WB實(shí)驗(yàn)基本步驟

1、實(shí)驗(yàn)基本步驟提取細(xì)胞蛋白BCA定量制備蛋白膠（SDS-PAGE膠）蛋白樣品變性電泳轉(zhuǎn)膜封閉一抗TBST洗滌二抗TBST洗滌顯影結(jié)果分析試劑配制1.PBS 磷酸鹽緩沖溶液1L磷酸二氫鉀0.24g磷酸氫二鈉1.44g氯化鈉8g氯化鉀0.2g加入 500ml 純水，調(diào)PH=7.2定容至 1L, 高壓蒸汽滅菌2.PBST （ PBS+0.05% 吐溫 -20 ）500mlPBS+0.25ml 吐溫 -203. 電轉(zhuǎn)液 500mlTris1.5g甘氨酸7.2g400ml 水溶解加入 100ml 甲醇，置于4冰箱預(yù)冷4. 電泳液（ 1X ）10x 稀釋， 50ml10x 電泳液 +450ml 純水5.TB

2、S6.TBST （ TBS+0.05% 吐溫 -20 ）50mlTBS+450ml純水 +0.25ml 吐溫 -207. 封閉液TBST1X+5% 奶粉40ml 封閉液 =40mlTBST+2g奶粉， 40 預(yù)熱WB 實(shí)驗(yàn)一、蛋白樣品制備準(zhǔn)備 :一管細(xì)胞， PBS（ 4預(yù)冷）， PMSF（100mM ），移液槍（ 1000ul ，10ul ）， 1.5mlEP 管 2 個(gè)，高速冷凍離心機(jī) 4預(yù)冷1.于 -20冰箱中取出一管細(xì)胞樣品，吸去培養(yǎng)液2.加入 1ml 4 預(yù)冷的 PBS（0.01M pH7.2 7.3）。用移液槍輕輕吹成懸浮液后4， 8000r 離心 5min，然后棄去上清。重復(fù)以上操

3、作一次，共洗細(xì)胞兩次以洗去培養(yǎng)液。3.按 1ml 裂解液加10 l PMSF（ 100 mM ），搖勻置于冰上。 （ PMSF要搖勻至無結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合。）4.在樣品中加入300ul 含 PMSF的裂解液，吹勻，于冰上裂解30 min ，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動(dòng)。5.裂解完后，于4下 12000 rpm 離心 5 min。7.將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5 ml 的離心管中放于20保存。二、蛋白含量的測定（BCA定量）準(zhǔn)備： 96 孔板，移液槍（1000ul ， 10ul ，200ul）， BCA工作液（ A+B）， 50mlEP 管， 1xPBS， BSA標(biāo)準(zhǔn)液1.將 96

4、 孔板分好區(qū)域，若不夠分則只做兩個(gè)重復(fù)，（外圍一圈的孔最好不用）2.算好孔數(shù)（總的） 每孔加 200ulBCA 工作液（ A+B），（ A 液：B 液 =50:1，一般配多些， 如 60 孔，A 液 12000ul ，B 液 240ul）3.將樣品稀釋到一定倍數(shù)才能定量，（10 倍， 20 倍， 30 倍），每孔需要20ul 樣品（ 2ul 樣品 +18ulPBS,即稀釋 10 倍），做三個(gè)重復(fù)則需要60ul ，一般配80ul4.配蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品，將2mg/ml 的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至0.5mg/ml ，若配 200ul 的 0.5mg/ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液則需要 50ul 的 2mg/ml 的蛋白

5、標(biāo)準(zhǔn)溶液和150ul PBS 溶液5.將稀釋好的樣品加入孔板中（標(biāo)記的區(qū)域），接著標(biāo)準(zhǔn)品按0，1,2,4,8,12,16,20ul 加到標(biāo)號(hào)的區(qū)域，之后在加標(biāo)準(zhǔn)樣品的孔內(nèi)，將孔內(nèi)溶液用PBS補(bǔ)足到 20ul6.每孔加 200ul 配好的工作液,平行加 ,不能上下加 ,以減少誤差7.將加好的96 孔板放在 37下孵育 30 分鐘8.孵育完后 ,放在酶標(biāo)儀輕微震蕩3-10s,中速 ,吸光值 595nm, 進(jìn)行比色測定 ,記錄標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品吸光值數(shù)據(jù)后,以蛋白含量（ ml ）為橫坐標(biāo) ,吸光值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。（R2 0.98 才有用 ,酶標(biāo)儀操作 :兩個(gè)箭頭圖標(biāo),1 是結(jié)果 ,2 是保存）9.計(jì)

6、算蛋白含量（注意定量樣品已經(jīng)稀釋了10 倍）蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線加樣量序號(hào)12345678標(biāo)準(zhǔn)蛋白量 /ul01248121620（ 0.5mg/ml ）背景液（ PBS） /ul2019181612840標(biāo)準(zhǔn)液濃度 mg/ml00.0250.050.10.20.30.40.5三、 SDSPAGE電泳1. 配膠（ 12%,可以提前配好）準(zhǔn)備：玻璃板，梳子，AP（解凍，現(xiàn)拿現(xiàn)用），聚丙烯酰胺（4冰箱冷藏）（ 1）玻璃板驗(yàn)漏 5min（ 2）按表配置分離膠（ 3）灌膠，加酒精封壓，凝 30min （注意不要有氣泡）（4）按表配濃縮膠，倒掉酒精，用吸水紙吸去酒精，灌膠，插梳子（注意不要有氣泡），凝30

7、min（5）取膠，用水沖洗一下濃縮膠，加少量水放入一次性手套中4冰箱保存?zhèn)溆?. 樣品處理準(zhǔn)備： PBS，移液槍， 1.5mlEP 管（1）稀釋樣品： 一般每孔上樣5ul，即 1mg/ml 濃度的樣品， 測完蛋白含量后，將樣品用PBS稀釋至 1mg/ml（注意 loadingbuffer 的加入也得算入）（2）取出上樣樣品15ul 至 1.5 ml 離心管中，加入6 SDS 上樣緩沖液3ul 至終濃度為1。（上樣總體積一般不超過15 l ，加樣孔的最大限度可加20 l 樣品。）（3）將樣品在100煮 5 min 震蕩使蛋白完全變性（注意儀器操作）3. 電泳準(zhǔn)備：電泳液500ml（現(xiàn)配），蛋白膠

8、，10ul 移液槍（槍頭），樣品，Marker ，冰盒，電泳裝置（ 1）將 SDS-PAGE 膠放入電泳槽中，加足夠的電泳液。（短玻璃板面向內(nèi)，長玻璃板面向外。若只跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外。電泳液至少要漫過內(nèi)測的短玻璃板。注意先檢漏。）（2）上樣。用移液槍貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個(gè)樣品時(shí)，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌 3 次，以免交叉污染。）（3）先設(shè)置80V，開始電泳，樣品溴酚藍(lán)跑至分離膠后增至120V電壓，電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜

9、。（此時(shí)準(zhǔn)備好電轉(zhuǎn)液）四、轉(zhuǎn)膜準(zhǔn)備：電轉(zhuǎn)液（現(xiàn)配4冰箱冷藏），鑷子，濾紙，PVDF膜（ 0.45um ），電轉(zhuǎn)裝置，冰盒注意：拿濾紙和膜時(shí)一定要戴手套或用鑷子，因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜。1. 在加有轉(zhuǎn)移液的盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊2. 濾紙浸入電轉(zhuǎn)液中，PVDF膜在甲醇中潤濕成半透明，小心將膜放入4電轉(zhuǎn)液中平衡至少5min。3. 將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。（一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動(dòng)。）在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊于墊子上），一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。4. 先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時(shí)候動(dòng)作

10、要輕，要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會(huì)兒玻璃板便開始松動(dòng)，直到撬去玻板。（撬時(shí)一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上（做好標(biāo)記），用手調(diào)整使其與濾紙對齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個(gè)膠（膜蓋下后不可再移動(dòng)）并除氣泡。在膜上蓋紙并除去氣泡。最后蓋上另一個(gè)海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會(huì)發(fā)生短路。（轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時(shí)要戴手套，實(shí)驗(yàn)室要開門以使空氣流通。）3 張濾5. 將夾子放入轉(zhuǎn)移槽中（電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，漿槽放入冰中），要使夾的

11、黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。一般用 100mA 轉(zhuǎn)移 90min 。6. 轉(zhuǎn)完后將膜用 1麗春紅染液染 5 min（于脫色搖床上搖） 。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。將膜晾干備用。（準(zhǔn)備封閉液）六、免疫反應(yīng)準(zhǔn)備：封閉液，一抗，二抗，TBST1 .將膜移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉2h。2. TBST洗 4 次。每次 5 分鐘。3. 將膜按照目的蛋白所處位置剪切并做好標(biāo)記，加入相對應(yīng)的一抗，室溫孵育2h 或者 4過夜4. 室溫下孵育12 h 后，用 TBST在室溫下脫色搖床上洗四次，每次5min5.同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育12 h 后，用 TBST在室溫下脫色搖床上洗4 次，每次 5 min七、顯影準(zhǔn)備：樣品膠片，移液槍（200ul ），中槍頭，吸水紙，顯影液（A+B），薄鑷子一抗二抗目的蛋白 78kd Bip 1:1000兔二抗75kd目的蛋白 34kd GAPDH內(nèi)參 1:50