微滴式數字PCR操作程序

1、微滴式數字PCR操作程序操作方法1. 先打開電腦，再打開QX200 Droplet Reader電源，在使用前需預熱至少30分鐘； 2. 配制探針法定量反應體系，振蕩混勻，離心除氣泡，注意20ul體系中所加樣本核酸含量不要超過規(guī)定檢測范圍(1100000拷貝片段化核酸或者120000拷貝較完整基因組DNA)，如完整的人類基因組DNA不要超過66ng/20ul，可提前用限制性內切酶處理樣本可提高檢測濃度； 3. 將一個新的DG8 cartridge放入holder中，注意缺口方向； 4. 將20ul樣品反應體系加入到DG8 cartridge中間一排的8個孔內，不足8個樣品時用20ul 1

2、15;buffer control補足，建議使用Rainin的8通道20ul排槍和20ul槍頭（不能用200ul槍頭），加樣時槍頭接近孔一側底部，與側壁呈大約15°角，緩慢打出液體，打出一部分后慢慢提升槍頭位置再打出余下液體，不要將槍按至超過第一檔位置以免引入氣泡； 5. 在DG8 cartridge最底下一排8個孔中各加入70ul微滴生成油（DG Oil），同樣不能有空著的孔； 6. 蓋上膠墊（gasket），注意兩邊的小孔都要鉤牢； 7. 將以上holder輕輕地平穩(wěn)放置于微滴生成儀中，開始生成微滴，注意儀器上指示燈狀態(tài)，一般2分鐘之內完成； 8. 微滴生成于cartridge最

3、上面一排孔內，建議使用Rainin的8通道P50排槍和200ul槍頭小心緩慢吸取，調整吸取體積為40ul，將holder放平，槍頭以與孔壁呈3045°角放入，輕觸孔底，約5秒吸取40ul，再同樣緩慢地打入96孔板相應位置孔內（約5秒），槍頭貼近孔壁接近孔底，注意封上蓋以防油揮發(fā)，每次棄去已使用過的cartridge和膠墊； 9. 轉移油滴進入96孔板內完成后，用預熱好的PX1熱封儀對其進行封膜（膜亮面朝上，暗面向下），推薦的運行程序為：180，10s，無需顛倒方向二次封膜； 10. 封好膜之后應該在30分鐘內進行PCR反應，或者放于4冰箱4小時之內進行PCR，可在任意一臺96孔PCR

4、儀上完成，注意升降溫速度2.5/s。推薦反應條件： 1. 95，10min； 2. 94，30s 40循環(huán)Tm(退火溫度按優(yōu)化摸索得來的條件設置)，60s； 3. 98，10min； 11. 查看微滴讀取儀上狀態(tài)指示燈指示是否正常(不同說明書上稍有不同)； 12. 將之前完成PCR的96孔板放入plate holder中組裝好，注意板斜角方位，如下圖所示： 13. 組裝好之后輕輕地平穩(wěn)放入微滴讀取儀中，如圖： 14. 打開QuantaSoft軟件，建議每次實驗之前做一次Flush System，若一周以上未使用建議先做一次Prime再做Flush System。之后對96孔板中樣品信息進行Setup，主要是提供實驗名稱、實驗類型（ABS、CNV、RED）、assay以