第五章酶與細(xì)胞的固定化

1、第五章第五章 酶與細(xì)胞定化酶與細(xì)胞定化 固定化酶（固定化酶（immobilized enzyme）是）是20世紀(jì)世紀(jì)60年代年代發(fā)展起來的一項新技術(shù)。以往使用的酶絕大多數(shù)是水溶性發(fā)展起來的一項新技術(shù)。以往使用的酶絕大多數(shù)是水溶性的酶。這些水溶性酶催化結(jié)束后，極難回收，因而阻礙了的酶。這些水溶性酶催化結(jié)束后，極難回收，因而阻礙了酶工業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。酶工業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。60年代后，在酶學(xué)研究領(lǐng)域內(nèi)涌現(xiàn)年代后，在酶學(xué)研究領(lǐng)域內(nèi)涌現(xiàn)出固定化酶。它是出固定化酶。它是通過物理的或化學(xué)的手段，將酶束縛于通過物理的或化學(xué)的手段，將酶束縛于水不溶的載體上，或?qū)⒚甘`在一定的空間內(nèi)，限制酶分水不溶的載體上，或?qū)⒚?/p>

2、束縛在一定的空間內(nèi)，限制酶分子的自由流動，但能使酶充分發(fā)揮催化作用子的自由流動，但能使酶充分發(fā)揮催化作用。過去曾稱其。過去曾稱其為水不溶酶或固相酶。為水不溶酶或固相酶。1971年第二屆國際酶工程會上正式年第二屆國際酶工程會上正式建議采用固定化酶的名稱。建議采用固定化酶的名稱。 從從60年代起，固定化酶的研究發(fā)展很快，起初人們把注年代起，固定化酶的研究發(fā)展很快，起初人們把注意力集中在酶的固定化方法研究上，近年來，不但固定化意力集中在酶的固定化方法研究上，近年來，不但固定化方法和載體開發(fā)有了長足發(fā)展，而且已轉(zhuǎn)向它在工業(yè)、醫(yī)方法和載體開發(fā)有了長足發(fā)展，而且已轉(zhuǎn)向它在工業(yè)、醫(yī)學(xué)、化學(xué)分析、親和層析、環(huán)

3、境保護(hù)、能源開發(fā)以及理論學(xué)、化學(xué)分析、親和層析、環(huán)境保護(hù)、能源開發(fā)以及理論研究等方面的應(yīng)用研究。研究等方面的應(yīng)用研究。第一節(jié)第一節(jié) 酶和菌體固定化酶和菌體固定化 一、固定化酶與固定化細(xì)胞的優(yōu)缺點一、固定化酶與固定化細(xì)胞的優(yōu)缺點 1.固定化酶的優(yōu)點： （1）極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開；產(chǎn)物溶液）極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開；產(chǎn)物溶液中沒有酶的殘留，簡化了提純工藝。中沒有酶的殘留，簡化了提純工藝。 (2) 可以在較長時間內(nèi)反復(fù)使用，有利于工藝的連可以在較長時間內(nèi)反復(fù)使用，有利于工藝的連續(xù)化、管道化。續(xù)化、管道化。 （3）酶反應(yīng)過程可以嚴(yán)格控制，有利于工藝自動化）酶反應(yīng)過程可以嚴(yán)格控制，有利于

4、工藝自動化和微電腦化。和微電腦化。 （4）在絕大多數(shù)情況下提高了酶的穩(wěn)定性。）在絕大多數(shù)情況下提高了酶的穩(wěn)定性。 （5）較能適應(yīng)于多酶反應(yīng)。）較能適應(yīng)于多酶反應(yīng)。 （6）酶的使用效率提高，產(chǎn)物得率提高，產(chǎn)品質(zhì)量）酶的使用效率提高，產(chǎn)物得率提高，產(chǎn)品質(zhì)量有保障，成本低。有保障，成本低。 2.固定化酶的缺點固定化酶的缺點:（1）酶固定化時酶的活力有所損失。同時也）酶固定化時酶的活力有所損失。同時也增加了固定化的成本，使工廠開始投資大。增加了固定化的成本，使工廠開始投資大。（2）比較適應(yīng)水溶性底物和小分子底物。）比較適應(yīng)水溶性底物和小分子底物。（3）與完整細(xì)胞比較，不適于多酶反應(yīng)，特）與完整細(xì)胞比較

5、，不適于多酶反應(yīng)，特別是需要輔因子的反應(yīng)，同時對胞內(nèi)酶需經(jīng)分別是需要輔因子的反應(yīng)，同時對胞內(nèi)酶需經(jīng)分離后，才能固定化。離后，才能固定化。 3固定化細(xì)胞的優(yōu)點固定化細(xì)胞的優(yōu)點 (1)省去了酶的分離手續(xù)，為多酶系統(tǒng)，無須輔因子再生。省去了酶的分離手續(xù)，為多酶系統(tǒng)，無須輔因子再生。 (2)細(xì)胞生長快、而且多、反應(yīng)快。細(xì)胞生長快、而且多、反應(yīng)快。 (3) 可以連續(xù)發(fā)酵，節(jié)約了成本，而且在蒸餾和提取前不可以連續(xù)發(fā)酵，節(jié)約了成本，而且在蒸餾和提取前不用分離去細(xì)胞，能一邊排出發(fā)酵液，一邊進(jìn)行培養(yǎng)，排除了用分離去細(xì)胞，能一邊排出發(fā)酵液，一邊進(jìn)行培養(yǎng)，排除了產(chǎn)物抑制和消耗。產(chǎn)物抑制和消耗。 (4) 保持酶在細(xì)胞

6、內(nèi)的原始狀況，增加了酶的穩(wěn)定，特別保持酶在細(xì)胞內(nèi)的原始狀況，增加了酶的穩(wěn)定，特別是對污染因子的抵抗力增加。是對污染因子的抵抗力增加。 4.固定化細(xì)胞的缺點：（1）必須保持菌體的完整，防止菌體自溶，否則，將影響產(chǎn)品純度。（2）必須防止細(xì)胞內(nèi)蛋白酶對所需酶的分解，同時，需抑制胞內(nèi)其他酶的活性，以阻止副產(chǎn)物的形成。（3）細(xì)胞膜、壁會阻礙底物滲透和擴散。 二、酶的固定化方法二、酶的固定化方法酶的固定化方法有：1.吸附法2.共價鍵結(jié)合法3.交聯(lián)法4.包埋法 （圖5-1）。 1.吸附法吸附法吸附法分為吸附法分為物理吸附法物理吸附法和和離于交換吸附法離于交換吸附法（1）物理吸附法）物理吸附法 通過氫鍵、疏水

7、作用和通過氫鍵、疏水作用和電子親電子親和力等物理作用，將酶固定于水不溶載體上。從而和力等物理作用，將酶固定于水不溶載體上。從而制成固定化酶。制成固定化酶。常用的載體有：常用的載體有： （1）有機載體）有機載體 纖維素、骨膠原、火棉膠及面筋、淀粉等纖維素、骨膠原、火棉膠及面筋、淀粉等 （2）無機載體）無機載體 氧化鉛、皂土、白土、高嶺土、多孔玻璃、二氧化鈦等。氧化鉛、皂土、白土、高嶺土、多孔玻璃、二氧化鈦等。 2離子交換吸附法離子交換吸附法 這是將酶與含有離子交換基這是將酶與含有離子交換基的水不溶載體相結(jié)合而達(dá)到固定化的一種方法。酶的水不溶載體相結(jié)合而達(dá)到固定化的一種方法。酶吸附較牢，在工業(yè)上頗

8、具廣泛的用途。常用的載體吸附較牢，在工業(yè)上頗具廣泛的用途。常用的載體有陰離子交換劑，如二乙基氨基乙基（有陰離子交換劑，如二乙基氨基乙基（deaedeae）- -纖纖維素、混合胺類（維素、混合胺類（ectedlaectedla）- -纖維素、四乙氨基乙纖維素、四乙氨基乙基（基（teaeteae）- -纖維素、纖維素、deae-deae-葡聚糖凝膠、葡聚糖凝膠、amberlite ira-93amberlite ira-93、410410、900900等。陽離子交換劑等。陽離子交換劑基，如羧甲基（基，如羧甲基（cmcm）- -纖維素、纖維素檸檬酸鹽、纖維素、纖維素檸檬酸鹽、amberlite cg

9、50amberlite cg50、irc-50irc-50、ir-200ir-200、dowex-50dowex-50等。等。 包埋法是將聚合物的單體與酶溶液混合，再借助于聚包埋法是將聚合物的單體與酶溶液混合，再借助于聚合助進(jìn)劑（包括交聯(lián)劑）的作用進(jìn)行聚合，酶被包埋在合助進(jìn)劑（包括交聯(lián)劑）的作用進(jìn)行聚合，酶被包埋在聚合物中以達(dá)到固定化聚合物中以達(dá)到固定化。包埋法操作簡單，由于酶分子。包埋法操作簡單，由于酶分子只被包埋，未受到化學(xué)反應(yīng)，可以制得較高活力的固定只被包埋，未受到化學(xué)反應(yīng)，可以制得較高活力的固定化酶，對大多數(shù)酶、粗酶制劑甚至完整的微生物細(xì)胞都化酶，對大多數(shù)酶、粗酶制劑甚至完整的微生物細(xì)

10、胞都是適用的。但是，只有小分子底物和產(chǎn)物可以通過凝膠是適用的。但是，只有小分子底物和產(chǎn)物可以通過凝膠網(wǎng)絡(luò)，而對大分子底物不適宜。同時，凝膠網(wǎng)絡(luò)對物質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，而對大分子底物不適宜。同時，凝膠網(wǎng)絡(luò)對物質(zhì)擴散的阻力導(dǎo)致固定化酶動力學(xué)行為的變化、活力降低。擴散的阻力導(dǎo)致固定化酶動力學(xué)行為的變化、活力降低。四、包埋法四、包埋法1.凝膠包埋法 凝膠包埋法是將酶分子包埋在凝膠格子中。 n（1）聚丙烯酰胺凝膠包埋法 n（2）輻射包埋法 n（3）其他凝膠包埋法 2微囊化法 此法是將酶包埋于具有半透性聚合物膜的微此法是將酶包埋于具有半透性聚合物膜的微囊內(nèi)。它使酶存在于類似細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境中，可囊內(nèi)。它使酶存在于類似細(xì)胞

11、內(nèi)的環(huán)境中，可以防止酶的脫落，防止微囊外環(huán)境直接接觸，以防止酶的脫落，防止微囊外環(huán)境直接接觸，從而增加了酶的穩(wěn)定性，同時，小分子底物能從而增加了酶的穩(wěn)定性，同時，小分子底物能通過膜與酶作用，產(chǎn)物經(jīng)擴散而輸出。通過膜與酶作用，產(chǎn)物經(jīng)擴散而輸出。微膠囊微膠囊的制備方法有的制備方法有5種。種。微膠囊的制備方法：微膠囊的制備方法：（1）界面沉淀法（2）界面聚合法（3）液體干燥法（4）紅血球包埋法（5）脂質(zhì)體包埋法五、共價鍵結(jié)臺法五、共價鍵結(jié)臺法 共價鍵結(jié)合法 是酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)和載體表面上的功能基團(tuán)之間形成共價鍵而固定的方法。優(yōu)點：酶與載體結(jié)合牢固，酶不易脫落，但反應(yīng)條件較激烈，酶易失活，同時，制作手

12、續(xù)亦較繁瑣。 （一）酶分子和載體連接的功能基團(tuán) 從理論上講，酶蛋白上可供載體結(jié)合的功能基團(tuán)有以下幾種： （1）酶蛋白n-端的a-氨基或賴氨酸殘基的-氨基。 （2）酶蛋白c-端的羧基以及asp殘基的-羧基和glu殘基-羧基。 （3）cys殘基的巰基。 （4）ser、tyr、thr殘基的羥基。 （5）phe和tyr殘基的苯環(huán)。 （6）his殘基的咪唑基。 （7）trp殘基的吲哚基。 （二）載體的選擇（二）載體的選擇 載體直接關(guān)系到固定化酶的性質(zhì)和形成。對載體的一般要求是： （l）一般親水載體在蛋白質(zhì)結(jié)合量和固定化酶活力及其穩(wěn)定性上都優(yōu)于疏水載體。 （2）載體結(jié)構(gòu)疏松，表面積大，有一定的機械強度。

13、（3）載體必須帶有在溫和條件與酶共價結(jié)合的功能基團(tuán)。 （4）載體沒有或很少有非專一性吸附。 （5）載體來源容易，便宜，并能反復(fù)使用。 第二節(jié)第二節(jié) 微生物，植物和動物細(xì)胞的固定化微生物，植物和動物細(xì)胞的固定化n 菌體細(xì)胞的固定化方法基本上沿用酶固定化方法，主要有菌體細(xì)胞的固定化方法基本上沿用酶固定化方法，主要有包埋包埋法法、吸附法吸附法和和不用載體法不用載體法等。等。n 一、包理法一、包理法n 包埋法包埋法是制備固定化細(xì)胞最常用的方法。將產(chǎn)酶菌株用包是制備固定化細(xì)胞最常用的方法。將產(chǎn)酶菌株用包埋劑如聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、瓊脂、海藻酸、卡埋劑如聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、瓊脂、海藻酸、卡拉

14、膠、二和三醋酸纖維、膠原、明膠和戊二醛等包埋起來，拉膠、二和三醋酸纖維、膠原、明膠和戊二醛等包埋起來，發(fā)揮酶或酶系的作用。發(fā)揮酶或酶系的作用。19771977年我國投人生產(chǎn)的固定化青霉年我國投人生產(chǎn)的固定化青霉素酰胺酶，是使用明膠、戊二醛包埋大腸桿菌而成。美國、素酰胺酶，是使用明膠、戊二醛包埋大腸桿菌而成。美國、歐洲和日本等大規(guī)模生產(chǎn)高果糖漿的工藝多數(shù)采用固定化歐洲和日本等大規(guī)模生產(chǎn)高果糖漿的工藝多數(shù)采用固定化菌體的酶柱工藝。包埋法制備固定化細(xì)胞與其制備固定化菌體的酶柱工藝。包埋法制備固定化細(xì)胞與其制備固定化酶大體相似酶大體相似 。n包埋法：n1聚丙烯酰胺凝膠包埋法 n2瓊脂凝膠包埋法n3海藻

15、酸包埋 法n4卡拉膠包埋法 n5明膠包埋法 二、吸附法二、吸附法n吸附法：n1.物理吸附法 將微生物細(xì)胞附著個固體載體上的一種固定方法。n2.離子交換吸附法 利用離子交換吸附細(xì)胞常用的載體是離子交換樹脂。 n 三、不用載體法三、不用載體法n這是選擇適當(dāng)?shù)臈l件，通過一定處理使酶固定在細(xì)胞這是選擇適當(dāng)?shù)臈l件，通過一定處理使酶固定在細(xì)胞內(nèi)的一種方法。如葡萄糖異構(gòu)酶是一種胞內(nèi)酶，將生內(nèi)的一種方法。如葡萄糖異構(gòu)酶是一種胞內(nèi)酶，將生物細(xì)胞加熱至物細(xì)胞加熱至6060，10min10min，其他酶失活，則該酶被固，其他酶失活，則該酶被固定在細(xì)胞內(nèi)，所以又稱加熱固定化。又如鏈霉菌細(xì)胞定在細(xì)胞內(nèi)，所以又稱加熱固定

16、化。又如鏈霉菌細(xì)胞用檸檬酸處理使酶固定在細(xì)胞內(nèi)，若再用殼聚糖處理，用檸檬酸處理使酶固定在細(xì)胞內(nèi)，若再用殼聚糖處理，使之凝聚后干燥即成固定化細(xì)胞。使之凝聚后干燥即成固定化細(xì)胞。 n二、植物細(xì)胞固定化n 植物細(xì)胞比菌體細(xì)胞嬌嫩得多，需要溫和的固定化方法。植物細(xì)胞比菌體細(xì)胞嬌嫩得多，需要溫和的固定化方法。80年代年代開始研究，目前，一般采用開始研究，目前，一般采用吸附法吸附法和和包埋法包埋法 n1.吸附法 吸附法是將植物細(xì)胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂縫內(nèi)，或吸附于中空纖維外壁上。如將植物細(xì)胞定置在中空纖維的外壁與容器內(nèi)壁之間，培養(yǎng)液及o2在中空纖維管內(nèi)流動，透過中空纖維管壁（具半透膜性），傳遞給附著于

17、外壁的細(xì)胞，細(xì)胞代謝產(chǎn)物亦透過外壁隨管內(nèi)培養(yǎng)液流出。利用此法固定的豌豆細(xì)胞和胡蘿卜細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)多酚化合物的研究，可連續(xù)使用1個多月。又如將洗凈、滅菌后的泡沫塑料放進(jìn)辣椒細(xì)胞培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)一段時間，細(xì)胞吸附于塑料孔洞內(nèi)，并能生長繁殖。n2包埋法 包埋法是將植物細(xì)胞包埋于瓊脂、海藻酸鈣、聚丙烯酰胺、明膠和角叉萊膠等多孔凝膠中。bredelius等(1979）首次用海藻酸鈣包埋制備了固定化長春花細(xì)胞。毛地黃細(xì)胞、海巴朝細(xì)胞。三、動物細(xì)胞固定化三、動物細(xì)胞固定化 動物細(xì)胞比菌體細(xì)胞、植物細(xì)胞更嬌嫩，需要最溫和動物細(xì)胞比菌體細(xì)胞、植物細(xì)胞更嬌嫩，需要最溫和的固定化方法。因前，動物細(xì)胞固定的方法有吸附

18、法的固定化方法。因前，動物細(xì)胞固定的方法有吸附法和包埋法兩種，其中吸附法用的最多。和包埋法兩種，其中吸附法用的最多。 1吸附法 由于大多數(shù)動物細(xì)胞屬于附著細(xì)胞，它們在培養(yǎng)過程中趨向于附著固體表面。因此，吸附法特別適合于制備固定化動物細(xì)胞。 主要載體及固定方法有：主要載體及固定方法有： (1)轉(zhuǎn)瓶法 (2)微載體法 (3)中空纖維法包埋法包埋法 包埋法根據(jù)載體與方法不同：包埋法根據(jù)載體與方法不同： 1.凝膠包埋法 2.半透膜包埋法第三節(jié) 原生質(zhì)的固定化n 如前所述，固定化細(xì)胞可以取代游離細(xì)胞進(jìn)行發(fā)酵，如前所述，固定化細(xì)胞可以取代游離細(xì)胞進(jìn)行發(fā)酵，生產(chǎn)種有用物質(zhì)，并具有許多顯著的優(yōu)點。然而固定生產(chǎn)

19、種有用物質(zhì)，并具有許多顯著的優(yōu)點。然而固定化細(xì)胞也有其缺點，例如，固定化細(xì)胞只能用于生產(chǎn)化細(xì)胞也有其缺點，例如，固定化細(xì)胞只能用于生產(chǎn)胞外酶和其他能夠分泌到細(xì)胞外的產(chǎn)物；而且由于載胞外酶和其他能夠分泌到細(xì)胞外的產(chǎn)物；而且由于載體的影響，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)和產(chǎn)物的擴散受到一定的限制；體的影響，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)和產(chǎn)物的擴散受到一定的限制；尤其是在好氣性發(fā)酵中，溶解氧的傳遞和輸送成為關(guān)尤其是在好氣性發(fā)酵中，溶解氧的傳遞和輸送成為關(guān)鍵性的限制因素。為探討解決這些問題的方法，很多鍵性的限制因素。為探討解決這些問題的方法，很多人從不同的角度進(jìn)行研究。人從不同的角度進(jìn)行研究。n 細(xì)胞產(chǎn)生的許多代謝產(chǎn)物之所以不能分泌到胞外

20、,原因是多方面的,其中細(xì)胞壁對物質(zhì)擴散的障礙是其原因之一。因此,若能夠去除微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞的細(xì)胞壁,就有可能增加細(xì)胞膜的透過性,從而使較多的胞內(nèi)物質(zhì)分泌到細(xì)胞外。一、原生質(zhì)體的制備n要進(jìn)行原生質(zhì)體固定化要進(jìn)行原生質(zhì)體固定化,必須將微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞的細(xì)胞壁必須將微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞的細(xì)胞壁破壞而分離出原生質(zhì)體。同時要在破壞細(xì)胞壁的時候破壞而分離出原生質(zhì)體。同時要在破壞細(xì)胞壁的時候,不能影響到不能影響到細(xì)胞膜的完整性，更不能使細(xì)胞內(nèi)部的結(jié)構(gòu)受到破壞細(xì)胞膜的完整性，更不能使細(xì)胞內(nèi)部的結(jié)構(gòu)受到破壞,為此只能使為此只能使用對細(xì)胞壁有專一性作用的酶。用對細(xì)胞壁有專一性作用的酶。n不同種類的細(xì)胞不同

21、種類的細(xì)胞,由于各自細(xì)胞壁的組成、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同，由于各自細(xì)胞壁的組成、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同，原生質(zhì)體的制備方法也不一樣。一般說來，原生質(zhì)體的制備過程原生質(zhì)體的制備方法也不一樣。一般說來，原生質(zhì)體的制備過程是首先將對數(shù)生長期的細(xì)胞收集起來是首先將對數(shù)生長期的細(xì)胞收集起來,懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑的懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑的高滲緩沖液中。然后加人適宜的細(xì)胞壁水解酶，在一定的條件下高滲緩沖液中。然后加人適宜的細(xì)胞壁水解酶，在一定的條件下作用一段時間，使細(xì)胞壁破壞。分離除去細(xì)胞壁碎片，未作用的作用一段時間，使細(xì)胞壁破壞。分離除去細(xì)胞壁碎片，未作用的細(xì)胞以及細(xì)胞壁水解酶，而得到原生質(zhì)體。細(xì)胞以及細(xì)胞壁水解酶，而

22、得到原生質(zhì)體。二、原生質(zhì)體固定化n 原生質(zhì)體制備好后，把離心收集到的原生原生質(zhì)體制備好后，把離心收集到的原生質(zhì)體重新懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑的緩沖液中，質(zhì)體重新懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑的緩沖液中，配成一定濃度的原生質(zhì)體懸浮液。然后采用包配成一定濃度的原生質(zhì)體懸浮液。然后采用包埋法制成固定化原生質(zhì)體。埋法制成固定化原生質(zhì)體。n原生質(zhì)體固定化一般采用凝膠包埋法。常原生質(zhì)體固定化一般采用凝膠包埋法。常用的凝膠有用的凝膠有: :瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角叉瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠和光交聯(lián)樹脂等?，F(xiàn)舉例說明如下菜膠和光交聯(lián)樹脂等。現(xiàn)舉例說明如下: : 1.瓊脂-多孔醋酸纖維素固定化法 用生理鹽水配制

23、用生理鹽水配制3%3%4%4%的瓊脂，加熱的瓊脂，加熱溶解滅菌后，至溶解滅菌后，至5050左右，與等體積的左右，與等體積的一定濃度的原生質(zhì)體懸浮液混合將混合一定濃度的原生質(zhì)體懸浮液混合將混合液用滴管滴到一定形狀的多孔醋酸纖維液用滴管滴到一定形狀的多孔醋酸纖維素上素上, ,置于冰箱或冰盒中冷卻凝固，制成置于冰箱或冰盒中冷卻凝固，制成固定化原生質(zhì)體。固定化原生質(zhì)體。 2.海藻酸鈣凝膠固定化法 用含有滲透壓穩(wěn)定劑的緩沖溶液配用含有滲透壓穩(wěn)定劑的緩沖溶液配制一定濃度的制一定濃度的(3%(3%6%)6%)海藻酸鈉溶液海藻酸鈉溶液, ,與與等體積的一定濃度的原生質(zhì)體懸浮液混等體積的一定濃度的原生質(zhì)體懸浮液

24、混合均勻合均勻, ,將此混懸液用滴管或注射器滴到將此混懸液用滴管或注射器滴到一定濃度的氯化鈣溶液中一定濃度的氯化鈣溶液中, ,浸泡浸泡1 12h,2h,制制成直徑為成直徑為1 14mm4mm的球狀固定化原生質(zhì)體。的球狀固定化原生質(zhì)體。 3.角叉菜膠固定化法 用含有滲透壓穩(wěn)定劑的緩沖溶液配用含有滲透壓穩(wěn)定劑的緩沖溶液配制一定濃度制一定濃度(3%(3%8%)8%)的角叉菜膠的角叉菜膠, ,加熱溶加熱溶解解, ,滅菌后滅菌后, ,冷卻至冷卻至5050左右左右, ,與等體積的與等體積的原生質(zhì)體懸浮液混合均勻原生質(zhì)體懸浮液混合均勻, ,將混懸液滴到將混懸液滴到一定濃度的預(yù)冷的氯化鉀溶液中一定濃度的預(yù)冷的

25、氯化鉀溶液中, ,制成球制成球狀固定化原生質(zhì)體。狀固定化原生質(zhì)體。 4.光交聯(lián)樹脂固定化法 用含有滲透壓穩(wěn)定劑的緩沖溶液配制用含有滲透壓穩(wěn)定劑的緩沖溶液配制30%30%60%60%濃度的光交聯(lián)樹脂預(yù)聚體濃度的光交聯(lián)樹脂預(yù)聚體, ,加熱溶解加熱溶解后后, ,在在5050左右左右, ,加人加人1%1%光敏劑光敏劑, ,與等體積的原與等體積的原生質(zhì)體懸浮液混合均勻生質(zhì)體懸浮液混合均勻, ,攤成薄層攤成薄層, ,經(jīng)紫外光照經(jīng)紫外光照射射2 23mm,3mm,聚合后切成一定形狀的小塊聚合后切成一定形狀的小塊, ,制成片制成片狀固定化原生質(zhì)體。狀固定化原生質(zhì)體。 此外也可選用其他適宜的凝膠或中空纖維為載此

26、外也可選用其他適宜的凝膠或中空纖維為載體，制備固定化原生質(zhì)體。體，制備固定化原生質(zhì)體。三、固定化原生質(zhì)體的應(yīng)用三、固定化原生質(zhì)體的應(yīng)用 固定化原生質(zhì)體一方面保持了細(xì)胞原有的固定化原生質(zhì)體一方面保持了細(xì)胞原有的新陳代謝特性，可以照常產(chǎn)生原來在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)新陳代謝特性，可以照常產(chǎn)生原來在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的各種代謝產(chǎn)物，另一方面又去除了細(xì)胞壁生的各種代謝產(chǎn)物，另一方面又去除了細(xì)胞壁這一擴散屏障，有利于胞內(nèi)產(chǎn)物不斷地分泌到這一擴散屏障，有利于胞內(nèi)產(chǎn)物不斷地分泌到胞外，這樣就可以不經(jīng)過細(xì)胞破碎和提取工藝胞外，這樣就可以不經(jīng)過細(xì)胞破碎和提取工藝而在發(fā)酵液中獲得所需的發(fā)產(chǎn)物而在發(fā)酵液中獲得所需的發(fā)產(chǎn)物,為胞內(nèi)物質(zhì)為胞

27、內(nèi)物質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)開辟了新途徑。的工業(yè)化生產(chǎn)開辟了新途徑。 固定化原生質(zhì)體具有下列特點固定化原生質(zhì)體具有下列特點: : (1)(1)固定化原生質(zhì)體由于解除了細(xì)胞壁這一擴散固定化原生質(zhì)體由于解除了細(xì)胞壁這一擴散屏障屏障, ,可增加細(xì)胞膜的通透性可增加細(xì)胞膜的通透性, ,有利于氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)有利于氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞和吸收的傳遞和吸收, ,也有利于胞內(nèi)物質(zhì)的分泌也有利于胞內(nèi)物質(zhì)的分泌, ,可顯著提高可顯著提高產(chǎn)率。產(chǎn)率。 (2)(2)固定化原生質(zhì)體由于有載體的保護(hù)作用固定化原生質(zhì)體由于有載體的保護(hù)作用, ,具有具有較好的操作穩(wěn)定性和保存穩(wěn)定性較好的操作穩(wěn)定性和保存穩(wěn)定性, ,可反復(fù)使用或連續(xù)可反復(fù)

28、使用或連續(xù)使用較長的時間使用較長的時間, ,利于連續(xù)化生產(chǎn)。在冰箱保存較長利于連續(xù)化生產(chǎn)。在冰箱保存較長時間后仍能保持其生產(chǎn)能力。時間后仍能保持其生產(chǎn)能力。 (3)(3)固定化原生質(zhì)體易于和發(fā)酵產(chǎn)物分開固定化原生質(zhì)體易于和發(fā)酵產(chǎn)物分開, ,有利于產(chǎn)物的分離純化有利于產(chǎn)物的分離純化, ,提高產(chǎn)品質(zhì)量。提高產(chǎn)品質(zhì)量。 (4)(4)固定化原生質(zhì)體發(fā)酵的培養(yǎng)基中需要固定化原生質(zhì)體發(fā)酵的培養(yǎng)基中需要添加滲透壓穩(wěn)定劑添加滲透壓穩(wěn)定劑, ,以保持原生質(zhì)體的穩(wěn)定性。以保持原生質(zhì)體的穩(wěn)定性。這些滲透壓穩(wěn)定劑在發(fā)酵結(jié)束后這些滲透壓穩(wěn)定劑在發(fā)酵結(jié)束后, ,可用層析或可用層析或膜分離技術(shù)等方法與產(chǎn)物分離。膜分離技術(shù)等方法與產(chǎn)物分離。 固定化原生質(zhì)體可用于各種氨基酸、酶和生物堿等物質(zhì)的生產(chǎn)以及甾體轉(zhuǎn)化等?，F(xiàn)舉例如下: 1.1.氨基酸的生產(chǎn)氨基酸的生產(chǎn) 19821982年日本東京工業(yè)大學(xué)以瓊脂多孔蠟酸纖維年日本東京工業(yè)大學(xué)以瓊脂多孔蠟酸纖維素固定化黃色短桿菌原生質(zhì)體素固定化黃色短桿菌原生質(zhì)體, ,用于生產(chǎn)谷氨酸的研用于生產(chǎn)谷氨酸的研究。結(jié)果表明，由于解除了細(xì)胞壁的擴散障礙，有利究。結(jié)果表明，由于解除了細(xì)胞壁的擴散障礙，有利于谷氨酸分泌到胞外，提高谷氨酸產(chǎn)率。固定化原生于谷氨酸分泌到胞外