教材作者進一步用質(zhì)譜驗證了這一結(jié)果。質(zhì)譜驗證了這一結(jié)果。 最新的方法是用質(zhì)譜測定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量。最新的方法是用質(zhì)譜測定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量。20世紀世紀80年代初期，質(zhì)年代初期，質(zhì)譜用于測定分子質(zhì)量的有快原子轟擊質(zhì)譜和等離子體解吸飛行時間質(zhì)譜。譜用于測定分子質(zhì)量的有快原子轟擊質(zhì)譜和等離子體解吸飛行時間質(zhì)譜。近年來，高分辨率的磁質(zhì)譜可精確測定分子質(zhì)量近年來，高分辨率的磁質(zhì)譜可精確測定分子質(zhì)量2 000da以下的多肽。到以下的多肽。到90年代，由于電噴霧質(zhì)譜年代，由于電噴霧質(zhì)譜(esl)有了長足的發(fā)展，可

28、以用于測定分子質(zhì)量有了長足的發(fā)展，可以用于測定分子質(zhì)量約約5萬萬da的蛋白質(zhì)，而且只需皮摩爾的蛋白質(zhì)，而且只需皮摩爾(pmol)量的蛋白質(zhì)，且其精度可達量的蛋白質(zhì)，且其精度可達0.01。而。而maldi-tof則可測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量高達二三十萬道爾頓。則可測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量高達二三十萬道爾頓。圖圖1.1所示為所示為esi質(zhì)譜測定細胞色素質(zhì)譜測定細胞色素c的分子質(zhì)量，的分子質(zhì)量， 右角是其電荷分布圖，據(jù)此計算出分子質(zhì)量。右角是其電荷分布圖，據(jù)此計算出分子質(zhì)量。 第七節(jié)第七節(jié) 氨基酸定量分析氨基酸定量分析 氨基酸分析在肽譜和點突變肽的分析中是很重要的，同時也可以是很精確的。因為這種肽通常是含520

29、個氨基酸殘基的肽，又常常是以特定的某一個酸性或堿性氨基酸為c端。從氨基酸定量分析而言，分析2030個氨基酸殘基肽的精確性要比含100200個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)的精確性大得多。其次，酶解肽段(最常用胰蛋白酶)可用一個堿性氨基酸作基準1來計算，這樣準確性又可有所提高。在新型il-2的制備工作中(cys-125被ser或ala所取代)，利用二階微分光譜法可以方便地判別點突變的肽，然后用氨基酸分析或質(zhì)譜，或序列測定來進一步確認。 自從自從spackman、stein和和moore建立氨基酸自動分析方法以來，無建立氨基酸自動分析方法以來，無論在方法學(xué)、儀器自動化或高靈敏度方面都有了很大的發(fā)展。論在方法學(xué)

30、、儀器自動化或高靈敏度方面都有了很大的發(fā)展。 氨基酸分析可以分為氨基酸分析可以分為柱后反應(yīng)法和柱前衍生法柱后反應(yīng)法和柱前衍生法兩大類。兩大類。 前一種方法是將游離氨基酸經(jīng)過色譜柱分離后，氨基酸再與顯色劑前一種方法是將游離氨基酸經(jīng)過色譜柱分離后，氨基酸再與顯色劑(茚三酮、熒光胺、鄰苯二甲醛茚三酮、熒光胺、鄰苯二甲醛)作用，儀器需用專門的氨基酸分析儀或作用，儀器需用專門的氨基酸分析儀或用用hplc加上柱后衍生裝置。這種方法比較穩(wěn)定，因為一些可能有影響加上柱后衍生裝置。這種方法比較穩(wěn)定，因為一些可能有影響的的“雜質(zhì)雜質(zhì)”在柱分離過程中已與氨基酸分開，在柱分離過程中已與氨基酸分開， 然后再各自與顯色劑

31、作用。然后再各自與顯色劑作用。 后一種方法是將各種氨基酸和熒光試劑先作用生成氨基酸的衍生物，后一種方法是將各種氨基酸和熒光試劑先作用生成氨基酸的衍生物，然后再用柱把各衍生物分離，直接檢測衍生物的熒光，這種方法的特點然后再用柱把各衍生物分離，直接檢測衍生物的熒光，這種方法的特點是靈敏度高，檢出極限已達是靈敏度高，檢出極限已達1pmol，且可以利用，且可以利用hplc進行氨基酸分進行氨基酸分析，譬如析，譬如opa技術(shù)。缺點是熒光強度依賴時間變化，穩(wěn)定性欠佳，要求技術(shù)。缺點是熒光強度依賴時間變化，穩(wěn)定性欠佳，要求控制很嚴格。近年來報道的控制很嚴格。近年來報道的pitc是一種很有效的柱前衍生技術(shù)，并且

32、可是一種很有效的柱前衍生技術(shù)，并且可以在以在254nm下檢測，操作簡便。下檢測，操作簡便。 氨基酸的水解方法通常采用在5.7mol/lhcl真空狀況下110水解24h，也有在150 下快速水解4h。不同條件下，各種氨基酸的回收率會有所不同，而且色氨酸會受到破壞，通常采用3mol/l巰基乙磺酸或4mol/l甲磺酸來防止色氨酸被破壞。 一種新的方法是在水解樣品中加入保護劑十二烷硫醇(dodecanethiol)和edta，據(jù)稱色氨酸的回收率可達80。在酸水解條件下半胱氨酸的定量很不準確，偏低嚴重。通常在酸水解蛋白質(zhì)前用過甲酸氧化成磺基丙氨酸(cystemacid)；或先還原蛋白質(zhì)，用碘代乙酸處理把

33、半胱氨酸轉(zhuǎn)變成羧甲基牛胱氨酸。一種較新的方法是把蛋白質(zhì)用dtt還原后，加入乙烯吡啶(4-vinylpyridine)，然后分析其衍生物。也有報道用dtdpa(3,3dithiodipropionic acid) 與半胱氨酸和胱氨酸形成cys-mpa，此衍生物能在t-iplc中和其他氨基酸衍生物分離，故可用于準確定量半胱氨酸。 如果采用電泳法(例如sds-page)分離到樣品，則很難從凝膠中洗脫下來，可采用點印跡法把樣品轉(zhuǎn)移到pvdf膜上，然后在pvdf膜上直接進行鹽酸水解和氨基酸分析稱之為原位分析(in situ)，在膜上分析氨基酸的誤差要高于常規(guī)方法。 stein實驗室引入氣相水解法，操作方

34、便，樣品損失少，回收率也高。目前已有把蛋白質(zhì)水解、自動進樣、氨基酸分析和定量報告聯(lián)成一個系統(tǒng)的氨基酸分析儀商品出售。 第八節(jié)第八節(jié) 肽肽 譜譜定義：肽譜技術(shù)是指蛋白質(zhì)被酶解或化定義：肽譜技術(shù)是指蛋白質(zhì)被酶解或化學(xué)降解后肽段的分離分析或制備。學(xué)降解后肽段的分離分析或制備。 肽譜分析最早稱之為肽譜分析最早稱之為fingerprinting(指紋術(shù)指紋術(shù))，用在血紅蛋白，用在血紅蛋白a(hba)和血紅蛋白和血紅蛋白s (hbs)的分子病研究中，即將的分子病研究中，即將hba和和hbs分別用胰蛋白酶分別用胰蛋白酶酶解，然后將它們的肽分別進行紙電泳，再轉(zhuǎn)動酶解，然后將它們的肽分別進行紙電泳，再轉(zhuǎn)動90進

35、行紙層析。進行紙層析。 ingram用此法觀察到用此法觀察到hba和和hbs之間有一個肽斑點上的差別，進一之間有一個肽斑點上的差別，進一步的肽順序分析指出僅僅是一個氨基酸殘基步的肽順序分析指出僅僅是一個氨基酸殘基(一個凈電荷一個凈電荷)的差別，正常的差別，正常的的hba中是中是glu(6)，異常的，異常的hbs中為中為val(6)。該技術(shù)發(fā)展到現(xiàn)。該技術(shù)發(fā)展到現(xiàn)階段，肽譜階段，肽譜(peptide-mapping)用用hplc和和gel來做，來做，hplc主要是用主要是用rp-hplc根據(jù)肽的長短和疏水性質(zhì)來分離，如果肽的親水性強，則柱不根據(jù)肽的長短和疏水性質(zhì)來分離，如果肽的親水性強，則柱不能

36、滯留住這些親水性強的肽段，達不到分辨開的效果，如果某些肽的疏能滯留住這些親水性強的肽段，達不到分辨開的效果，如果某些肽的疏水性很強，往往會粘在柱上洗脫不下來，而水性很強，往往會粘在柱上洗脫不下來，而ce有時可以避免這些弊端。有時可以避免這些弊端。 近年來，隨著近年來，隨著lcms和和cems的普遍應(yīng)用，使收集到的肽峰立刻得到精確的普遍應(yīng)用，使收集到的肽峰立刻得到精確分子質(zhì)量的測定，這樣使肽譜的可靠性大大增加。分子質(zhì)量的測定，這樣使肽譜的可靠性大大增加。 此外，此外，“肽質(zhì)量指紋肽質(zhì)量指紋”(peptidemass fingerprinting，pmf)的出現(xiàn)，即用的出現(xiàn)，即用malditof質(zhì)

37、譜直接分析蛋白質(zhì)的酶解產(chǎn)物，多肽出現(xiàn)先后是按分子質(zhì)量大質(zhì)譜直接分析蛋白質(zhì)的酶解產(chǎn)物，多肽出現(xiàn)先后是按分子質(zhì)量大小排列，這對于已知序列的重組蛋白質(zhì)樣品的分析更加有利。小排列，這對于已知序列的重組蛋白質(zhì)樣品的分析更加有利。 第九節(jié)第九節(jié) 質(zhì)質(zhì) 譜譜 質(zhì)譜在質(zhì)譜在90年代的發(fā)展，特別是兩種軟電離技術(shù)的發(fā)展，使年代的發(fā)展，特別是兩種軟電離技術(shù)的發(fā)展，使生物質(zhì)譜在質(zhì)譜界成為主要角色。蛋白質(zhì)組學(xué)又為生物質(zhì)譜生物質(zhì)譜在質(zhì)譜界成為主要角色。蛋白質(zhì)組學(xué)又為生物質(zhì)譜提供了一個發(fā)揮才華的大舞臺。它們中首選的是提供了一個發(fā)揮才華的大舞臺。它們中首選的是maldi-tof，它的大容量分析、單電荷為主的測定分子質(zhì)量高達，

38、它的大容量分析、單電荷為主的測定分子質(zhì)量高達30萬萬da、干擾因素少，適合蛋白質(zhì)組的大規(guī)模分析之需。其、干擾因素少，適合蛋白質(zhì)組的大規(guī)模分析之需。其次次esi為主的為主的lc-ms聯(lián)機，適于精細的研究。聯(lián)機，適于精細的研究。 目前，質(zhì)譜廣泛用于蛋白質(zhì)的純度鑒定、分子質(zhì)量測定、目前，質(zhì)譜廣泛用于蛋白質(zhì)的純度鑒定、分子質(zhì)量測定、序列測定、肽序列測定、肽(質(zhì)質(zhì))譜分析、二硫鍵、乙?；?、糖基化、磷酰譜分析、二硫鍵、乙?；?、糖基化、磷?；?，以及非共價結(jié)合等研究中，成為研究蛋白質(zhì)不可缺少的化，以及非共價結(jié)合等研究中，成為研究蛋白質(zhì)不可缺少的技術(shù)，具有廣闊的發(fā)展前景。以往的美國質(zhì)譜年會，參加技術(shù)，具有廣闊的

39、發(fā)展前景。以往的美國質(zhì)譜年會，參加者約千余人，近年來為三四千人，其中很多是生化學(xué)家，這者約千余人，近年來為三四千人，其中很多是生化學(xué)家，這和和esi和和tof在生物學(xué)中的廣泛應(yīng)用是分不開的。質(zhì)譜年會在生物學(xué)中的廣泛應(yīng)用是分不開的。質(zhì)譜年會上生物學(xué)和醫(yī)學(xué)方面的論文也由上生物學(xué)和醫(yī)學(xué)方面的論文也由10上升到近上升到近40。 對于蛋白質(zhì)，質(zhì)譜發(fā)展還有一個重要的功能是肽的測序，這是一個被對于蛋白質(zhì)，質(zhì)譜發(fā)展還有一個重要的功能是肽的測序，這是一個被認為很有前途的測序方法，稱為串聯(lián)質(zhì)譜認為很有前途的測序方法，稱為串聯(lián)質(zhì)譜(tandem-ms)，即在第一級質(zhì)，即在第一級質(zhì)譜得到肽的分子離子，選取目標肽的離子

40、作為母離子，與惰性氣體碰譜得到肽的分子離子，選取目標肽的離子作為母離子，與惰性氣體碰撞，使肽鏈中的肽鍵斷裂，形成一系列子離子，即撞，使肽鏈中的肽鍵斷裂，形成一系列子離子，即n端碎片離子系列端碎片離子系列(b系列系列)和和c端碎片離子系列端碎片離子系列(y系列系列)，將這些碎片離子綜合分析，可得出肽，將這些碎片離子綜合分析，可得出肽段的氨基酸序列。在以四級桿為質(zhì)量分析器的質(zhì)譜，通常是將三個四級段的氨基酸序列。在以四級桿為質(zhì)量分析器的質(zhì)譜，通常是將三個四級桿串聯(lián)起來，實現(xiàn)二級質(zhì)譜，即桿串聯(lián)起來，實現(xiàn)二級質(zhì)譜，即ms/ms，這就是所謂三級四級桿質(zhì)譜。，這就是所謂三級四級桿質(zhì)譜。在以離子阱為質(zhì)量分析器

41、的質(zhì)譜中，采用離子阱可多次捕捉母離子和在以離子阱為質(zhì)量分析器的質(zhì)譜中，采用離子阱可多次捕捉母離子和子離子，因此可實現(xiàn)多級質(zhì)譜，即子離子，因此可實現(xiàn)多級質(zhì)譜，即msn，一般可達五級以上，對于分子，一般可達五級以上，對于分子結(jié)構(gòu)分析很有用處。目前的測序方法基本上是在結(jié)構(gòu)分析很有用處。目前的測序方法基本上是在esi質(zhì)譜上發(fā)展起來質(zhì)譜上發(fā)展起來的，的，maldi-tof-ms最近發(fā)展了最近發(fā)展了psl(post source decay)技術(shù)，在一定技術(shù)，在一定程度上可進行序列分析，但不如程度上可進行序列分析，但不如esi-ms測序應(yīng)用廣泛。測序應(yīng)用廣泛。 因此，因此，esi-ms可較好地與現(xiàn)有的蛋白

42、質(zhì)分析方法可較好地與現(xiàn)有的蛋白質(zhì)分析方法(如如hplc、ce)蛋蛋白質(zhì)測序技術(shù)相匹配。在蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究中，由于白質(zhì)測序技術(shù)相匹配。在蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究中，由于esi-ms強大的強大的ms/ms乃至乃至msn功能，可以解析蛋白質(zhì)的各種修飾的位點，如糖基化、功能，可以解析蛋白質(zhì)的各種修飾的位點，如糖基化、磷酸化等，以及復(fù)雜的糖鏈結(jié)構(gòu)。磷酸化等，以及復(fù)雜的糖鏈結(jié)構(gòu)。 值得注意的是，質(zhì)譜技術(shù)目前的發(fā)展非常迅猛，無論是值得注意的是，質(zhì)譜技術(shù)目前的發(fā)展非常迅猛，無論是esi，還是，還是maldi-tof，都在不斷改進，以期完善。，都在不斷改進，以期完善。esi著力于提高靈敏度著力于提高靈敏度(如采

43、用如采用nanospray，capillary lc)，以及降低鹽和去垢劑的影響；，以及降低鹽和去垢劑的影響；maldi-tof則著重于提高精確度，如在離子進入分析器前稍微停留，去除雜質(zhì)，即則著重于提高精確度，如在離子進入分析器前稍微停留，去除雜質(zhì)，即延遲抽提延遲抽提(delay extraction)和加強測序功能。和加強測序功能。 最近最近qtof質(zhì)譜的發(fā)展質(zhì)譜的發(fā)展-maldi-tof由于其儀器的固有性能，決定由于其儀器的固有性能，決定其在高分子質(zhì)量區(qū)域其在高分子質(zhì)量區(qū)域(m/z3 000)的質(zhì)量精度下降，一般認為在高分子質(zhì)的質(zhì)量精度下降，一般認為在高分子質(zhì)量區(qū)域，質(zhì)量偏差應(yīng)不超過量區(qū)域

44、，質(zhì)量偏差應(yīng)不超過100 ppm，否則在肽譜檢索時得不到準確的，否則在肽譜檢索時得不到準確的結(jié)果。結(jié)果。q-tof型儀器，由于其四極桿和飛行時間質(zhì)譜是以相互垂直方向型儀器，由于其四極桿和飛行時間質(zhì)譜是以相互垂直方向幾何型組成，當離子通過四極桿后，同樣的質(zhì)量而具有不同動能的離子幾何型組成，當離子通過四極桿后，同樣的質(zhì)量而具有不同動能的離子在垂直方向上受到飛行時間質(zhì)譜的推出電壓作用時，通過離子的水平方在垂直方向上受到飛行時間質(zhì)譜的推出電壓作用時，通過離子的水平方向動能差異不會對飛行時間質(zhì)譜分辨率產(chǎn)生影響，因而其分辨率比普通向動能差異不會對飛行時間質(zhì)譜分辨率產(chǎn)生影響，因而其分辨率比普通maldi-t

45、of要高，靈敏度也提高，顯然它的質(zhì)量精度亦有顯著提高，其要高，靈敏度也提高，顯然它的質(zhì)量精度亦有顯著提高，其偏差偏差5ppm。這樣在蛋白質(zhì)肽譜的檢索中可提高準確度。這樣在蛋白質(zhì)肽譜的檢索中可提高準確度。 目前，目前，q-tof質(zhì)譜不但有質(zhì)譜不但有esi源，也配備了源，也配備了maldi源，這無疑是如虎源，這無疑是如虎添翼，具有極高的分辨率和靈敏度。添翼，具有極高的分辨率和靈敏度。第十節(jié)第十節(jié) 蛋白質(zhì)及多肽的序列測定和末蛋白質(zhì)及多肽的序列測定和末端分析端分析 目前測定蛋白這一級結(jié)構(gòu)的主要方法有：目前測定蛋白這一級結(jié)構(gòu)的主要方法有：蛋白質(zhì)化學(xué)方法蛋白質(zhì)化學(xué)方法(主要是主要是edman降解法測降解法

46、測n端和用羧肽酶或化學(xué)法從端和用羧肽酶或化學(xué)法從c端測起端測起)和和從從cdna來演繹的方法來演繹的方法。其他方法有。其他方法有質(zhì)譜法和二維核磁共質(zhì)譜法和二維核磁共振法。振法。 利用利用cdna法測定的最長蛋白質(zhì)是脫脂脂蛋白法測定的最長蛋白質(zhì)是脫脂脂蛋白b-100(4 532個氨基酸個氨基酸殘基殘基)，用經(jīng)典的蛋白質(zhì)化學(xué)分析法測得的最大的蛋白質(zhì)是人凝血體系中，用經(jīng)典的蛋白質(zhì)化學(xué)分析法測得的最大的蛋白質(zhì)是人凝血體系中的的von willebrand因子因子(2 050個氨基酸殘基個氨基酸殘基)。從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫來看，約。從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫來看，約一半來自一半來自cdna，一半來自蛋白質(zhì)化學(xué)方法。，一半

47、來自蛋白質(zhì)化學(xué)方法。 雖然雖然cdna技術(shù)發(fā)展很快，也方便，但目前還不能取代經(jīng)典的蛋白質(zhì)技術(shù)發(fā)展很快，也方便，但目前還不能取代經(jīng)典的蛋白質(zhì)化學(xué)方法，例如部分順序測定對識別蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)活性化學(xué)方法，例如部分順序測定對識別蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)活性部位以及化學(xué)修飾部位，還是離不開部位以及化學(xué)修飾部位，還是離不開 經(jīng)典的蛋白質(zhì)化學(xué)方法。經(jīng)典的蛋白質(zhì)化學(xué)方法。 蛋白質(zhì)的末端氨基酸與在肽鍵中間的氨基酸不同，蛋白質(zhì)的一端是蛋白質(zhì)的末端氨基酸與在肽鍵中間的氨基酸不同，蛋白質(zhì)的一端是以以自由基存在的，稱之為自由基存在的，稱之為n端，習(xí)慣上列在左側(cè)；在另一端是以自端，習(xí)慣上列在左側(cè)；在另一端是

48、以自由羧基存在，則稱之為由羧基存在，則稱之為c端，習(xí)慣在右端，習(xí)慣在右 側(cè)。側(cè)。 1954年年sanger首先把二硝基氟苯應(yīng)用于胰島素的首先把二硝基氟苯應(yīng)用于胰島素的n端測端測定，為研究蛋白質(zhì)的精細化學(xué)結(jié)構(gòu)開辟了一個新的領(lǐng)域，繼定，為研究蛋白質(zhì)的精細化學(xué)結(jié)構(gòu)開辟了一個新的領(lǐng)域，繼后后edman、wetman-libet、chang等人相繼作了很多貢等人相繼作了很多貢獻。獻。 特別應(yīng)該強調(diào)指出，末端的鑒別能力較之一般的物理化學(xué)特別應(yīng)該強調(diào)指出，末端的鑒別能力較之一般的物理化學(xué)方法方法(色譜、電泳等色譜、電泳等)毫不遜色，有時甚至更為靈敏，所以也毫不遜色，有時甚至更為靈敏，所以也是鑒別蛋白質(zhì)樣品純

49、度的一種好方法。是鑒別蛋白質(zhì)樣品純度的一種好方法。一、一、n端分析端分析 在在n端測定上，目前最經(jīng)典的是異硫氰酸苯酯法端測定上，目前最經(jīng)典的是異硫氰酸苯酯法。自。自1950年代建立年代建立后，在后，在1970年代發(fā)展成一種全自動的測定方法。目前微量液相脈沖蛋白年代發(fā)展成一種全自動的測定方法。目前微量液相脈沖蛋白質(zhì)侈肽自動順序分析儀，靈敏度約質(zhì)侈肽自動順序分析儀，靈敏度約lpmol，檢出極限為，檢出極限為20fmol，加上進行，加上進行計算機數(shù)據(jù)處理和分析，既靈敏又方便。但機器有時會出現(xiàn)讀寫錯誤，計算機數(shù)據(jù)處理和分析，既靈敏又方便。但機器有時會出現(xiàn)讀寫錯誤，還是需要有經(jīng)驗的工作者加以最后判斷才是

50、最可靠的。還是需要有經(jīng)驗的工作者加以最后判斷才是最可靠的。 wittmann-liebold發(fā)展的雙標記法發(fā)展的雙標記法(dabitcpitc)，用薄層分析鑒，用薄層分析鑒定的微量序列測定法不需昂貴儀器，可成為一般實驗室普遍采用的技術(shù)，定的微量序列測定法不需昂貴儀器，可成為一般實驗室普遍采用的技術(shù)，但需要很熟練的技術(shù)才能掌握好。但需要很熟練的技術(shù)才能掌握好。 n端端15個序列的測定，很大程度上排除了蛋白質(zhì)混淆的可能，即不太可個序列的測定，很大程度上排除了蛋白質(zhì)混淆的可能，即不太可能有兩種不同的蛋白質(zhì)在能有兩種不同的蛋白質(zhì)在n端端15個序列是一樣的。這已是相當常規(guī)和公認個序列是一樣的。這已是相當

51、常規(guī)和公認的。的。 如果測定蛋白質(zhì)的幾個如果測定蛋白質(zhì)的幾個c端序列，從蛋白質(zhì)的兩端來驗證，可靠性又增端序列，從蛋白質(zhì)的兩端來驗證，可靠性又增加了許多。再加上用加了許多。再加上用ms精確測定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量，基本上是不會出差精確測定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量，基本上是不會出差錯的。如果有肽譜或肽錯的。如果有肽譜或肽(質(zhì)質(zhì))譜，則是相當完整的鑒定工作。譜，則是相當完整的鑒定工作。二、二、c端的測定端的測定 經(jīng)典的是用羧肽酶經(jīng)典的是用羧肽酶(cp)的方法，近年來雖用的方法，近年來雖用cpy、cpp，但基本方，但基本方法法仍是一樣的，基于不同時間的仍是一樣的，基于不同時間的c端氨基酸的釋放，是一個動態(tài)過程的演端氨基酸的釋放，是一個動態(tài)過程的演繹。先是用繹。先是用cpa、cpb，近來用，近來用cpy、cpp，但都不盡如人意，因為這，但都不盡如人意，因為這種方法是在加入種方法是在加入cp后每隔一定時間間隔取一部分反應(yīng)液，停止反應(yīng)，用后每隔一定時間間隔取一部分反應(yīng)液，停止反應(yīng)，用氨基酸分析測定釋放出來的游離氨基酸，以釋放氨基酸的量為縱軸，作氨基酸分析測定釋放出