MTT原理步驟結(jié)果分析方法及注意事項(xiàng)

1、MTT 原理、步驟、結(jié)果分析方法及注意事項(xiàng)發(fā)布日期 :2006-12-6 熱門指數(shù) :2025MTT分析法以活細(xì)胞代謝物還原劑3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide, MTT噻唑藍(lán)為基礎(chǔ)。 MTT 為黃色化合物， 是一種接受氫離子的染料，可作用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C 的作用下tetrazolium 環(huán)開(kāi)裂，生成藍(lán)色的formazan 結(jié)晶， formazan 結(jié)晶的生成量?jī)H與活細(xì)胞數(shù)目成正比（死細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將MTT 還原）。還原生成的formazan 結(jié)晶可在含5

2、0%的 N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸鈉（pH 4.7）的 MTT 溶解液中溶解，利用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm 處的光密度OD 值，以反映出活細(xì)胞數(shù)目。也可以用DMSO 來(lái)溶解。MTT 粉末和溶液保存時(shí)都需要避光，用鋁箔紙包好就可以。實(shí)驗(yàn)的時(shí)候我一般關(guān)閉超凈臺(tái)上的日光燈來(lái)避光，覺(jué)得這樣比較好。MTT步驟如下：1：接種細(xì)胞：用含10胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔1000 10000 個(gè)細(xì)胞接種到96 孔板，每孔體積200ul.2:培養(yǎng)細(xì)胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3 5 天（可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時(shí)間）。3：呈色：培養(yǎng) 3 5 天后，每孔加 MTT 溶液（ 5mg/ml

3、用 PBS <ph=7.4> 配)20ul.繼續(xù)孵育 4 小時(shí)，終止培養(yǎng)， 小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液， 對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加 150ul DMSO ，振蕩 10 分鐘，使結(jié)晶物充分融解。4：比色：選擇 490nm 波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。注意事項(xiàng)：（ 1）選擇適當(dāng)?shù)眉?xì)胞接種濃度。（ 2）避免血清干擾：一般選小于 10的胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗(yàn)。在呈色后盡量吸盡孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。（ 3）設(shè)空白對(duì)照：與試驗(yàn)平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照。其他試驗(yàn)步驟保持一致，最后比色以空白調(diào)零。MT

4、T 實(shí)驗(yàn)吸光度最后要在0-0.7 之間，超出這個(gè)范圍就不是直線關(guān)系，IC50 是半抑制率，意思是抑制率50的時(shí)候藥物的濃度。把藥品稀釋成不同的濃度，然后計(jì)算各自的抑制率，以藥品的濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)作圖，然后得到50抑制率時(shí)候的藥品濃度，就是IC50 。要點(diǎn)：藥品 2 倍稀釋，多做梯度，做點(diǎn)線圖即可！舉個(gè)例子：各組濃度0.1、0.01、 0.001、 0.0001、 0.00001、 0.000001，稀釋倍數(shù)為 10，最大濃度為 0.1，抑制率為0.95、 0.80、 0.65、 0.43、0.21， 0.06。代入計(jì)算公式：Pm=0.95Pn=0.06P=0.95+0.80+0.6

5、5+0.43+0.21+0.06=3.1Xm=lg0.1=-1lgI=lg0.1/0.01=1lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025IC50=0.00025有一個(gè)公式可供參考;lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg最大劑量I:lg( 最大劑量 /相臨劑量 )P:陽(yáng)性反應(yīng)率之和Pm:最大陽(yáng)性反應(yīng)率Pn:最小陽(yáng)性反應(yīng)率抑制率 =1-加藥組 OD 值 /對(duì)照組 OD 值公式中的最大最小陽(yáng)性反應(yīng)率就是最大最小抑制率例：用 96 孔板培養(yǎng) SMMC-7721 肝癌做 MTT 測(cè)細(xì)胞活力 ,應(yīng)該加多少 1640 培養(yǎng)基 ,多少 MTT 和DMSO 合適 ?根據(jù)書(shū)上說(shuō)的加 200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加 DMSO 之前要盡量去掉培養(yǎng)液，便于 DMSO 溶解甲臜顆粒進(jìn)行比色測(cè)定一般每孔 4000 個(gè)細(xì)胞為宜，既細(xì)胞濃度在上清液，注意不要將甲瓉洗掉，然后每孔加20000 個(gè) /ml ， MTT 加 20ul ，作用四小時(shí)后洗掉150ul DMSO ，在脫色搖床上振蕩10 分鐘，然后測(cè)吸光值。-一般要低于IC50 ，避免非調(diào)亡性殺傷的細(xì)胞太多，造成流式細(xì)胞儀檢測(cè)碎片太多。我一