微生物限度檢查作業(yè)指導(dǎo)書

1、 文件編號 文件版本號 微生物限度檢查作業(yè)指導(dǎo)書負責(zé)部門 品管部頁 碼1010目的：建立微生物限度檢查的標(biāo)準操作規(guī)程，為微生物檢驗人員提供正確的操作方法。范圍：適用于輔料、內(nèi)包材料和所有產(chǎn)品的微生物限度檢查。職責(zé)：檢驗人員對本規(guī)程的實施負責(zé)。參照標(biāo)準：GB/T4789.3-2003,GB/T4789.15-2003,GB/T4789.2-2003內(nèi)容：1 概述微生物限度檢查法系指非規(guī)定滅菌制劑及其原、輔料受到微生物污染程度的一種檢查方法，包括染菌量及控制菌的檢查。供試品一般按批號隨機抽樣；抽樣量應(yīng)為檢驗用量（2個以上最小包裝單位）的3倍量（以備復(fù)檢）。檢驗的全過程，均應(yīng)嚴格遵守?zé)o菌操作，嚴防再

2、污染。2 儀器與用具恒溫恒濕培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、恒溫水浴、高壓蒸汽消毒鍋、電熱恒溫干燥箱；試管、錐形瓶、量筒、培養(yǎng)皿（90mm）、刻度吸管、研缽；托盤天平或電子天平、鑷子、剪刀、酒精燈、打火機、編號筆、75%酒精棉球；拖鞋、無菌衣、褲、帽、口罩。以上玻璃器皿、鑷子、剪刀等洗凈、晾干，160170干烤2h，備用。所有滅菌物品存放于第一緩沖間，不應(yīng)超過2周即用畢。否則，應(yīng)重新滅菌。3 培養(yǎng)基、試液配制營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（細菌用）、孟加拉紅培養(yǎng)基（虎紅瓊脂培養(yǎng)基，霉菌用）， 膽鹽乳糖培養(yǎng)基（即BL，用于大腸桿菌增菌培養(yǎng)）、4甲基傘形酮葡糖苷酸（MUG）培養(yǎng)基（用于大腸桿菌快速檢查）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（即

3、MacC，用于腸道菌分離培養(yǎng)）、蛋白胨水培養(yǎng)基（供靛基質(zhì)試驗用）、磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基（供甲基紅及VP試驗用）、枸櫞酸鹽培養(yǎng)基（供枸櫞酸鹽利用試驗用）；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基（TTB，沙門菌增菌用）、膽鹽硫乳瓊脂（DHL）或沙門、志賀菌屬瓊脂（SS）培養(yǎng)基（用于沙門菌分離培養(yǎng)）、麥康凱瓊脂或曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基（大腸桿菌及沙門菌分離培養(yǎng)用）、三糖鐵瓊脂（TSI）斜面培養(yǎng)基（腸道菌初步鑒別用）的配制及滅菌方法參見中國藥典2000年版一部附錄C。 0.1%2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液（供制備培養(yǎng)基用）、氫氧化鉀試液（供作VP反應(yīng)試劑）、萘酚乙醇溶液（供作VP試劑）、靛

4、基質(zhì)試液。的配制及滅菌方法參見中國藥典2000年版一部附錄C。 稀釋劑：0.9%無菌氯化鈉溶液、無菌磷酸鹽緩沖液（PH7.2）。4 操作過程4.1 試驗前的準備4.1.1 將所有已滅菌的培養(yǎng)皿、錐形瓶、研缽、試管、吸管、量筒、稀釋劑及供試品等通過傳遞窗進入無菌室內(nèi)，每次試驗所用物品必須事先計劃，準備足夠用量，避免操作中出入。將全部包裝去掉，編號。4.1.2 開啟紫外燈30分鐘（或臭氧發(fā)生器1h）和空氣過濾裝置30分鐘，進行空間滅菌處理。4.1.3 操作人員用肥皂洗手，關(guān)閉紫外線殺菌燈（或臭氧發(fā)生器），進入緩沖間，換工作鞋。再用0.1%苯扎溴銨（新潔爾滅）消毒液洗手或乙醇棉球擦手，穿戴無菌衣、帽

5、、口罩、手套。4.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手，再用乙醇棉球（或碘伏棉球）擦拭供試品瓶、盒、袋等的開口處周圍，待干后用滅菌的手術(shù)剪刀將供試品瓶、盒、袋啟封。啟封后先檢查包裝內(nèi)側(cè)及周圍有無生霉、長螨跡象，若經(jīng)證實為生霉、長螨即可判為不合格，無須繼續(xù)檢驗。4.1.5 定期檢查無菌環(huán)境的空氣是否符合規(guī)定。4.2 操作4.2.1 細菌、霉菌與酵母菌4.2.1.1 以無菌操作，稱取檢樣25g(ml)，加入含225ml滅菌水的具玻塞錐形瓶中，振搖30min,即為1：10稀釋液。 4.2.1.2 用滅菌吸管吸取1：10稀釋液10ml，注入滅菌試管中，另用1ml滅菌吸管反復(fù)吹吸50次，使霉菌孢子充分散開。4

6、.2.1.3 取1支1ml滅菌吸管吸取1：10均勻供試液1ml，沿管壁加入裝有9ml滅菌稀釋劑的試管中，混勻即1：100供試液。以此類推，根據(jù)供試品污染程度，可稀釋至1：103或1：104，細菌選擇兩至三個稀釋度，霉菌選擇三個稀釋度。4.2.1.4 在進行10倍遞增稀釋的同時，以該稀釋級吸管吸取每級稀釋液各1ml置每個滅菌平皿中，每稀釋級注2個平皿。另取1支1ml吸管吸取稀釋劑各1ml注入2個平皿中，作為陰性對照。4.2.1.5 將融化并冷至約45的培養(yǎng)基注入上述各個平皿約15 ml，以順時針或反時針方向快速轉(zhuǎn)動平皿（勿使培養(yǎng)基溢出）使供試液與培養(yǎng)基混勻，放置，待凝。4.2.1.6 將已凝固的

7、平板倒置于適宜溫度的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)。細菌于36±1培養(yǎng)48±2小時，霉菌、酵母菌于2528培養(yǎng)，3天后開始觀察，共培養(yǎng)觀察5天。4.2.1.7 將平板置菌落計數(shù)器上或從平板的背面直接以肉眼用標(biāo)記筆點計，以透視光襯以暗色背景，仔細觀察，計數(shù)。4.2.2 大腸桿菌取膽鹽乳糖培養(yǎng)基3份，每份100ml，2份分別加入規(guī)定量的供試液，其中1份加入對照菌50100個作陽性對照，第3份加入與供試液等量的稀釋液作陰性對照。培養(yǎng)1824小時（必要可延至48小時）。陰性對照應(yīng)無菌生長。取上述3份的培養(yǎng)物各0.2ml，分別接種至5ml MUG培養(yǎng)基管內(nèi)培養(yǎng)，分別于5小時與24小時時，取未接種的M

8、UG培養(yǎng)基管作本底對照，將各管置365nm紫外光下觀察。陽性對照管呈現(xiàn)熒光，MUG陽性。供試液的MUG管呈現(xiàn)熒光，MUG陽性：無熒光，MUG陰性。然后加數(shù)滴靛基質(zhì)試液于MUG管內(nèi)，液面呈玫瑰紅色為陽性，呈試劑本色為陰性。當(dāng)陰性對照呈陰性，陽性對照正常生長，供試液膽鹽乳糖培養(yǎng)基培養(yǎng)液澄明，并證明無菌生長，判未檢出大腸桿菌。供試液MUG陽性，靛基質(zhì)陽性，判檢出大腸桿菌；MUG陰性，靛基質(zhì)陰性，判未檢出大腸桿菌。如MUG陽性、靛基質(zhì)陰性，或MUG陰性、靛基質(zhì)陽性，均應(yīng)取供試液膽鹽乳糖培養(yǎng)基培養(yǎng)物劃線于曙紅亞甲藍瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板，培養(yǎng)1824小時，如上述供試液培養(yǎng)物的分離平板無菌落生長，判未檢

9、出大腸桿菌。或有菌落生長，應(yīng)挑選23可疑菌落作靛基質(zhì)試驗（）、甲基紅試驗（M）、乙酰甲基甲醇生成試驗（V-P）、枸櫞酸鹽利用試驗（C）及革蘭染色、鏡檢，按下表判斷結(jié)果。MUGI曙紅亞甲藍瓊脂IMVic結(jié)果+ +檢出大腸桿菌 未檢出大腸桿菌+ 無菌生長未檢出大腸桿菌+ 有菌生長 + 檢出大腸桿菌 +有菌生長+ + 檢出大腸桿菌注：如出現(xiàn)+或出現(xiàn)+，均應(yīng)重新分離菌株，再作MUG-I 和IMVic試驗。 革蘭氏陰性桿菌。4.2.3 沙門菌：取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基3份，每份100ml，2份分別加入規(guī)定量的供試液，其中1份加入對照菌液作陽性對照，第3份加入與供試液等量的稀釋液作陰性對照。培養(yǎng)1824小時，陰性

10、對照應(yīng)無菌生長。取其余2份培養(yǎng)物各1 ml，分別接種于四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基10 ml中，培養(yǎng)1824小時。分別劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂（或沙門、志賀菌屬瓊脂）培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂（或曙紅亞甲藍瓊脂）培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824小時或延至4048小時。當(dāng)陽性對照的平板呈現(xiàn)陽性菌落時，供試品的平板無菌落生長，或有菌落但不同于下表所列特征時，可判為未檢出沙門菌。培養(yǎng)基菌 落 形 態(tài)膽鹽硫乳瓊脂無色至淺橙色，半透明，菌落中心帶黑色或全黑色或無色沙門、志賀菌屬瓊脂無色至淡紅色，半透明或不透明，菌落中心有時帶黑褐色曙紅亞甲藍瓊脂無色至淺橙色，透明或半透明，光滑濕潤的圓形菌落麥康凱瓊脂無色至淺橙色，透明或半透明

11、，菌落中心有時為暗色如供試品平板生長的菌落特征有與上表所列形態(tài)特征相符或疑似者，均應(yīng)挑選23個菌落分別接種于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基斜面上，陽性對照同時接種該培養(yǎng)基，培養(yǎng)1824小時后，陽性對照的斜面應(yīng)為紅色，底層為黃色，硫化氫陽性，而供試品的疑似菌斜面未見紅色、底層未見黃色，可判為未檢出沙門菌。否則，應(yīng)繼續(xù)做靛基質(zhì)試驗、脲酶試驗、賴氨酸脫羧酶試驗、動力檢查、血清凝集試驗。5 注意事項5.1 供試品在檢驗之前，應(yīng)保存在陰涼干燥處，勿冷藏或冷凍，以防供試品內(nèi)污染菌因保存條件不妥引起致死，損傷或繁殖。供試品在檢驗之前，應(yīng)保持原包裝狀態(tài)，嚴禁開啟。包裝已開啟的樣品不得作為供試品。5.2 除另有規(guī)定外，供試品

12、制備成供試液后，應(yīng)在均勻狀態(tài)取樣。制成供試液后，應(yīng)在60分鐘內(nèi)注皿操作完畢。5.3 配制后的培養(yǎng)基應(yīng)及時滅菌，避免細菌繁殖。培養(yǎng)基不應(yīng)有沉淀，如發(fā)生沉淀，應(yīng)趁熱過濾。5.4 制備妥的培養(yǎng)基應(yīng)在冷暗處保存，放置時間不能過長，錐形瓶的瓊脂培養(yǎng)基保存時間最長不能超過一個月，以免水分散失染菌。5.5 勿用電爐直接融化瓊脂培養(yǎng)基，以免營養(yǎng)成分過度受熱而破壞。5.6 注皿時培養(yǎng)基應(yīng)在45±1，高于45時易造成細菌受損或致死，低于45時易凝固，因此使用前應(yīng)水浴保溫。5.7 細菌、霉菌與酵母菌及控制菌必須做陰性對照試驗（目的：測試檢驗全過程無菌技術(shù)的可靠性），控制菌必須做陽性對照試驗（目的：檢查供試

13、品是否對控制菌生長產(chǎn)生干擾作用，同時檢查培養(yǎng)條件是否適宜）。5.8 陽性對照試驗操作必須與供試品檢驗操作嚴格分開，避免交叉污染。5.9 做完試驗后，用消毒液清潔，開紫外燈照射30分鐘（或臭氧發(fā)生器1h）。6 結(jié)果判定菌數(shù)報告及結(jié)果判定按中國藥典2005年版二部附錄C。附件1 霉菌與酵母菌檢驗程序附件2 細菌檢驗程序附件3 大腸桿菌檢驗程序供試品 供試液 膽鹽乳糖培養(yǎng)基 MUG-I MUG-I +MUG-I+ MUG-I+ + 判未檢出大腸桿菌判檢出大腸桿菌 EMB或麥康凱瓊脂報告報告 有菌落生長無菌落生長 普通肉湯瓊脂斜面判未檢出大腸桿菌 枸櫞酸鹽VP試驗甲基紅試驗靛基質(zhì)試驗革蘭氏染色鏡檢報告 報告