氣相色譜基本原理

1、分流 /不分流進(jìn)樣選至氣相色譜方法及應(yīng)用一、進(jìn)樣口結(jié)構(gòu)分流 /不分流進(jìn)樣口是毛細(xì)管GC 最常用的進(jìn)樣口，它既可用作分流進(jìn)樣，也可用作不分流進(jìn)樣口圖4-2 是典型的分流 /不分流進(jìn)樣口示意圖。從結(jié)構(gòu)上看，分流/不分流進(jìn)樣口與填充柱進(jìn)樣有明顯的不同，一是前者有分流氣出口及其控制裝置，二是除了進(jìn)樣口前有一個控制閥外，在分流氣路上還有一個柱前壓調(diào)節(jié)閥，二是二者使用的襯管結(jié)構(gòu)不同。而分流進(jìn)樣和不分流進(jìn)樣在操作參數(shù)的設(shè)置，對樣品的要求以及襯管結(jié)構(gòu)方面也有很大區(qū)別，下面分別討論之。二、分流進(jìn)樣(一 )載氣流路和襯管選擇分流進(jìn)樣時載氣流路如圖4-2a 所示。進(jìn)入進(jìn)樣口的載氣總流量由一個總流量閥控制，而后載氣分

2、成兩部分: 一是隔墊吹掃氣(1 3mL/min) ，二是進(jìn)入汽化室的載氣。進(jìn)入汽化室的載氣與樣品氣體混合后又分為兩部分：大部分經(jīng)分流出口放空，小部分進(jìn)樣色譜柱。以總流量為 104 m1/min 為例，如果隔墊吹掃氣流設(shè)置為3m1/min ，則另 101mL/min進(jìn)入汽化室。當(dāng)分流流量為100mL/min時。柱內(nèi)流量為lml/min ，這時分流比為100:1 。注意。此儀器設(shè)計將柱前壓調(diào)節(jié)閥置于分流氣路上，這就可在總流量不變的情況下，改變柱前壓。 柱前壓越高，柱流速越大，分析速度越快。而要在柱前壓不變(柱流速不變 )的條件下改變分流比，則必須調(diào)節(jié)總流最?？偭髁吭酱?，分流比越大。分流進(jìn)樣口可采用

3、多種襯管，用于分流進(jìn)樣的襯管大都不是直通的，管內(nèi)有縮徑處或者燒結(jié)板，或者有玻瑞珠，或者填充有玻璃毛。這主要是為了增大.與樣品接觸的比表面，保證樣品完全汽化 .減小分流歧視見下面關(guān)于分流歧視問題的討論)。同時也是為了防止固體顆粒和不揮發(fā)的樣品組分進(jìn)入色譜柱。注意，填充物應(yīng)位于襯管的中間，即溫度最高的地方，也是注射器針尖所到達(dá)的地方，這樣對提高汽化效率， 減少注射器針尖對樣品的歧視更為有效。另外，玻璃毛活性較大，不適合于分析極性化合物。此時可用經(jīng)硅烷化處理的石英玻璃毛。襯管的上端常用“O”形硅橡膠環(huán)密封。用一段時間后該環(huán)會老化而造成漏氣。故要及時更換。當(dāng)進(jìn)樣口溫度超過400 時，最好采用石墨密封環(huán)

4、。(二 )樣品的適用性分流進(jìn)樣適合于大部分可揮發(fā)樣品，包括液體和氣體樣品，特別是對一些化學(xué)試劑(如將劑 )的分折。 因?yàn)槠渲幸恍┙M分會在主峰前流出。而且樣品不能稀釋、故分流進(jìn)樣住往是理想的選擇。 此外，在毛細(xì)管GC 的方法開發(fā)過程中，如果對樣品的組成不很清楚。也應(yīng)首先采用分流進(jìn)樣口對于一些相對“臟” 的樣品，更應(yīng)采用分流進(jìn)樣，因?yàn)榉至鬟M(jìn)樣時大部分樣品被放空， 只有一小部分樣品進(jìn)入色譜柱，這在很大程度上防止了柱污染。只是在分流進(jìn)樣不能滿足分析要求時（靈敏度太低），才考慮其他進(jìn)樣方式，如不分流進(jìn)樣和柱上進(jìn)_ 樣等。總之， 分流進(jìn)樣的適用范圍寬，靈話性很大。 分流比可調(diào)范圍廣，故成為毛細(xì)管GC 的首

5、選進(jìn)樣方式。三) 操作參數(shù)設(shè)置1.溫度進(jìn)樣口溫度應(yīng)接近于或等于樣品中最重組分的沸點(diǎn)，以保證樣品快速汽化，減小初始譜帶寬度。但溢度太高有使樣品組分分解的可能性。對于個未知的新樣品?？蓪⑦M(jìn)樣口溫度設(shè)置為300 度進(jìn)行試驗(yàn)。2.載氣流速常用毛細(xì)管GC 所用柱內(nèi)載氣線流速為：氦氣30 50cm/s ，氮?dú)?20 40cm/s ，氫氣 40 60cm/s 。實(shí)際流速可通過測定死時間來計算，通過調(diào)節(jié)柱前從來控制。對于分流進(jìn)樣，還要測定隔墊吹掃氣流量和分流流量，前者一般為2 3mL/min ，后者則要依據(jù)樣品情況 (如待側(cè)組分濃度等 )、進(jìn)樣量大小和分析要求來改變。常用分流比范圍為 20:1 200:1 ，

6、樣品濃度大或進(jìn)樣量大時，分流比可相應(yīng)增大，反之則減小。用大口徑柱時分流比小一些(或采用不分流進(jìn)樣 )。用微徑柱作快速 GC 分析時，分流比要求很大(如 1000:1 或更高 )。另一方面，分流比小時， 分流歧視 (見下面關(guān)于分流歧視問題的討論)效應(yīng)可能小一些， 但初始譜帶 (主要是溶劑譜帶 )寬度要大一些。必要時可采用聚焦技術(shù)。而分流比大時，初始譜帶寬度小，但分流歧視效應(yīng)可能會增大。所以，在實(shí)際工作中應(yīng)據(jù)樣品情況和分析要求選擇一個合適的折衷點(diǎn)。3.進(jìn)樣量和進(jìn)樣速度分流進(jìn)樣的進(jìn)樣量一般不超過2L, 最好控制在0.5 L 以下，因?yàn)橐r管的容積有限，液體汽化時體積要膨脹數(shù)百倍(見表4-1) 。當(dāng)然。

7、進(jìn)樣量還和分流比是相關(guān)的，分流比大時，進(jìn)樣量可大一些。 至于進(jìn)樣速度應(yīng)當(dāng)越快越好，一是防止不均勻汽化，二是保持窄的初始譜帶寬度。因此，快速自動進(jìn)樣往往比手動進(jìn)樣的效果好。(四 )分流歧視問題所謂分流歧視是指在一定分流比條件下，不同樣品組分的實(shí)際分流比是不同的，這就會造成進(jìn)入色譜柱的樣品組成不同于原來的樣品組成，從而影響定是分析的準(zhǔn)確度。因此，采用分流進(jìn)樣時必須注意這個問題。那么，是什么因素造成分流歧視的呢？不均勻汽化是分流歧視的上要原因之一，即由于樣品中各組分的極性不同，沸點(diǎn)各異， 因而汽化速度各不相同。 理論上講， 只要汽化溫度足夠高，就能使樣品的全部組分迅速汽化。只要汽化室內(nèi)樣品處于均相氣

8、體狀態(tài)，分流歧視就是可以忽略的。 然而，實(shí)際上樣品在汽化室是處于一種運(yùn)動狀態(tài)， 即必須隨載氣流動。 從汽化室汽化到進(jìn)入色譜柱的時間很短(以秒計 )，沸點(diǎn)不同的組分到達(dá)分流點(diǎn)時，汽化狀態(tài)可能不完全相同。 這樣，由于分流流最遠(yuǎn)大于柱內(nèi)流量，汽化不太完全的組分就比完全汽化的組分可能多分流掉一些樣品。造成分流歧視的另外一個原因是不同樣品組分在載氣中的擴(kuò)散速度不同。而擴(kuò)散速度與溫度是成正比的。 所以。盡量使樣品快速汽化是消除分流歧視的重要措施，包括采用較高的汽化溫度，也包括使用合適的襯管。分流比的大小也會影響分流歧視口一般地講，分流比越大，越有可能造成分流歧視口所以，在樣品濃度和柱容量允許的條件下，分流

9、比小一些有利。至于分流比的測定定是很簡單的，只要在分流出口用皂膜流量計測定分流流量，再測定柱內(nèi)流量 ( 因?yàn)橹鶅?nèi)流量很小，用皂膜流量計測定時誤差較大，故常用測定死時間的辦法進(jìn)行流量計算 )。二者之比即為分流比。嚴(yán)格地講， 兩個流量值應(yīng)校正到相同的溫度和壓力條件下， 才能獲得準(zhǔn)確的分流比。 實(shí)際工作中人們更關(guān)心的是分流比的重現(xiàn)性， 分流比則常用整數(shù)之比表示， 故一般不需要很準(zhǔn)確地測定。具體分析中要消除分流歧視， 還應(yīng)注意色譜柱的初始溫度盡可能高一些。 這樣，汽化溫度和柱箱溫度之差就會小一些， 因而樣品在汽化室經(jīng)歷的溫度梯度就會小一些， 可避免汽化后的樣品發(fā)生部分冷凝。 最后一個問題是色譜柱的安裝

10、， 一是要保證柱入口端超過了分流點(diǎn)。 二是保證柱入口端處于汽化室襯管的中央，即汽化室內(nèi)色譜柱與襯管是同軸的 ( 參看上一章有關(guān)色譜柱安裝的內(nèi)容 )。盡管分流進(jìn)樣有歧視間題，但它仍然是毛細(xì)管GC 中最常用的進(jìn)樣方式。在實(shí)際工作中。 分流歧視是很難完全消除的，但只要操作是重現(xiàn)的，一定程度的歧視是重現(xiàn)的。就可以通過標(biāo)準(zhǔn)樣品的校準(zhǔn)來消除歧視效應(yīng)對定量精度的影響另一方面。 由于分流進(jìn)樣給檢測靈敏度提出了更高的要求， 而當(dāng)樣品濃度太低時。 分流進(jìn)樣并不總是合適的選擇。除了進(jìn)行樣品預(yù)處理 (如濃縮 )外。讀者很容易想到不分流進(jìn)樣。既然分流進(jìn)樣是因?yàn)橹萘啃　?樣品濃度高而不得不采用的方法。 那么低濃度樣品采

11、用不分流進(jìn)樣，以提高檢測靈敏度就是理所當(dāng)然的選擇了。三、不分流進(jìn)樣(一 ) 載氣流路和襯管選擇不分流進(jìn)樣與分流進(jìn)樣采用同一個進(jìn)樣口， 顧名思義， 不分流進(jìn)樣就是將分流氣路的電磁閥關(guān)閉 圖 4-2(b) ，讓樣品全部進(jìn)入色潛柱。這樣做的好處是顯而易見的，既可提高分析靈敏度，又能消除分流歧視的影響。 然而，在實(shí)際工作中、不分流進(jìn)樣的應(yīng)用遠(yuǎn)沒有分流進(jìn)樣普遍，只是在分流進(jìn)樣不能滿足分析要求時 (主要是靈敏度要求 )，才考慮使用不分流進(jìn)樣。這是因?yàn)椴环至鬟M(jìn)樣的操作條件優(yōu)化較為復(fù)雜。 對操作技術(shù)的要求高。 其中一個最突出的問題是樣品初始譜帶較寬 (樣品汽化后的體積相對于柱內(nèi)載氣流量太大 )。汽化的樣品中溶

12、劑是大量的， 不可能瞬間進(jìn)入色譜柱， 結(jié)果溶劑峰就會嚴(yán)重拖尾， 使早流出組分的峰被掩蓋在溶劑拖尾峰中 如圖 4-3(a) 所示 ，從而使分析變得困難，甚至不可能。有人也將這一現(xiàn)象叫做溶劑效應(yīng)。消除這種溶劑效應(yīng)可從幾個方面考慮，但就載氣的流路來說，主要是采用所謂瞬間不分流技術(shù)。即進(jìn)樣開始時關(guān)閉分流電磁閥，使系統(tǒng)處于不分流狀態(tài)圖 4-2(b) 。待大部分汽化的樣品進(jìn)入色醉柱后，開啟分流閥，使系統(tǒng)處于分流狀態(tài)圖 4-2(a) 。這樣，汽化室內(nèi)殘留的溶劑氣體 (當(dāng)然包括一小部分樣品組分)就很快從分流出口放空，從而在很大程度上消除了溶劑拖尾 如圖 4-2(b) 所示 。分流狀態(tài)一直持續(xù)到分析結(jié)束，注射下

13、一個樣品時再關(guān)閉分流閥。所以我們說，不分流進(jìn)樣并不是絕對不分流，而是分流與不分流的結(jié)合。這里，確定一個瞬間不分流時間 (從進(jìn)樣到開啟分流閥的時間)往往是分析成敗的關(guān)鍵。原則上講，這一時間應(yīng)足夠長。以保證絕大部分樣品進(jìn)人色譜柱，避免分流歧視的影響；同時又要盡可能短， 以最大限度地消除溶劑搶尾、使早流出峰的分析更為準(zhǔn)確。這顯然是有矛盾的。在實(shí)際工作中，常常是根據(jù)樣品的具體情況(如溶劑沸點(diǎn)、 待測組分沸點(diǎn)和濃度等 )或操作條件來確定一個優(yōu)化的折衷點(diǎn)。研究結(jié)果表明，這一時間值一般在30 80S 之間。文獻(xiàn)報道多采用0.75min ，即從進(jìn)樣到開啟分流閥的時問為0.75min ，通常能保證 95% 以上

14、的樣品進(jìn)入色譜柱，本節(jié)后而將介紹如何用實(shí)驗(yàn)方法確定優(yōu)化的不分流時間。襯管的尺寸是影響不分流進(jìn)樣性能的另一個重要因素。為了使樣品在汽化室盡可能少地稀釋，從而減小初始譜帶寬度，襯管的容積小一些有利，一般為0.25 1mL ，且最好使用直通式襯管。 當(dāng)用自動進(jìn)樣器進(jìn)樣時，因進(jìn)樣速度快，樣品揮發(fā)快，故建議采用容積稍大一些的直通式襯管。 對于干凈樣品，襯管內(nèi)可不填充玻璃毛，對于相對臟的樣品，則需要填充玻瑞或石英毛， 以保證分析的重現(xiàn)性并保護(hù)色譜柱不被污染。但要注意， 由于不分流進(jìn)樣時樣品在汽化室滯留的時間比分流進(jìn)樣時長，熱不穩(wěn)定化合物的分解可能性也大，故襯管和其中填充的石英毛都必須經(jīng)硅烷化處理，且要及時

15、清洗，更換和重新硅烷化。(二 )樣品的適用性不分流進(jìn)樣具有明顯高于分流進(jìn)樣的靈敏度，它通常用于環(huán)境分析(如水和大氣中痕量污染物的檢測 )、食品中的農(nóng)藥殘留監(jiān)測，以及臨床和藥物分析等。這些藥品往往都比較臟，所以樣品的預(yù)處理是保護(hù)色譜柱所必須注意的問題。此外，待測痕量組分如果在溶劑拖尾處出蜂，還可采用溶劑聚焦的方法來提高分析靈敏度。不分流進(jìn)樣對樣品溶劑有較嚴(yán)格的要求。因?yàn)檫M(jìn)樣口溫度、色譜柱初始溫度、瞬間不分流的時間和進(jìn)樣體積都與溶劑沸點(diǎn)有關(guān)。一般地講， 使用高沸點(diǎn)溶劑比低沸點(diǎn)溶劑有利，因?yàn)槿軇┓悬c(diǎn)高時， 容易實(shí)現(xiàn)溶劑聚焦，且可使用較高的色譜柱初始溫度，還可降低注射器針尖歧視以及汽化室的壓力突變。表

16、 4-2 列出了常見的溶劑及其沸點(diǎn)和實(shí)現(xiàn)溶劑聚焦宜采用的色譜柱初始溫度。另一方面， 洛劑的極性一定要與樣品的極性相匹配，且要保證溶劑在所有被測樣品組分之前出峰， 否則早流出的峰就會被溶劑的大峰掩蓋。同時，溶劑還要與固定相匹配，才能實(shí)現(xiàn)有效的溶劑聚焦。必要時可采用保留間隙管來達(dá)到聚焦的目的。對于高沸點(diǎn)痕量組分的分析，不分流進(jìn)樣就容易多了。此時可以不考慮溶劑的沸點(diǎn)，因?yàn)橛兄芏ㄏ嗑劢咕屯耆鼙ＷC窄的初始譜帶，采用高的初始柱溫還可縮短分析時間。事實(shí)上， 不分流進(jìn)樣應(yīng)是分析高沸點(diǎn)痕最組分的首選方法。(三 )操作參數(shù)設(shè)置(1) 進(jìn)樣口溫度 進(jìn)樣口溫度的設(shè)置可以比分流進(jìn)樣時稍低一些，因?yàn)椴环至鬟M(jìn)樣時樣品在汽

17、化室滯留時問長，汽化速度稍慢一些不會影響分離結(jié)果，還可通過溶劑聚焦和/或固定相聚焦來補(bǔ)償汽化速度慢的問題。不過，進(jìn)樣口溫度的低限是能保證待測組分在瞬間不分流時完全汽化，否則，過低的進(jìn)樣口溫度會造成高沸點(diǎn)組分的損失，影響分析靈敏度和重現(xiàn)性。當(dāng)然，過高的溫度又會造成樣品的分解。因此，要根據(jù)樣品的具體情況優(yōu)化進(jìn)樣口溫度。而當(dāng)改變進(jìn)樣口溫度后，又必須重新優(yōu)化設(shè)置瞬間不分流時間 :.(2) 載氣流速 從減小初始譜帶寬度的角度考慮，不分流進(jìn)樣的載氣流速應(yīng)當(dāng)高一些，其上限應(yīng)以保證分離度為準(zhǔn)。分流出口的流量 (開啟分流閥后 )一般為 30 60mL/min 。只要開啟分流閥的時間設(shè)置正確，分流出口流最在此范圍

18、內(nèi)變化對分析結(jié)果的影響很小。(3) 進(jìn)樣量和進(jìn)樣速度 進(jìn)樣量一般不超過 2L 。進(jìn)樣量大時應(yīng)選用容積大的襯管， 否則會發(fā)生樣品倒灌。進(jìn)樣速度則應(yīng)快一些， 最好用自動進(jìn)樣器。 若采用手動進(jìn)樣， 進(jìn)樣速度的重現(xiàn)性會影響分析結(jié)果。(4) 瞬間不分流時間的實(shí)驗(yàn)確定方法如前文所述， 瞬間不分流時間(也有人叫分流延遲時間、溶劑吹掃時間 )的確定依賴于樣品和溶劑的性質(zhì)，襯管的容積、進(jìn)樣最，進(jìn)樣速度以及載氣流速。所以這一時問的確定應(yīng)在其余所有條件都確定之后進(jìn)行。下面介紹一個簡單的實(shí)驗(yàn)確定方法。首先將這一時間設(shè)置長一些擇一個待測組分的峰面積(90 120s) ，以保證全部樣品組分進(jìn)入色譜柱。對樣品進(jìn)行分析之后，

19、選(該峰的k 值應(yīng)大于5) 作為測定指標(biāo)，該峰面積值就代表100 的樣品進(jìn)入了色譜柱。然后逐步縮短不分流時間(如 70, 50, 30s) 分別進(jìn)樣分析，計算同一組分在不同溶劑吹掃時間條件下的峰面積與第一次分析的峰面積之比，直到此比值小于0.95, 此時的不分流時間為最短時間。最后，再進(jìn)一步微調(diào)不分流時，使同一組分的峰面積達(dá)到第一次分析時峰面積的95%-99 ，此時的吹掃時間即為最佳條件。對于高沸點(diǎn)樣品， 不分流時間長一些有利于提高分析靈敏度。而不影響測定準(zhǔn)確度；對于低沸點(diǎn)樣品。則要盡可能使不分流時間短一些，最大限度地消除溶劑拖尾，以保證分析準(zhǔn)確度。對于熱不穩(wěn)定的化合物，最好用下節(jié)將要介紹的冷

20、柱上進(jìn)樣技術(shù)。什么叫內(nèi)標(biāo)法 ? 怎樣選擇內(nèi)標(biāo)物 ?內(nèi)標(biāo)法是一種間接或相對的校準(zhǔn)方法。在分析測定樣品中某組分含量時，加入一種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)以校誰和消除出于操作條件的波動而對分析結(jié)果產(chǎn)生的影響，以提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度。內(nèi)標(biāo)法在氣相色譜定量分析中是一種重要的技術(shù)。使用內(nèi)標(biāo)法時， 在樣品中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)， 它可被色譜拄所分離，又不受試樣中其它組分峰的干擾，只要測定內(nèi)標(biāo)物和待測組分的峰面積與相對響應(yīng)值， 即可求出待測組分在樣品中的百分含量。采用內(nèi)標(biāo)法定量時， 內(nèi)標(biāo)物的選擇是一項(xiàng)十分重要的工作。理想地說，內(nèi)標(biāo)物應(yīng)當(dāng)是一個能得到純樣的己知化合物，這樣它能以準(zhǔn)確、 已知的量加到樣品中去，它應(yīng)當(dāng)和被分析的樣品組

21、分有基本相同或盡可能一致的物理化學(xué)性質(zhì) (如化學(xué)結(jié)構(gòu)、極性、揮發(fā)度及在溶劑中的溶解度等)、色譜行為和響應(yīng)特征， 最好是被分析物質(zhì)的一個同系物。當(dāng)然，在色譜分析條什下，內(nèi)標(biāo)物必須能與樣品中各組分充分分離。 需要指出的是， 在少數(shù)情況下， 分析人員可能比較關(guān)心化臺物在一個復(fù)雜過程中所得到的回收率， 此時，他可以使用一種在這種過程中很容易被完全回收的化臺物作內(nèi)標(biāo)，來測定感興趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所說的選擇原則。在使用內(nèi)標(biāo)法定量時，有哪些因素會影響內(nèi)標(biāo)和被測組分的峰高或峰面積的比值?影響內(nèi)標(biāo)和被測組分峰高或峰面積比值的因素主要有化學(xué)方面的、色譜方面的和儀器方面的三類。由化學(xué)方面的原因產(chǎn)生

22、的面積比的變化常常在分析重復(fù)樣品時出現(xiàn)?；瘜W(xué)方面的因素包括：1、內(nèi)標(biāo)物在樣品里混合不好；2、內(nèi)標(biāo)物和樣品組分之間發(fā)生反應(yīng)，3、內(nèi)標(biāo)物純度可變等。對于一個比較成熟的方法來說，色譜方面的問題發(fā)生的可能性更大一些，色譜上常見的一些問題 (如滲漏 )對絕對面積的影響比較大，對面積比的影響則要小一些，但如果絕對面積的變化已大到足以使面積比發(fā)生顯著變化的程度，那么一定有某個重要的色譜問題存在，比如進(jìn)樣量改變太大， 樣品組分濃度和內(nèi)標(biāo)濃度之間有很大的差別，檢測器非線性等。 進(jìn)樣量應(yīng)足夠小并保持不變， 這樣才不致于造成檢測器和積分裝置飽和。如果認(rèn)為方法比較可靠，而色譜固看來也是正常的話， 應(yīng)著重檢查積分裝置和

23、設(shè)置、 斜率和峰寬定位。 對積分裝置發(fā)生懷疑的最有力的證據(jù)是：面積比可變，而峰高比保持相對恒定，在制作內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線時應(yīng)注意什么?在用內(nèi)標(biāo)法做色話定量分析時，先配制一定重量比的被測組分和內(nèi)標(biāo)樣品的混合物做色譜分析，測量峰面積，做重量比和面積比的關(guān)系曲線，此曲線即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。在實(shí)際樣品分析時所采用的色譜條件應(yīng)盡可能與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時所用的條件一致，因此，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時，不僅要注明色譜條件(如固定相、柱溫、載氣流速等)，還應(yīng)注明進(jìn)樣體積和內(nèi)標(biāo)物濃度。在制作內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線時，各點(diǎn)并不完全落在直線上，此時應(yīng)求出面積比和重量比的比值與其平均位的標(biāo)準(zhǔn)偏差，在使用過程中應(yīng)定期進(jìn)行單點(diǎn)校正，若所得值與平均值的偏差

24、小于2，曲線仍可使用，若大于2，則應(yīng)重作曲線，如果曲線在鉸短時期內(nèi)即產(chǎn)生變動，則不宜使用內(nèi)標(biāo)法定量。一、內(nèi)標(biāo)法什么叫內(nèi)標(biāo)法 ?怎樣選擇內(nèi)標(biāo)物 ?內(nèi)標(biāo)法是一種間接或相對的校準(zhǔn)方法。在分析測定樣品中某組分含量時，加入一種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)以校誰和消除出于操作條件的波動而對分析結(jié)果產(chǎn)生的影響，以提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度。內(nèi)標(biāo)法在氣相色譜定量分析中是一種重要的技術(shù)。使用內(nèi)標(biāo)法時， 在樣品中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)， 它可被色譜拄所分離，又不受試樣中其它組分峰的干擾，只要測定內(nèi)標(biāo)物和待測組分的峰面積與相對響應(yīng)值，即可求出待測組分在樣品中的百分含量。采用內(nèi)標(biāo)法定量時， 內(nèi)標(biāo)物的選擇是一項(xiàng)十分重要的工作。理想地說， 內(nèi)標(biāo)物應(yīng)

25、當(dāng)是一個能得到純樣的己知化合物， 這樣它能以準(zhǔn)確、 已知的量加到樣品中去，它應(yīng)當(dāng)和被分析的樣品組分有基本相同或盡可能一致的物理化學(xué)性質(zhì)(如化學(xué)結(jié)構(gòu)、極性、揮發(fā)度及在溶劑中的溶解度等 ) 、色譜行為和響應(yīng)特征，最好是被分析物質(zhì)的一個同系物。當(dāng)然，在色譜分析條什下，內(nèi)標(biāo)物必須能與樣品中各組分充分分離。需要指出的是，在少數(shù)情況下，分析人員可能比較關(guān)心化臺物在一個復(fù)雜過程中所得到的回收率，此時，他可以使用一種在這種過程中很容易被完全回收的化臺物作內(nèi)標(biāo)，來測定感興趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所說的選擇原則。在使用內(nèi)標(biāo)法定量時，有哪些因素會影響內(nèi)標(biāo)和被測組分的峰高或峰面積的比值?影響內(nèi)標(biāo)和被測組分

26、峰高或峰面積比值的因素主要有化學(xué)方面的、面的三類。由化學(xué)方面的原因產(chǎn)生的面積比的變化常常在分析重復(fù)樣品時出現(xiàn)。化學(xué)方面的因素包括：1、內(nèi)標(biāo)物在樣品里混合不好；2、內(nèi)標(biāo)物和樣品組分之間發(fā)生反應(yīng)，3、內(nèi)標(biāo)物純度可變等。色譜方面的和儀器方對于一個比較成熟的方法來說， 色譜方面的問題發(fā)生的可能性更大一些， 色譜上常見的一些問題 (如滲漏 )對絕對面積的影響比較大，對面積比的影響則要小一些，但如果絕對面積的變化已大到足以使面積比發(fā)生顯著變化的程度，那么一定有某個重要的色譜問題存在，比如進(jìn)樣量改變太大，樣品組分濃度和內(nèi)標(biāo)濃度之間有很大的差別，檢測器非線性等。進(jìn)樣量應(yīng)足夠小并保持不變，這樣才不致于造成檢測器

27、和積分裝置飽和。如果認(rèn)為方法比較可靠，而色譜固看來也是正常的話，應(yīng)著重檢查積分裝置和設(shè)置、斜率和峰寬定位。 對積分裝置發(fā)生懷疑的最有力的證據(jù)是：面積比可變， 而峰高比保持相對恒定在制作內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線時應(yīng)注意什么?在用內(nèi)標(biāo)法做色話定量分析時，先配制一定重量比的被測組分和內(nèi)標(biāo)樣品的混合物做色譜分析，測量峰面積，做重量比和面積比的關(guān)系曲線，此曲線即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。在實(shí)際樣品分析時所采用的色譜條件應(yīng)盡可能與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時所用的條件一致，因此，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時，不僅要注明色譜條件(如固定相、柱溫、載氣流速等)，還應(yīng)注明進(jìn)樣體積和內(nèi)標(biāo)物濃度。在制作內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線時，各點(diǎn)并不完全落在直線上，此時應(yīng)求出面積比和重量比

28、的比值與其平均位的標(biāo)準(zhǔn)偏差，在使用過程中應(yīng)定期進(jìn)行單點(diǎn)校正，若所得值與平均值的偏差小于2，曲線仍可使用，若大于2，則應(yīng)重作曲線，如果曲線在鉸短時期內(nèi)即產(chǎn)生變動，則不宜使用內(nèi)標(biāo)法定量。二、外標(biāo)法用待測組分的純品作對照物質(zhì)，以對照物質(zhì)和樣品中待測組分的響應(yīng)信號相比較進(jìn)行定量的方法稱為外標(biāo)法。 此法可分為工作曲線法及外標(biāo)一點(diǎn)法等。工作曲線法是用對照物質(zhì)配制一系列濃度的對照品溶液確定工作曲線，求出斜率、截距。 在完全相同的條件下，準(zhǔn)確進(jìn)樣與對照品溶液相同體積的樣品溶液，根據(jù)待測組分的信號，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度，或用回歸方程計算， 工作曲線法也可以用外標(biāo)二點(diǎn)法代替。通常截距應(yīng)為零，若不等于零說明存在系

29、統(tǒng)誤差。工作曲線的截距為零時，可用外標(biāo)一點(diǎn)法(直接比較法 )定量。外標(biāo)一點(diǎn)法是用一種濃度的對照品溶液對比測定樣品溶液中i 組分的含量。 將對照品溶液與樣品溶液在相同條件下多次進(jìn)樣，測得峰面積的平均值，用下式計算樣品中i 組分的量：W A(W) (A)式中 W 與 A 分別代表在樣品溶液進(jìn)樣體積中所含i 組分的重量及相應(yīng)的峰面積。(W)及(A) 分別代表在對照品溶液進(jìn)樣體積中含純品 i 組分的重量及相應(yīng)峰面積。外標(biāo)法方法簡便，不需用校正因子， 不論樣品中其他組分是否出峰， 均可對待測組分定量。 但此法的準(zhǔn)確性受進(jìn)樣重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定性的影響。 此外，為了降低外標(biāo)一點(diǎn)法的實(shí)驗(yàn)誤差， 應(yīng)盡量使配制

30、的對照品溶液的濃度與樣品中組分的濃度相近。外標(biāo)法externalstandardmethod色譜分析中的一種定量方法，它不是把標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加入到被測樣品中， 而是在與被測樣品相同的色譜條件下單獨(dú)測定，把得到的色譜峰面積與被測組分的色譜峰面積進(jìn)行比較求得被測組分的含量。外標(biāo)物與被測組分同為一種物質(zhì)但要求它有一定的純度，分析時外標(biāo)物的濃度應(yīng)與被測物濃度相接近，以利于定量分析的準(zhǔn)確性。三、定量分析中怎樣選擇內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法(來源：藥物分析網(wǎng)）選一與欲測組分相近但能完全分離的組分做內(nèi)標(biāo)物（當(dāng)然是樣品中沒有的組分），然后配制欲測組分和內(nèi)標(biāo)物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣得相對校正因子。再將內(nèi)標(biāo)物加入欲測組分的樣品中，進(jìn)

31、樣后測得欲測組分和內(nèi)標(biāo)物的定量參數(shù)。用內(nèi)標(biāo)法公式計算即可。內(nèi)標(biāo)法是將一定量的純物質(zhì)作內(nèi)標(biāo)物，加入到準(zhǔn)確稱量的試樣中，根據(jù)被測試樣和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量比及其相應(yīng)的色譜峰面積之比，來計算被測組分的含量。選擇內(nèi)標(biāo)物有 4 個要求： 1.內(nèi)標(biāo)物應(yīng)是該試樣中不存在的純物質(zhì)；2.它必須完全溶于試樣中，并與試樣中各組分的色譜峰能完全分離； 3.加入內(nèi)標(biāo)物的量應(yīng)接近于被測組分；4.色譜峰的位置應(yīng)與被測組分的色譜峰的位置相近，或在幾個被測組分色譜峰中間。內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)是測定的結(jié)果較為準(zhǔn)確，由于通過測量內(nèi)標(biāo)物及被測組分的峰面積的相對值來進(jìn)行計算的，因而在一定程度上消除了操作條件等的變化所引起的誤差。內(nèi)標(biāo)法的缺點(diǎn)是操作程序

32、較為麻煩，每次分析時內(nèi)標(biāo)物和試樣都要準(zhǔn)確稱量， 有時尋找合適的內(nèi)標(biāo)物也有困難。外標(biāo)法簡便， 但進(jìn)樣量要求十分準(zhǔn)確，要嚴(yán)格控制在與標(biāo)準(zhǔn)物相同的操作條件下進(jìn)行，否則造成分析誤差， 得不到準(zhǔn)確的測量結(jié)果。內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)都是定量的一種方法而已，至于哪一種方法好與不好不能一概而論，做不同的分析，面對著不同的要求，再加上分析成本分析效率等等問題，我想簡單而有效進(jìn)行定量分析來滿足要求才是最重要的1、以前做過很多醫(yī)藥、 農(nóng)藥中間體的芳香族鹵代化合物的常量定量分析，沒有自動進(jìn)樣器，用外標(biāo)法定量， 確實(shí)重現(xiàn)性與穩(wěn)定性非常差，結(jié)果經(jīng)常受到搞合成同事的質(zhì)疑。其實(shí)，仔細(xì)分析原因不一定就是外標(biāo)法不適合這種定量分析，首先我們的

33、實(shí)驗(yàn)室儀器和手段是否調(diào)整到一種穩(wěn)定而合理的狀態(tài)了，比如，襯管是否潔凈，玻璃棉的位置是否合適恰當(dāng)（能否使樣品盡可能的汽化） 、汽化溫度是否合適、色譜峰形是否對稱（也就是樣品與色譜柱健合相是否匹配）、附近有沒有其它色譜峰的干擾、選用什么進(jìn)樣方式（如快速進(jìn)樣還是熱針進(jìn)樣）等等因素的影響都需要考慮， 如果這些因素都考慮了， 按照 GMP 方法驗(yàn)證對于精密度的要求，同一樣品進(jìn) 6 針以上的 RSD 和配制 6 個樣品的定量結(jié)果 RSD 都能滿足小于1.5% 的要求，那么這個方法用外標(biāo)法就是完全適用的，但是前面的影響因素是一定要都考慮到的，否則談?wù)撨@個方法是否適用就有失偏頗了。在做過的許多出口產(chǎn)品的定量分

34、析方法當(dāng)中有許多是一些醫(yī)藥公司提供的比較完善而驗(yàn)證過的方法，內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)都有 （他們用的都是自動進(jìn)樣）精密度都能滿足 RSD 小于 1.5% 的要求，當(dāng)一個方法能夠滿足測試要求的時候，無論內(nèi)標(biāo)外標(biāo)，都是可行的，當(dāng)然有一個分析成本和分析時間的問題，內(nèi)標(biāo)的成本和控制溶液、樣品溶液的配制當(dāng)然要比外標(biāo)要高和麻煩一些了。而有些時候， 可能受你實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有儀器和附屬設(shè)備的影響，達(dá)不到一定的要求，而還必須進(jìn)行定量分析，有時外標(biāo)的結(jié)果可能就要差一些，這時， 你可能就要考慮用內(nèi)標(biāo)法了，可以排除手動進(jìn)樣的誤差、分流歧視的影響、包括一些未知因素平行誤差的影響，這時內(nèi)標(biāo)可能就顯示出它的優(yōu)勢來了。2、上面已經(jīng)提到當(dāng)做方法驗(yàn)

35、證的時候，當(dāng)同一樣品配制6 個樣品溶液用所選用的外標(biāo)法進(jìn)行定量的時候，RSD 都滿足 1.5% 的要求時，也分為兩種情況，小于1% 和大于 1% 小于 1.5% 。如果 RSD 的結(jié)果小于1% ，那這個方法就沒有什么可以懷疑的了；如果RSD 的結(jié)果大于 1% 而在1.5% 略低一些的范圍活動時，這個方法的可行性就將受到質(zhì)疑，畢竟這是方法驗(yàn)證，你就要考慮上面1 所提到的影響因素的影響了，如果排除掉以上的影響因素，RSD 還是在 1.5% 附近，就要嘗試內(nèi)標(biāo)了，如果內(nèi)標(biāo)結(jié)果的RSD 很好，就證明你的這個方法受實(shí)驗(yàn)條件的影響很大，只能用內(nèi)標(biāo)了， 或者干脆將原方法做大的變動，再嘗試用外標(biāo)法測試。3、而

36、對于微量分析，比如農(nóng)藥和獸藥殘留的分析、環(huán)境分析等，根據(jù)不同的限量標(biāo)準(zhǔn)要求對于精密度的要求也比常量分析的要求要寬松的多，RSD 有時可以允許達(dá)到10% 甚至更高，這時可能外標(biāo)法有更大的應(yīng)用空間4、單從精密度方面去考慮，排除其它成本和效率的因素，個人認(rèn)為還是內(nèi)標(biāo)優(yōu)于外標(biāo)。曾經(jīng)做過一個中間體二氨基丙醇的常量定量分析，以二乙醇胺為內(nèi)標(biāo)，RTX-5amine （堿改性） 15m*0.32mm*1.0um色譜柱分析，將配制好的控制溶液（含有內(nèi)標(biāo)物）自動進(jìn)樣器進(jìn)6 針，目的物（二氨基丙醇）與內(nèi)標(biāo)物（二乙醇胺）峰面積比率的RSD 為 0.18% ，而只對這六針樣品的目的物峰（二氨基丙醇）面積求RSD ，結(jié)果

37、為0.71% ，通過這一實(shí)例的結(jié)果大家就會發(fā)現(xiàn)到底哪個方法精密度更好了，當(dāng)然是內(nèi)標(biāo)更好了。當(dāng)然這個化合物的檢測方法最后根據(jù)上面的驗(yàn)證數(shù)據(jù)用內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)定量都是可以的，實(shí)驗(yàn)室可以自由選擇。但內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)精密度結(jié)果的差異是顯然存在的事實(shí)。結(jié)論： 應(yīng)用外標(biāo)法能夠滿足要求，首選還是外標(biāo)法了，畢竟簡單而省事。對于精密度要求比較高、 結(jié)果準(zhǔn)確度會產(chǎn)生重大影響、實(shí)驗(yàn)室條件不是很理想的等等條件下，用內(nèi)標(biāo)法還是必要的。 無論應(yīng)用那種方法，方法的驗(yàn)證和確認(rèn)都是很重要的，只要是按照程序經(jīng)過驗(yàn)證和確認(rèn)的方法，都有其應(yīng)用的空間的。氫火焰離子化檢測器1958 年 Mewillan和 Harley 等分別研制成功氫火焰離子化檢

38、側(cè)器（ FID ），它是典型的破壞性、質(zhì)量型檢測器， 是以氫氣和空氣燃燒生成的火焰為能源，當(dāng)有機(jī)化合物進(jìn)入以氫氣和氧氣燃燒的火焰， 在高溫下產(chǎn)生化學(xué)電離，電離產(chǎn)生比基流高幾個數(shù)量級的離子，在高壓電場的定向作用下，形成離子流，微弱的離子流（10-12 10-8A ）經(jīng)過高阻（ 106 1011 ）放大，成為與進(jìn)入火焰的有機(jī)化合物量成正比的電信號，因此可以根據(jù)信號的大小對有機(jī)物進(jìn)行定量分析。氫火焰檢測器由于結(jié)構(gòu)簡單、性能優(yōu)異、穩(wěn)定可靠、操作方便，所以經(jīng)過40 多年的發(fā)展，今天的 FID 結(jié)構(gòu)仍無實(shí)質(zhì)性的變化。其主要特點(diǎn)是對幾乎所有揮發(fā)性的有機(jī)化合物均有響應(yīng)，對所有徑類化合物（碳數(shù)3）的相對響應(yīng)值幾

39、乎相等，對含雜原子的烴類有機(jī)物中的同系物（碳數(shù)3）的相對響應(yīng)值也幾乎相等。這給化合物的定量帶來很大的方便，而且具有靈敏度高（10-13 10-10g/s ），基流?。?10-14 10-13A ），線性范圍寬 （106 107 ），死體積小 （ 1L），響應(yīng)快（ 1ms ），可以和毛細(xì)管柱直接聯(lián)用，對氣體流速、 壓力和很度變化不敏感等優(yōu)點(diǎn)，所以成為應(yīng)用最廣泛的氣相色譜檢測器。其主要缺點(diǎn)是需要三種氣源及其流速控制系統(tǒng)，尤其是對防爆有嚴(yán)格的要求。氫火焰離子化檢測器的結(jié)構(gòu)氫火焰離子化檢測器（FID ）由電離室和放大電路組成，分別如圖2-9(a) ， (b) 所示。FID 的電離室由金屬圓筒作外罩，底座中心有噴嘴; 噴嘴附近有環(huán)狀金屬圈(極化極，又稱發(fā)射極 )，上端有一個金屬圓簡(收集極 ) 。兩者間加90 300V 的直流電壓， 形成電離電場加速電離的離子。收集極捕集的離子硫經(jīng)放大器的高組產(chǎn)生信號、放大后物送至數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)；燃燒氣、輔助氣和色譜柱由底座引入；燃燒氣及水蒸氣由外罩上方小孔逸出。電子俘獲檢測器及檢測方法節(jié)選自： 色譜分析方法應(yīng)用電子俘獲檢測器（ECD ）是靈敏度最高的氣相色譜檢測器，同時又是最早出現(xiàn)的選擇性檢測器。它僅對那些能俘獲電子