植物切片制作

1、-作者xxxx-日期xxxx植物切片制作【精品文檔】植物組織制片技術(shù)是隨著顯微鏡的出現(xiàn)而發(fā)展起來的技術(shù)，是人們認(rèn)識植物體結(jié)構(gòu)的有效手段，已成為植物生物學(xué)的重要組成部分。植物制片技術(shù)已建立了許多方法，現(xiàn)簡要介紹如下幾種最常見的制片技術(shù)：徒手切片法、滑走切片法、離析法、壓片法、石蠟制片法和冰凍切片法。徒手切片法徒手切片法是指手拿刀片把植物新鮮材料切成薄片，所作的切片通常不經(jīng)染色或經(jīng)簡單染色后，制成臨時的水裝片用于觀察，亦可以通過脫水與染色制成永久制片。優(yōu)點：簡單、方便，不需要復(fù)雜的設(shè)備，不經(jīng)過化學(xué)藥物的處理，基本上保留了植物活體的狀態(tài)。用品與材料顯微鏡、載（蓋）玻片、刀片、毛筆、培養(yǎng)皿、吸水濾紙、

2、滴管、ddH2O或清水、1%番紅水溶液、菜葉、胡蘿卜、馬鈴薯實驗材料 對于軟硬適中，便于手持的材料，可將實驗材料截成適當(dāng)小塊，一般以長23cm，切片斷面不超過35mm2為宜。對于過于柔嫩的器官（如葉片等），一般可選用胡蘿卜根、土豆塊莖等作為支撐物，包被住材料后再進(jìn)行切片。有時也可將葉片卷成圓筒后再進(jìn)行切片。實驗步驟 1、在小培養(yǎng)皿中放入ddH2O或清水。2、用左手拇指、食指和中指拿住材料，拇指略低于食指與中指，并使材料略為突出在指尖上面。3、右手持刀，將刀片平穩(wěn)地放在左手食指之上，與材料切面平行，然后以均勻的動作，自左前方向右后方，斜著向后拉切，切時用臂力而不用腕力。4、切下許多薄片后，用濕毛

3、筆將這些薄片放人培養(yǎng)皿中。用毛筆挑選透明的薄片，放在載玻片上，用吸管滴一滴水在載玻片上，蓋上蓋玻片，制成臨時裝片進(jìn)行觀察。注意事項1、在切片前，要不斷地用水濕潤材料和刀片。2、切片時，兩只手應(yīng)該保持活動狀態(tài)，不要使它們緊靠身體或?qū)嶒炁_，且用力不要過猛，不能用刀片擠壓材料或來回切割材料。3、動作要敏捷，材料要一次切下，不要追求切片形狀的完整。簡單的組織化學(xué)染色經(jīng)徒手切片法切下的薄片，可以進(jìn)行簡單的組織化學(xué)染色，這樣更容易分辨細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，同時可以觀察到細(xì)胞各部分的化學(xué)成分。一般選用以下幾種染料進(jìn)行染色：1、1番紅水溶液木質(zhì)化、栓質(zhì)化的細(xì)胞壁及細(xì)胞核染成紅色。 2、25硫堇水溶液組織呈現(xiàn)從粉紅到藍(lán)紫

4、的多色反應(yīng)，區(qū)分含纖維素、木質(zhì)素的細(xì)胞壁。3、5%間苯三酚反應(yīng)木質(zhì)化的細(xì)胞壁成紅色，顏色深淺與木質(zhì)化程度有關(guān)。 4、I2KI染色淀粉粒呈藍(lán)色，細(xì)胞核呈黃色。視課上實驗進(jìn)展情況，另外安排顯微鏡下觀察動植物組織裝片。壓片法（簡要介紹，補(bǔ)充實驗 洋蔥根尖有絲分裂染色體標(biāo)本制備及觀察） 壓片法是植物的器官或組織未經(jīng)處理或經(jīng)過處理后，被涂抹或壓在載玻片上，使細(xì)胞成一薄層，便于進(jìn)行觀察的一種制片方法。 壓片法的實驗步驟包括：取材、預(yù)處理、固定、解離、染色、壓片、鏡檢和制成永久制片等。實驗步驟 1、取材：用鋒利的雙面刀片截取生長良好的植物根尖或莖尖，長度不超過3mm。 2、預(yù)處理：利用預(yù)處理液如秋水仙素、對

5、二氯苯等處理材料，使細(xì)胞分裂停留在有絲分裂的中期，并使染色體縮短變粗。預(yù)處理的時間視不同植物而定。觀察有絲分裂各期特點和減數(shù)分裂的幼小花藥的制片不需要預(yù)處理。 3、固定：用固定劑迅速殺死正在分裂的細(xì)胞，使其盡量保持分裂的狀態(tài)。常用的固定劑是卡諾固定劑，固定時間l24h。 4、解離：用酶或鹽酸處理固定后的材料，使正在分裂的細(xì)胞分離，便于壓片。解離時要掌握好時間，特別是用鹽酸解離時，時間過短，細(xì)胞不易分開；時間過長，則染色困難。5、染色：常用堿性品紅或醋酸洋紅等染核的染料進(jìn)行染色。 6、壓片：壓片時，將新鮮的或經(jīng)固定的材料放在載玻片上，用解剖刀或鑷子后端壓住材料，并往載玻片的另一邊拖，注意用力均勻

6、。也可以將載玻片上的材料蓋上蓋玻片，用解剖針、竹毛衣針或鉛筆輕輕敲擊，使組織或細(xì)胞分散，再用拇指擠壓蓋玻片，使細(xì)胞成一薄層。前者常用于花粉和小孢子母細(xì)胞，后者用于根尖、莖尖和幼葉等幼嫩器官。7、鏡檢：將壓片置于顯微鏡下觀察，選取目標(biāo)細(xì)胞。用記號筆在載玻片和蓋玻片上分別作記號。8、照相或制成永久制片：好的壓片可以直接照相，也可以通過冷凍干燥后制成永久制片?；咔衅ǎㄑa(bǔ)充）滑走切片法是利用滑走切片機(jī)切新鮮的或保存的材料，亦可以切經(jīng)由石蠟制片法包埋的材料。此法切出的切片厚薄均勻、結(jié)構(gòu)完整，適用于一些比較堅硬的材料。 用品和材料 實驗用品 顯微鏡、滑走切片機(jī)、切片刀、載玻片、蓋玻片、雙面刀片、毛筆、

7、培養(yǎng)皿、濾紙、滴管和軟木。 實驗材料 新鮮材料，若直徑小于lcm，可分割成3cm長的小段；若大于lcm，則應(yīng)將材料劈開，使切面的面積小于lcm2為宜。新鮮材料可直接用于切片，也可以經(jīng)處理后再進(jìn)行切片。處理時，用FAA固定液固定一天，然后轉(zhuǎn)入軟化劑如甘油、氫氟酸中軟化，軟化時間視不同材料而定。在木材制片時，也可以用水煮法排出木材中的空氣并軟化部分組織，然后轉(zhuǎn)入軟化劑乙二胺中，軟化合適后，用聚乙二醇包埋。經(jīng)由石蠟制片法包埋的材料也可以利用滑走切片法切片。實驗步驟 滑走切片機(jī)由機(jī)身、升降夾物裝置、切片刀的夾刀滑行部分等組成。先把切片刀固定在夾刀上，然后將材料固定在兩片軟木中，材料露出木片約，再固定在

8、切片機(jī)的夾物裝置上。調(diào)好材料的高度，使刀刃靠近材料的切面，并使材料與刀刃平行。調(diào)整厚度調(diào)節(jié)器，使其符合切片的要求。切片時用右手扶切片刀的夾刀滑行部分，均勻用力往自己方向移動，切片便被切下并粘在刀的表面上。用濕毛筆把切片取下，放入盛水的培養(yǎng)皿里，然后把刀推回。當(dāng)把刀向后推時，夾物裝置就按調(diào)節(jié)好的厚度上升。如此循環(huán)往復(fù)。可將切片制成臨時裝片或進(jìn)行簡單的顯微化學(xué)染色后觀察，亦可以通過固定、脫水、染色和封固等程序，制成永久制片。離析法（補(bǔ)充）離析法是用一些化學(xué)藥品使細(xì)胞間的胞間層溶解，細(xì)胞彼此分離，從而得到單個、完整細(xì)胞的方法，便于研究細(xì)胞的立體結(jié)構(gòu)。 1、鉻酸-硝酸離析法 適用于木質(zhì)化組織，如木材、

9、纖維等。把材料切成長約lcm、火柴棒大小的小條，放人小玻璃管中，加入離析液，其量約為材料的20倍。蓋緊瓶蓋放在3040的溫箱中。離析的時間，一般12天。如果2天后仍末離析，可換新的離析液，再放置幾天，時間因材料的性質(zhì)而異。檢查材料是否離析，可取出材料少許，放在載玻片上，用解剖針末端輕輕敲打，若材料分離，表明離析時間已夠。這時移去離析液，用水清洗干凈，保存在50或70的酒精中備用。 2、鹽酸-草酸銨離析法 適用于草本植物的髓、薄壁組織和葉肉組織等。把材料切成小塊，約lcm大小，放入3:1的70或90酒精和濃鹽酸中。若材料有空氣，應(yīng)抽氣，抽氣后更換一次離析液。24h后，用水清洗干凈。放入0.5草酸

10、銨水溶液中，時間的長短視材料的性質(zhì)而定。可以每隔l2天作檢查。其余與上法相同。石蠟切片法（補(bǔ)充） 石蠟切片法是用石蠟作為包埋劑的一種顯微制片方法，是顯微技術(shù)中最重要最常用的方法之一。它的優(yōu)點是能夠切出薄而均勻的連續(xù)切片，便于進(jìn)行器官的三維重構(gòu)。此法多用手搖切片機(jī)切片。對于較硬的材料，也可以使用滑走切片機(jī)。 石蠟切片法的操作程序包括：取材、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、修塊、切片、粘片、染色和封片。 實驗步驟1、取材：選取生長良好、有代表性的目標(biāo)材料，洗凈。用鋒利的雙面刀片截取材料，動作要迅速。材料的大小不超過0.5lcm3。 2、固定：將選取的材料放人固定液中，固定液的體積大約是材料的20倍。

11、固定是用化學(xué)試劑迅速殺死細(xì)胞的過程。目的是盡可能使細(xì)胞中的各個組分保持生活狀態(tài)的結(jié)構(gòu)，并固定在它們原來的位置上。常用的固定劑有FAA、卡諾和納瓦興固定液。前兩種固定液的固定時間是224h，后者是1248h。FAA既是良好的固定劑，也是保存劑，材料可以在其中長久保存。而卡諾固定液和納瓦興固定液則不能長久保留材料，固定后，應(yīng)盡快清洗，轉(zhuǎn)人70%酒精中保存。若材料含有空氣，固定時需要抽氣。 3、脫水：固定好的材料經(jīng)各級酒精脫水至純酒精。各級酒精的濃度為：30%、50%、70%、85%、95%和l00%。 4、透明：純酒精中的植物材料用l/2純酒精和l/2二甲苯混合液處理23h，轉(zhuǎn)入純二甲苯中，處理兩

12、次。由于石蠟溶于二甲苯而不溶于酒精，因此透明的作用除了使材料變得透明外，另一方面是將材料中的酒精除去。 5、浸蠟：使石蠟慢慢溶于透明劑中，然后完全取代透明劑進(jìn)人植物組織中。一般將透明好的材料換入新的二甲苯中，然后加入等體積的碎蠟，置于40左右的溫箱中。隨著碎蠟的溶解，不斷加入碎蠟使石蠟飽和為止。時間大約l2天。 6、包埋：浸蠟后，在60的溫箱中，換兩次已溶解的純蠟，每次約2h。然后將材料和石蠟一起倒人小紙盒中，用加熱的鑷子迅速把材料按需要的切面和一定的間隔排列整齊，再將小紙盒平放于冷水中，使其很快凝固。 7、修塊：將包埋好的材料切割成小塊，每個小塊包含一個材料。然后按需要的切面將蠟塊切成梯形，

13、切面在梯形的上部，注意上部矩形的對邊平行。梯形的底部用燒熱的蠟鏟將其固定在木塊上。 8、切片：用手搖切片機(jī)將蠟塊切成連續(xù)的蠟帶。切片時，把切片刀夾在刀架上，再把木塊夾在固定裝置上，調(diào)整固著位置，使材料的切與面刀口平行。然后調(diào)整厚度，轉(zhuǎn)動切片機(jī)切片。 9、粘片：粘片是將切好的蠟片粘在載玻片上。在潔凈的載玻片上，加少許粘貼劑并涂勻。然后加幾滴3%福爾馬林或蒸餾水，用解剖針或鑷子輕輕將蠟片放在液面上。再將帶有蠟片的載玻片放在溫臺上，溫臺的溫度在45左右，蠟片受熱后慢慢伸直。用濾紙吸去多余液體，表面烤干后，轉(zhuǎn)入30溫箱放置一晝夜。 10、染色和封片：切片干燥后，可以選用不同的染色法染色。染色前先要進(jìn)行

14、脫蠟，使材料內(nèi)外的石蠟溶解。然后根據(jù)配制染液的溶液情況，決定是否需要復(fù)水。下面以植物生物學(xué)中最常見的番紅-固綠染色方法，說明染色與制片過程。冰凍切片法（補(bǔ)充）冰凍切片的種類較多，有低溫恒冷箱冰凍切片法，二氧化碳冰凍切片法，甲醇循環(huán)制冷冰凍切片法等。低溫恒冷箱冰凍切片法目前應(yīng)用得比較多。實驗步驟 1、取材，未能固定的組織取材，不能太大太厚，厚者冰凍費時，大者難以切完整。 2、取出組織支承器，放平擺好組織，周邊滴上包埋劑，速放于冷凍臺上，冰凍。小組織的應(yīng)先取一支承器，滴上包埋劑讓其冷凍，形成一個小臺后，再放上細(xì)小組織，滴上包埋劑。 3、將冷凍好的組織塊，夾緊于切片機(jī)持承器上，啟動粗進(jìn)退鍵，轉(zhuǎn)動旋鈕

15、，將組織修平。 4、調(diào)好欲切的厚度，根據(jù)不同的組織而定，原則上是細(xì)胞密集的薄切，纖維多細(xì)胞稀的可稍為厚切，一般在510um間。 5、調(diào)好防卷板。制作冰凍切片，關(guān)鍵在于防卷板的調(diào)節(jié)上，這就要求操作者要細(xì)心，準(zhǔn)確地將其調(diào)較好，調(diào)校至適當(dāng)?shù)奈恢?。切片時，切出的切片能在第一時間順利地通過刀防卷板間的通道，平整地躺在持刀器的鐵板上。這時便可掀起防卷板，取一載玻片，將其附貼上即可。 6、應(yīng)視不同的組織選擇不同的冷凍度。冷凍箱中冷凍度的高低，主要根據(jù)不同的組織而定，不能一概而論。 注意事項1、防卷板及切片刀和持刀架上的板塊應(yīng)保持干凈，需經(jīng)常用毛筆挑除切片殘余和用柔軟的紙張擦。有時需要每切完一張切片后就用紙擦

16、一次。因為這個地方是切片通過和附貼的地方，如果有殘余的包埋劑粘于刀或板上，將會破壞甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。 2、多例多塊組織同時需做冰凍切片時，可各自放于不同的支承器上，于冷凍臺上凍起來，然后依據(jù)不同的編號，依序切片，這樣做既不費時也不會亂。 3、放置組織冰凍前，應(yīng)視組織的形狀及走勢來放置，所謂“砍柴看柴勢”，切片也是如此，如果胡亂放置，就不能收到很好的效果。 4、組織塊不須經(jīng)各種固定液固定，尤其是含水的固定液，在未達(dá)到固定前，更不能使用。臨床快速冰凍切片，不須要預(yù)先固定，一是為了爭取時間，二是固定了的組織，反而增加了切片的難度。如果使用未完全固定的組織做冰凍切片，就會出現(xiàn)冰晶。這是因為含水的固定液在組織未經(jīng)固定前，其中的水份也可滲入到組織中去，當(dāng)冰凍發(fā)生時，這些水份就存留于組織中，形成了冰晶。 5、當(dāng)切片時，如果發(fā)現(xiàn)冰凍過度