流式細(xì)胞儀培訓(xùn)

1、主要內(nèi)容主要內(nèi)容 流式細(xì)胞儀概述流式細(xì)胞儀概述 流式細(xì)胞儀的工作原理流式細(xì)胞儀的工作原理 流式細(xì)胞儀的應(yīng)用流式細(xì)胞儀的應(yīng)用 檢測的一般步驟檢測的一般步驟 一、流式細(xì)胞儀概述一、流式細(xì)胞儀概述 流式細(xì)胞儀種類流式細(xì)胞儀種類bd facsvantagebd-calibur epics altraepics altra beckman coulter流式細(xì)胞儀的定義流式細(xì)胞儀的定義 流式細(xì)胞儀是指，使細(xì)胞（或其他粒子）以單個方式依次高速通過激發(fā)光束，采集細(xì)胞被光照時產(chǎn)生的各種信號，對信號進(jìn)行處理，并對各參數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析的一種儀器。 利用流式細(xì)胞儀通過檢測熒光信號來檢利用流式細(xì)胞儀通過檢測熒光信號來檢

2、測細(xì)胞或其它顆粒性物質(zhì)（表面或胞漿或胞測細(xì)胞或其它顆粒性物質(zhì)（表面或胞漿或胞核）的物理、化學(xué)特性并通過這些特性對細(xì)核）的物理、化學(xué)特性并通過這些特性對細(xì)胞或顆粒進(jìn)行定量。胞或顆粒進(jìn)行定量。u 檢測表面標(biāo)記物檢測表面標(biāo)記物u 檢測胞漿標(biāo)記物檢測胞漿標(biāo)記物u 檢測胞核內(nèi)標(biāo)記物檢測胞核內(nèi)標(biāo)記物u 檢測可溶性蛋白檢測可溶性蛋白流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry）流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)前向散射前向散射側(cè)向散射側(cè)向散射流式細(xì)胞儀顯微鏡流動的細(xì)胞靜止的細(xì)胞樣本數(shù)量大數(shù)量少高速分選樣本難以再利用細(xì)胞群體特征量分布可以揭示細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息特殊的顯微鏡特殊的顯微鏡 高速測定細(xì)胞，

3、大樣本計(jì)數(shù)高速測定細(xì)胞，大樣本計(jì)數(shù) 檢測稀有細(xì)胞檢測稀有細(xì)胞 多參數(shù)分析多參數(shù)分析 自動化自動化 細(xì)胞分選細(xì)胞分選流式細(xì)胞儀的主要特點(diǎn)流式細(xì)胞儀的主要特點(diǎn) 二、流式細(xì)胞儀工作原理二、流式細(xì)胞儀工作原理 流式細(xì)胞儀工作原理流式細(xì)胞儀工作原理流式細(xì)胞儀通常以激光作為激發(fā)光源，經(jīng)過流式細(xì)胞儀通常以激光作為激發(fā)光源，經(jīng)過聚焦整形后的光束垂直照射在樣品流上，被聚焦整形后的光束垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細(xì)胞在激光束的照射下產(chǎn)生散射熒光染色的細(xì)胞在激光束的照射下產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。這兩種信號被光電二極管和光和激發(fā)熒光。這兩種信號被光電二極管和光電倍增管接收，之后轉(zhuǎn)換為電信號，再通光電倍增管接收，之后

4、轉(zhuǎn)換為電信號，再通過模過模/數(shù)轉(zhuǎn)換器，將連續(xù)的電信號轉(zhuǎn)換為可被數(shù)轉(zhuǎn)換器，將連續(xù)的電信號轉(zhuǎn)換為可被計(jì)算機(jī)識別的數(shù)字信號，最后由計(jì)算機(jī)進(jìn)行計(jì)算機(jī)識別的數(shù)字信號，最后由計(jì)算機(jī)進(jìn)行計(jì)算處理。計(jì)算處理。儀器基本組成儀器基本組成流路流路 流動室流動室 鞘液鞘液sheath sheath 樣本流樣本流sample sample 單細(xì)胞懸液單細(xì)胞懸液5 5 10105 5-1-1 10106 6個個/ml/ml光路光路 光源光源 濾片濾片 光電倍增管光電倍增管pmt hvpmt hv電路電路 放大電路放大電路hvhv及及gain gain 增益增益 a/da/d轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)換統(tǒng)計(jì)統(tǒng)計(jì) 計(jì)算機(jī)計(jì)算機(jī)流路流路injec

5、tor tipfluorescencesignalsfocused laserbeamsheath fluid流動室流動室流式細(xì)胞儀光路圖流式細(xì)胞儀光路圖air-cooled argon ion laserbeam shaping lenseshigh sensitivityquartz flow cellforward scatterdetectorside scatterdetector525bp fl1 (fitc)575bp fl2 (pe)620bp fl3 (ecd)675bp fl4 (pc5)488dl488bk550dl600dl645dl流動室流動室488nm氬離子激光器氬

6、離子激光器633nm氦氖激光器氦氖激光器大功率水冷紫外激光器大功率水冷紫外激光器光路光路 - 濾片特性濾片特性l 長通濾片長通濾片 允許長于設(shè)定波長的光通過允許長于設(shè)定波長的光通過l 短通濾片短通濾片 允許短于設(shè)定波長的光通過允許短于設(shè)定波長的光通過l 帶通濾片帶通濾片 允許一定帶寬的波長通過允許一定帶寬的波長通過l 當(dāng)以當(dāng)以 4545o o 角角放置濾片時放置濾片時, ,該濾片可以通過一定波長的光該濾片可以通過一定波長的光, ,同同時也可以阻斷并折射該波長以下的光時也可以阻斷并折射該波長以下的光 ，這種方式的濾片這種方式的濾片稱為二向色性濾片稱為二向色性濾片( ( dichroicdichr

7、oic filter) filter)630 nm bandpass filterwhite light source光信號收集光信號收集 光信號分離，導(dǎo)向，各探測通道光信號分離，導(dǎo)向，各探測通道pmtpmt接收并轉(zhuǎn)化為電信號。接收并轉(zhuǎn)化為電信號。二色鏡二色鏡 1 2 3帶通濾波片帶通濾波片光電倍增管光電倍增管激光束激光束細(xì)胞細(xì)胞收集透鏡收集透鏡前前向向散散射射光光側(cè)向散射光，側(cè)向散射光，熒光熒光數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理fsc ssc fl1 fl2 fl3對數(shù)對數(shù) 線性線性 線性線性 線性線性 對數(shù)對數(shù)脈沖處理，模數(shù)轉(zhuǎn)換光信號光信號電信號電信號記錄數(shù)據(jù)，顯示結(jié)果記錄數(shù)據(jù)，顯示結(jié)果（面積，峰高，寬度）

8、（面積，峰高，寬度）顆粒度顆粒度細(xì)胞大小細(xì)胞大小流式細(xì)胞儀產(chǎn)生的信號非熒光信號非熒光信號fl1 fitc,gfp(pmt2)fl2 pe (pmt3)fl3 ecd,pi (pmt4)fl4 pc5,apc (pmt5)熒光信號熒光信號u細(xì)胞表面的抗原細(xì)胞表面的抗原( (或細(xì)胞膜受體或細(xì)胞膜受體) )與相關(guān)的與相關(guān)的熒光抗體結(jié)合，形成帶有熒光的抗原抗體熒光抗體結(jié)合，形成帶有熒光的抗原抗體復(fù)合物。復(fù)合物。u通過流式細(xì)胞儀測定其熒光量，即可得通過流式細(xì)胞儀測定其熒光量，即可得到細(xì)胞群的不同抗原位點(diǎn)表達(dá)情況。到細(xì)胞群的不同抗原位點(diǎn)表達(dá)情況。原原理理488nm488nm空冷激光空冷激光 ： fitcf

9、itc、pepe、ecdecd、pc5pc5、pipi、7aad7aad、 percp percp 、egfp egfp 、eyfp eyfp 、ao ao 、to to 、fluo3fluo3633nm633nm空冷激光：空冷激光： apcapc、apc-cy7 apc-cy7 、cy5 cy5 90-490-4水冷激光：水冷激光：uvuv（333-364nm333-364nm） hoechst 33342hoechst 33342、dapi dapi 三、流式細(xì)胞儀應(yīng)用三、流式細(xì)胞儀應(yīng)用 流式細(xì)胞儀應(yīng)用流式細(xì)胞儀應(yīng)用 淋巴細(xì)胞免疫功能測定淋巴細(xì)胞免疫功能測定 干細(xì)胞研究干細(xì)胞研究 細(xì)胞增殖

10、與凋亡檢測細(xì)胞增殖與凋亡檢測 細(xì)胞周期及倍體分析細(xì)胞周期及倍體分析 細(xì)胞活性分析細(xì)胞活性分析 細(xì)胞分選細(xì)胞分選 淋巴細(xì)胞亞群淋巴細(xì)胞亞群 活化的活化的t淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞 抗原特異性免疫細(xì)胞抗原特異性免疫細(xì)胞 調(diào)控性調(diào)控性t細(xì)胞細(xì)胞 樹突狀細(xì)胞樹突狀細(xì)胞 先天免疫細(xì)胞先天免疫細(xì)胞細(xì)胞免疫功能測定細(xì)胞免疫功能測定 細(xì)胞群細(xì)胞群 cdcd抗原抗原 t t細(xì)胞細(xì)胞 cd2 cd3 cd4 cd5 cd7 cd8 cd28 cd38cd2 cd3 cd4 cd5 cd7 cd8 cd28 cd38 b b細(xì)胞細(xì)胞 cd10 cd19 cd20-cd24 cd37 cd72-cd75cd10 cd19 c

11、d20-cd24 cd37 cd72-cd75 髓系細(xì)胞髓系細(xì)胞 cd13 cd14 cd15-cd17 cd33 cd34 cd35cd13 cd14 cd15-cd17 cd33 cd34 cd35 nk nk細(xì)胞細(xì)胞 cd16 cd56 cd57 cd94cd16 cd56 cd57 cd94 血小板血小板 cd31 cd41 cd42a cd42b cd61 cd62p cd63 cd31 cd41 cd42a cd42b cd61 cd62p cd63 激活抗原激活抗原 cd26 cd30 cd69 cd95-cd97cd26 cd30 cd69 cd95-cd97 粘附分子粘附分子

12、 cd11a-c cd18 cd29 cd44 cd49a-fcd11a-c cd18 cd29 cd44 cd49a-f 內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞 cd105 cd106 cd109cd105 cd106 cd109 細(xì)胞因子受體細(xì)胞因子受體 cd25 cd115 cd117 cd122 cd126cd25 cd115 cd117 cd122 cd126cdcd抗原及其相關(guān)細(xì)胞群抗原及其相關(guān)細(xì)胞群淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量檢查項(xiàng)目和意義淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量檢查項(xiàng)目和意義疾病疾病cd3cd4cd8cd4/cd8nk自身免疫病自身免疫病降低降低增高增高降低降低降低降低aids降低降低嚴(yán)重降嚴(yán)重降低低增高增高降低降低s

13、ars降低降低降低降低降低降低降低降低降低降低慢性活動性肝慢性活動性肝炎、肝硬化炎、肝硬化降低降低正常或正?；蛟龈咴龈呓档徒档徒档徒档湍[瘤腫瘤降低降低降低降低增高增高降低降低降低降低用熒光標(biāo)記抗體用熒光標(biāo)記抗體抗體特異性地結(jié)合細(xì)抗體特異性地結(jié)合細(xì)胞上對應(yīng)的抗原胞上對應(yīng)的抗原表達(dá)該抗原的細(xì)胞被表達(dá)該抗原的細(xì)胞被標(biāo)記上熒光；標(biāo)記上熒光；抗原表達(dá)多的細(xì)胞熒抗原表達(dá)多的細(xì)胞熒光強(qiáng)度強(qiáng)光強(qiáng)度強(qiáng)陽性細(xì)胞百分陽性細(xì)胞百分比或濃度比或濃度靶蛋白濃度靶蛋白濃度淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞cdcd抗原的流式細(xì)胞檢測抗原的流式細(xì)胞檢測 造血系統(tǒng)干細(xì)胞造血系統(tǒng)干細(xì)胞 腫瘤干細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞 間充質(zhì)干細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞 神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)

14、干細(xì)胞 脂肪干細(xì)胞脂肪干細(xì)胞 干細(xì)胞研究干細(xì)胞研究熱門研究熱門研究(腫瘤腫瘤)干細(xì)胞干細(xì)胞l 腫瘤組織無限制的增殖在于腫瘤干細(xì)胞的存在腫瘤組織無限制的增殖在于腫瘤干細(xì)胞的存在l 目前研究的腫瘤干細(xì)胞來源于前列腺、乳腺等腫瘤目前研究的腫瘤干細(xì)胞來源于前列腺、乳腺等腫瘤l 腫瘤干細(xì)胞數(shù)量稀少，常規(guī)方法很難檢測腫瘤干細(xì)胞數(shù)量稀少，常規(guī)方法很難檢測l 目前研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞和正常細(xì)胞在目前研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞和正常細(xì)胞在hoechest 33342染料攝取方面有重大差別染料攝取方面有重大差別l 故流式細(xì)胞儀是分析和檢測腫瘤干細(xì)胞的重要工具故流式細(xì)胞儀是分析和檢測腫瘤干細(xì)胞的重要工具 干細(xì)胞能表達(dá)干細(xì)

15、胞能表達(dá)abcg2abcg2泵蛋白，在泵蛋白，在hoechst 33342hoechst 33342染染色時能將該染料泵出，因此分析不能被該染料染色時能將該染料泵出，因此分析不能被該染料染色的細(xì)胞群時可以發(fā)現(xiàn)一群不能染色的細(xì)胞既是色的細(xì)胞群時可以發(fā)現(xiàn)一群不能染色的細(xì)胞既是干細(xì)胞，因此能夠在眾多腫瘤細(xì)胞中區(qū)分出腫瘤干細(xì)胞，因此能夠在眾多腫瘤細(xì)胞中區(qū)分出腫瘤干細(xì)胞。干細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞中的研究應(yīng)用腫瘤干細(xì)胞中的研究應(yīng)用- -hoechst 33342 side populationhoechsthoechst+vera.side population cells細(xì)胞凋亡研究1. 鑒別凋亡與壞死鑒別凋

16、亡與壞死: annexin /pi2. 測定凋亡率測定凋亡率:annexin 、apo 27、tunel3. 研究凋亡觸發(fā)機(jī)制：研究凋亡觸發(fā)機(jī)制：caspase、fas及及fasl bcl-2/bax4. 多參數(shù)多參數(shù)分析凋亡是趨勢分析凋亡是趨勢g1s phaseg2mg112 1dna含量含量 dna 含量含量細(xì)胞周期時相細(xì)胞周期時相g0/1g2/ms細(xì)胞數(shù)細(xì)胞數(shù)細(xì)胞周期分析細(xì)胞周期分析piethidium bromideacridine orangedapi (uv excitable)hoechst 33342 (viable, uv excitable)不能主動進(jìn)入細(xì)胞，需要固定打孔4

17、88nm激發(fā)為脂溶性，主動進(jìn)入細(xì)胞uv激發(fā)常用的常用的dna 染料染料dna含量及細(xì)胞周期分析含量及細(xì)胞周期分析 細(xì)胞周期分析細(xì)胞周期分析: :在細(xì)胞周期在細(xì)胞周期(g0(g0，g1g1，s s，g2 g2 ，m)m)的各個時期，的各個時期，dnadna的含量隨各時相呈現(xiàn)出周期性的變的含量隨各時相呈現(xiàn)出周期性的變化。通過核酸染料標(biāo)記化。通過核酸染料標(biāo)記dnadna，并由流式細(xì)胞儀進(jìn)行分，并由流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，可以得到細(xì)胞各個時期的分布狀態(tài)，計(jì)算出析，可以得到細(xì)胞各個時期的分布狀態(tài)，計(jì)算出g0/g1%g0/g1%，s%s%及及g2/m%g2/m%。了解細(xì)胞的周期分布及細(xì)胞的。了解細(xì)胞的周期分布

18、及細(xì)胞的增殖活性。也可利用細(xì)胞周期蛋白（增殖活性。也可利用細(xì)胞周期蛋白（cyclincyclin）、）、ki67ki67、核增殖抗原（、核增殖抗原（pcnapcna）等，對細(xì)胞周期進(jìn)行精）等，對細(xì)胞周期進(jìn)行精確的分期：確的分期：g0g0、g1g1、s s、g2g2、m.m.g0/g1sg2/m流式細(xì)胞儀分選流式細(xì)胞儀分選u電荷式分選是當(dāng)前的主流分選模式電荷式分選是當(dāng)前的主流分選模式u高速分選是保證結(jié)果的基本條件高速分選是保證結(jié)果的基本條件u高純度和高活性是分選的基本要求高純度和高活性是分選的基本要求u可選的激光要多樣化（空冷、水冷、固體；不同可選的激光要多樣化（空冷、水冷、固體；不同的波長；真

19、正的紫外）的波長；真正的紫外）u提供多種分選流動室提供多種分選流動室u光路穩(wěn)定，紫外激光功率大光路穩(wěn)定，紫外激光功率大u流式分選和磁珠分選的差別和聯(lián)系流式分選和磁珠分選的差別和聯(lián)系488 nm laser+-charged platessingle cells sortedinto test tubesfals sensorfluorescence detector電荷式細(xì)胞分選電荷式細(xì)胞分選細(xì)胞分選的主要技術(shù)指標(biāo)細(xì)胞分選的主要技術(shù)指標(biāo) 分選速度：分選速度： 25000個細(xì)胞個細(xì)胞/秒秒 分選純度：分選純度：98% 分選后細(xì)胞存活率：分選后細(xì)胞存活率：97%before sortingafter sorting 三、流式細(xì)胞儀檢測的三、流式細(xì)胞儀檢測的一般步驟一般步驟 設(shè)置檢測方案（protocol)染色標(biāo)本（同型對照，補(bǔ)償管，檢測抗體）同型對照管調(diào)電壓電壓不變，補(bǔ)償管調(diào)補(bǔ)償電壓不變，補(bǔ)償不變，上檢測管檢測后直接