微生物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

1、 食品微生物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)烏蘭察布職業(yè)學(xué)院農(nóng)學(xué)與馬鈴薯工程系編寫人：張建飛2016年3月食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)一、課程性質(zhì)和任務(wù)食品生物學(xué)實(shí)驗(yàn)是一門專業(yè)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課。該課程的任務(wù)是教會(huì)學(xué)生利用光學(xué)顯微鏡觀察各種微生物，學(xué)會(huì)常用培養(yǎng)基的制備、常用玻璃儀器的滅菌，學(xué)會(huì)分離培養(yǎng)微生物，學(xué)會(huì)鑒定微生物。二、教學(xué)的目標(biāo)及要求：通過該課程的學(xué)習(xí)，要求學(xué)生達(dá)到如下目標(biāo)：1 學(xué)會(huì)普通光學(xué)顯微鏡的使用方法，特別是利用油鏡觀察細(xì)菌的方法。2 學(xué)會(huì)微生物的制片染色技術(shù)。3 學(xué)會(huì)微生物細(xì)胞的大小測定及數(shù)量測計(jì)技術(shù)。4 學(xué)會(huì)培養(yǎng)基的制備、滅菌及微生物的分離純化技術(shù)。5 學(xué)會(huì)鑒定細(xì)菌的常規(guī)生理生化實(shí)驗(yàn)方法為達(dá)到上述目標(biāo)，要求學(xué)生一

2、定要自己親自動(dòng)手獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，實(shí)事求是的完成每一次實(shí)驗(yàn)報(bào)告，并做好每次實(shí)驗(yàn)前的預(yù)習(xí)。三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與學(xué)時(shí)分配序號項(xiàng)目名稱實(shí)驗(yàn)內(nèi)容學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)性質(zhì)主要耗材及儀器設(shè)備1實(shí)驗(yàn)一 顯微鏡的使用與細(xì)菌形態(tài)構(gòu)造的觀察目的：介紹微生物實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)要求，重點(diǎn)掌握顯微鏡的使用，認(rèn)識細(xì)菌的基本形態(tài)。內(nèi)容：（1）觀察前的準(zhǔn)備（2）低倍鏡觀察  （3）高倍鏡觀察 2基礎(chǔ)必修顯微鏡、香柏油、二甲苯、鏡頭紙、菌種2實(shí)驗(yàn)二 真菌制片及形態(tài)觀察目的：學(xué)習(xí)水浸制片法觀察真菌的形態(tài)內(nèi)容：1.觀察幾種代表真菌的無性孢子2.觀察幾種代表真菌的有性孢子2基礎(chǔ)必修載玻片、蓋玻片、顯微鏡3實(shí)驗(yàn)三 細(xì)菌涂片制備、染色及觀察目的：進(jìn)一

3、步掌握正確規(guī)范使用顯微鏡的方法和技能。理解簡單染色和革蘭氏染色的原理。掌握革蘭氏染色的方法與規(guī)范操作。鞏固顯微鏡的使用方法和無菌操作技術(shù)。內(nèi)容：革蘭氏染色4基礎(chǔ)必修結(jié)晶紫、碘液、95%乙醇、蕃紅、載玻片、顯微鏡4實(shí)驗(yàn)四 玻璃儀器的包扎與滅菌實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?1) 了解微生物實(shí)驗(yàn)中玻璃器皿的洗滌重要性(2) 掌握玻璃器皿的洗滌的方法(3) 熟悉玻璃器皿滅菌原理及方法內(nèi)容：（1）玻璃器皿的洗滌(2)玻璃器皿的包扎(3)玻璃器皿滅菌2基礎(chǔ)必修試管、各種規(guī)格的玻璃吸管、培養(yǎng)皿（平皿）、三角瓶及燒杯、玻璃涂布棒等。裝培養(yǎng)皿的金屬筒、干熱滅菌箱等。5實(shí)驗(yàn)五培養(yǎng)基的制備目的：學(xué)習(xí)培養(yǎng)基的配制及滅菌方法內(nèi)容：1.配

4、制牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基和馬丁孟加拉紅鏈霉素培養(yǎng)基2.準(zhǔn)備吸管、無菌水、平皿等無菌器材3.進(jìn)行培養(yǎng)基和無菌器材的滅菌操作4基礎(chǔ)必修牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、孟加拉紅（四碘四氯熒光素）、鏈霉素、三角瓶、試管、1ml吸管、平皿、滅菌鍋6實(shí)驗(yàn)六微生物顯微直接計(jì)數(shù)法目的：學(xué)習(xí)微生物的大小測定和顯微計(jì)數(shù)法內(nèi)容：1.測定Saccharomyces cerevisiae的細(xì)胞大小。2.用血球計(jì)數(shù)板測定每支斜面上S.cerevisiae的菌數(shù)2基礎(chǔ)必修載玻片、鏡臺測微尺、目鏡測微尺、血球計(jì)數(shù)板、顯微鏡7實(shí)驗(yàn)七微生物細(xì)胞大小的測定目的：觀察并掌握菌種個(gè)體形態(tài)和菌落特征、學(xué)習(xí)測微技術(shù)，測量細(xì)菌的大小。內(nèi)容：酵母菌菌體大小的

5、測定 、酵母菌數(shù)量的測定 2鏡臺測微尺、顯微鏡、載玻片及蓋玻片、接種針、0.1%美藍(lán)液、孔雀綠染液、菌種。8實(shí)驗(yàn)八菌種的分離純化目的：學(xué)習(xí)微生物的稀釋平板分離法及劃線分離法內(nèi)容：采樣、樣品稀釋，制備培養(yǎng)基平板，平板畫線法分離培養(yǎng)2基礎(chǔ)必修培養(yǎng)基、試管、培養(yǎng)皿、三角瓶、接種環(huán)、酒精燈、恒溫恒濕培養(yǎng)箱。9實(shí)驗(yàn)九食品中菌落總數(shù)的測定目的：掌握菌落計(jì)數(shù)的方法，掌握食品細(xì)菌菌落總數(shù)的測定報(bào)告方式。內(nèi)容：取樣稀釋培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)4基礎(chǔ)必修食品檢樣、牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、無菌生理鹽水、無菌培養(yǎng)皿、無菌移液管、無菌不銹鋼勺。10實(shí)驗(yàn)十食品中大腸菌群的測定目的：學(xué)習(xí)食品中大腸菌群檢測程序方法，掌握食品中大腸菌群檢

6、測結(jié)果的報(bào)告方式。內(nèi)容：初發(fā)酵試驗(yàn)、平板分離、復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)6選修提高食品檢樣、乳糖蛋白胨發(fā)酵管、伊紅美藍(lán)瓊脂平板、EC 肉湯、磷酸鹽緩沖稀釋液、蛋白胨稀釋液、無菌生理鹽水、革蘭氏染色液、恒溫箱、冰箱、恒溫水浴、天平、顯微鏡、直徑為90mm的平皿、試管、吸管、廣口瓶或三角燒瓶、玻璃珠、載玻片、酒精燈、試管架。合 計(jì)30四、教學(xué)方式及課程考核辦法所有實(shí)驗(yàn)在教學(xué)實(shí)驗(yàn)室里由教師指導(dǎo)完成。課程結(jié)束后分筆試和操作考試，操作考試采取一個(gè)教師對一個(gè)學(xué)生的方式進(jìn)行。內(nèi)容包括：細(xì)菌的革蘭氏染色；微生物的顯微計(jì)數(shù)；微生物的劃線分離；微生物的稀釋分離。四項(xiàng)考試內(nèi)容由學(xué)生自己抽簽選擇其中一項(xiàng)在規(guī)定時(shí)間內(nèi)完成，超過規(guī)定時(shí)間

7、扣分。筆試成績和操作成績各占考試成績的50。五、主要參考書：1、趙斌、何紹江微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)科學(xué)出版社2002年2、范秀容、李廣武微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)高等教育出版社 1999 3、黃儀秀微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程北京大學(xué)出版社1999年 4、黃秀梨微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)高等教育出版社1999年 實(shí)驗(yàn)一 顯微鏡的使用與細(xì)菌形態(tài)構(gòu)造的觀察1本次實(shí)驗(yàn)的目的和要求介紹微生物實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)要求，重點(diǎn)掌握顯微鏡的使用，認(rèn)識細(xì)菌的基本形態(tài)。2實(shí)驗(yàn)內(nèi)容或原理 普通光學(xué)顯微鏡是一種精密的光學(xué)儀器,其構(gòu)造可分為兩大部分：一為機(jī)械裝置，一為光學(xué)系統(tǒng)，這兩部分很好的配合，才能發(fā)揮顯微鏡的作用。顯微鏡的機(jī)械裝置包括底座、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、載物臺、標(biāo)本

8、移動(dòng)器、粗調(diào)旋紐、微調(diào)旋紐等部件；顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)由反光鏡，聚光器，接物鏡，接目鏡等組成，光學(xué)系統(tǒng)使物體放大，形成物體放大像。顯微鏡結(jié)構(gòu)精密，使用時(shí)必須細(xì)心，要按下述操作步驟進(jìn)行。（1）觀察前的準(zhǔn)備顯微鏡從顯微鏡柜或鏡箱內(nèi)拿出時(shí)，要用右手緊握鏡臂，左手托住鏡座，平穩(wěn)地將顯微鏡搬運(yùn)到實(shí)驗(yàn)桌上。不帶光源的顯微鏡，可利用燈光或自然光通過反光鏡來調(diào)節(jié)光照，但不能用直射陽光，直射陽光會(huì)影響物像的清晰并刺激眼睛。顯微鏡在觀察時(shí)，其光學(xué)系統(tǒng)中的光源、聚光器、物鏡和目鏡的光軸及光闌的中心必須跟顯微鏡的光軸同在一直線上。帶視場光闌的顯微鏡，先將光闌縮小，用10×物鏡觀察，在視場內(nèi)可見到視場光闌圓球多邊

9、形的輪廓像，如此像不在視場中央，可利用聚光器外側(cè)的兩個(gè)調(diào)整旋鈕將其調(diào)到中央，然后緩慢地將視場光闌打開，能看到光束向視場周緣均勻展開直至視場光闌的輪廓像完全與視場邊緣內(nèi)接，說明光線已經(jīng)合軸。（2）低倍鏡觀察  鏡檢任何標(biāo)本都要養(yǎng)成必須先用低倍鏡觀察的習(xí)慣。因?yàn)榈捅剁R視野較大，易于發(fā)現(xiàn)目標(biāo)和確定檢查的位置。將標(biāo)本片放置在載物臺上，用標(biāo)本夾夾住，移動(dòng)推動(dòng)器，使被觀察的標(biāo)本處在物鏡正下方，轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)旋鈕，使物鏡調(diào)至接近標(biāo)本處，用目鏡觀察并同時(shí)用粗調(diào)節(jié)旋鈕慢慢升起鏡筒，直至物像出現(xiàn)，再用細(xì)調(diào)節(jié)旋鈕使物像清晰為止。用推動(dòng)器移動(dòng)標(biāo)本片，找到合適的目的像并將它移到視野中央進(jìn)行觀察。（3）高倍鏡觀察&

10、#160; 在正常情況下，高倍物鏡的轉(zhuǎn)換不應(yīng)碰到載玻片或其上的蓋玻片。在轉(zhuǎn)換物鏡時(shí)要從側(cè)面觀察，避免鏡頭與玻片相撞。然后從目鏡觀察，調(diào)節(jié)光照，使亮度適中，緩慢調(diào)節(jié)粗調(diào)節(jié)旋鈕，使載物臺上升，直至物像出現(xiàn)，再用細(xì)調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)至物像清晰為止，找到需觀察的部位，并移至視野中央進(jìn)行觀察。3需用的儀器或試劑等顯微鏡、香柏油、二甲苯、鏡頭紙、菌種4實(shí)驗(yàn)步驟（1）介紹顯微鏡的構(gòu)造與各部件的名稱和功能。（2）示范顯微鏡的規(guī)范化操作過程。（3）依據(jù)顯微鏡使用方法對各示教標(biāo)本進(jìn)行觀察。（4）根據(jù)觀察撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告，描述觀察到的微生物的形態(tài)。實(shí) 驗(yàn) 記 錄實(shí)驗(yàn)時(shí)間： 實(shí)驗(yàn)人員：一、實(shí)驗(yàn)名稱： 二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模喝?、?shí)驗(yàn)材料：

11、四、實(shí)驗(yàn)環(huán)境：五、實(shí)驗(yàn)方法：六、實(shí)驗(yàn)過程：七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：八、結(jié)果分析：實(shí)驗(yàn)二 真菌制片及形態(tài)觀察1本次實(shí)驗(yàn)的目的和要求進(jìn)一步掌握正確規(guī)范使用顯微鏡的方法和技能。掌握無菌操作。掌握真菌水浸片的制備，觀察霉菌形態(tài)。2實(shí)驗(yàn)內(nèi)容或原理 霉菌可產(chǎn)生復(fù)什分枝的菌絲體，分基內(nèi)菌絲和氣生菌絲，氣生菌絲生長到一定階段分化產(chǎn)生繁殖菌絲，由繁殖菌絲產(chǎn)生孢子。霉菌菌絲體(尤其是繁殖菌絲)及孢子的形態(tài)特征是識別不同種類霉菌的重要依據(jù)。霉菌菌絲和孢子的寬度通常比細(xì)菌和放線菌粗得多(約為310微米)，常是細(xì)菌菌體寬度的幾倍至幾十倍，因此，用低倍顯微鏡即可觀察。3實(shí)驗(yàn)器材顯微鏡、接種針、載玻片、蓋玻片、蒸餾水、酒精燈、菌種（

12、黑曲霉）等。4實(shí)驗(yàn)步驟(1) 講解無菌操作的要點(diǎn) a 將試管放于手掌中，并用手指夾住， b 用火焰將接種環(huán)燒紅，然后將接種環(huán)來回通過火焰數(shù)次。 c 用小指、無名指和手掌拔下試管塞，并持于手中。d 將試管口在火焰上微燒一周。 e 將燒過的接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)，先將環(huán)接觸一下沒有長菌的培養(yǎng)基部分，使其冷卻，以免燙死菌體，然后用環(huán)在菌苔上輕輕地接觸，刮下少許培養(yǎng)物，并將接種環(huán)慢慢的從試管中抽出， f 將接種環(huán)抽出，灼燒管口。(2) 講解真菌水浸片制備的要點(diǎn)在載玻片上滴加一滴蒸餾水，用接種針從生長有霉菌的平板中挑取少量霉菌菌絲，用50%的乙醇浸潤，然后放入載玻片上的液滴中，仔細(xì)地用接種針將菌絲分散開來。

13、蓋上蓋玻片（勿使產(chǎn)生氣泡，且不要再移動(dòng)蓋玻片），先用低倍鏡，必要時(shí)轉(zhuǎn)換高倍鏡鏡檢并記錄觀察結(jié)果。（3）制備真菌水浸片，顯微鏡觀察并記錄。實(shí) 驗(yàn) 記 錄實(shí)驗(yàn)時(shí)間： 實(shí)驗(yàn)人員：一、實(shí)驗(yàn)名稱： 二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模喝?、?shí)驗(yàn)材料：四、實(shí)驗(yàn)環(huán)境：五、實(shí)驗(yàn)方法：六、實(shí)驗(yàn)過程：七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：八、結(jié)果分析：實(shí)驗(yàn)三 細(xì)菌涂片制備、染色及觀察1本次實(shí)驗(yàn)的目的和要求進(jìn)一步掌握正確規(guī)范使用顯微鏡的方法和技能。理解簡單染色和革蘭氏染色的原理。掌握革蘭氏染色的方法與規(guī)范操作。鞏固顯微鏡的使用方法和無菌操作技術(shù)。 2實(shí)驗(yàn)內(nèi)容或原理革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家Christain Gram氏創(chuàng)立的，而后一些學(xué)者在此基礎(chǔ)上作

14、了某些改進(jìn)。革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中最重要的鑒別染色法。 革蘭氏染色法的基本步驟是：先用初染劑結(jié)晶紫進(jìn)行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙酮）脫色，最后用復(fù)染劑（如番紅）復(fù)染。經(jīng)此方法染色后，細(xì)胞保留初染劑藍(lán)紫色的細(xì)菌為革蘭氏陽性菌；如果細(xì)胞中初染劑被脫色劑洗脫而使細(xì)菌染上復(fù)染劑的顏色（紅色），該菌屬于革蘭氏陰性菌。 革蘭氏染色法將細(xì)菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性，是由這兩類細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不同決定的。實(shí)際上，當(dāng)用結(jié)晶紫初染后，象簡單染色法一樣，所有細(xì)菌都被染成初染劑的藍(lán)紫色。碘作為媒染劑，它能與結(jié)晶紫結(jié)合成結(jié)晶紫一碘的復(fù)合物，從而增強(qiáng)了染料與細(xì)菌的結(jié)合力。當(dāng)用脫色劑處理時(shí)，兩類細(xì)菌的脫色

15、效果是不同的。革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成、壁厚、類脂質(zhì)含量低，用乙醇（或丙酮）脫色時(shí)細(xì)胞壁脫水、使肽聚糖層的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑縮小，透性降低，從而使結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物不易被洗脫而保留在細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)脫色和復(fù)染后仍保留初染劑的藍(lán)紫色。革蘭氏陰性菌則不同，由于其細(xì)胞壁肽聚糖層較薄，類脂含量高，所以當(dāng)脫色處理時(shí)，類脂質(zhì)被乙醇（或丙酮）溶解，細(xì)胞壁透性增大，使結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物比較容易被洗脫出來，用復(fù)染劑復(fù)染后，細(xì)胞被染上復(fù)染劑的紅色。 3需用的儀器或試劑等顯微鏡，擦鏡紙，香柏油，二甲苯，接種環(huán)，酒精燈，石炭酸復(fù)紅染色液，草酸胺結(jié)晶紫染色液，95%乙醇，蕃紅染色液，大腸桿菌，金黃色葡萄

16、球菌。4實(shí)驗(yàn)步驟(1) 制片 取菌種培養(yǎng)物常規(guī)涂片、干燥、固定。 要用活躍生長期的幼培養(yǎng)物作革蘭氏染色；以免脫色不完全造成假陽性；火焰固定不宜過熱（以玻片不燙手為宜）。 (2) 初染滴加結(jié)晶紫（以剛好將菌膜覆蓋為宜）染色1-2min，水洗。 (3) 媒染 用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋約1min，水洗。 (4) 脫色 用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脫色，直至流出的乙醇無紫色時(shí)，立即水洗。 水洗時(shí)，不要直接 沖涂面，而應(yīng)使水從載玻片的一端流下。水流不宜急、過大，以免涂片薄膜脫落。 注意：革蘭氏染色結(jié)果是否正確，乙醇脫色是格蘭氏染色操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，脫色不足，

17、陰性菌被誤染成陽性菌，脫色過度，陽性菌被誤染成陰性菌，脫色時(shí)間一般約20-30s。 (5) 復(fù)染 用番紅染液復(fù)染約2min，水洗。 (6) 鏡檢 干燥后，用油鏡觀察。 菌體被染成藍(lán)紫色是革蘭氏性菌，被染成紅色的為革蘭氏陰性菌。 實(shí) 驗(yàn) 記 錄實(shí)驗(yàn)時(shí)間： 實(shí)驗(yàn)人員：一、實(shí)驗(yàn)名稱： 二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模喝?shí)驗(yàn)材料：四、實(shí)驗(yàn)環(huán)境：五、實(shí)驗(yàn)方法：六、實(shí)驗(yàn)過程：七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：八、結(jié)果分析：實(shí)驗(yàn)四 玻璃儀器的包扎與滅菌1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1) 了解微生物實(shí)驗(yàn)中玻璃器皿的洗滌重要性(2) 掌握玻璃器皿的洗滌的方法(3) 熟悉玻璃器皿滅菌原理及方法2 實(shí)驗(yàn)原理微生物實(shí)驗(yàn)是純種培養(yǎng)，必須是無菌的。因而微生物實(shí)驗(yàn)需要的所有

18、的玻璃器皿，無論是新購置的還是使用過的都必須經(jīng)過仔細(xì)地清洗和嚴(yán)格的滅菌后才能使用。3 實(shí)驗(yàn)用儀器設(shè)備試管、各種規(guī)格的玻璃吸管、培養(yǎng)皿（平皿）、三角瓶及燒杯、玻璃涂布棒等。裝培養(yǎng)皿的金屬筒、干熱滅菌箱等。4 實(shí)驗(yàn)步驟（1）玻璃器皿的洗滌a 新購置的玻璃器皿的洗滌 新購置的玻璃器皿一般含較多的游離的堿，可在2%的鹽酸或洗滌液內(nèi)先浸泡幾小數(shù)后，用自來水沖洗干凈，倒置在洗滌架上，晾干或在干燥箱內(nèi)烘干備用。b 使用過的玻璃器皿的洗滌 試管、培養(yǎng)皿、三角瓶、燒杯的洗滌?？上扔闷克ⅲɑ蛟嚬芩ⅲ┱从孟匆路刍蛉ノ鄯鄣人⑾?，然后用自來水沖洗干凈。洗滌后，要求內(nèi)壁的水均勻分布成一薄層，表示油垢完全洗凈，如還掛有水珠

19、，則需用洗滌液浸泡數(shù)小時(shí)，然后再用自來水沖洗干凈。培養(yǎng)皿放入 玻璃吸管的洗滌。吸過菌液的吸管（如有棉塞應(yīng)先去掉）或滴管（先拔去橡皮頭）應(yīng)立即放入2%的煤酚或0.5%新潔爾滅消毒液內(nèi)浸泡數(shù)小時(shí)，然后再用自來水沖洗干凈，必要時(shí)還需用蒸餾水淋洗。最后放后烘箱內(nèi)烘干備用。 載玻片和蓋玻片的洗滌。如玻片上有香柏油，先用二甲苯溶解油垢，再在肥皂水中煮沸10min左右，用自來水沖洗，然后在稀洗滌液中浸泡1h2h，自來水沖去洗滌液，最后用蒸餾水淋洗。等干燥后用95%乙醇中保存?zhèn)溆谩?2) 玻璃器皿的包扎培養(yǎng)皿用牛皮紙包裹，或直接放入特制的金屬筒內(nèi)，進(jìn)行干熱滅菌。干燥的吸管上端塞入1cm1.5cm棉花，用紙條以

20、螺旋式包扎。包好的多支吸管用牛皮紙包成捆滅菌(3) 玻璃器皿滅菌干熱滅菌 用干燥的熱空氣殺死微生物的方法稱為干熱滅菌。干熱滅菌操作步驟： 裝箱。將包扎好的玻璃器皿放入干熱滅菌箱滅菌專用的鐵盒內(nèi)，關(guān)好箱門。滅菌。接通電源，打開干熱滅菌箱排氣孔，待溫度升至80100時(shí)關(guān)閉排氣孔。繼續(xù)升溫至160170，開始計(jì)時(shí)，恒溫1h2h。滅菌結(jié)束后，關(guān)閉電源，自然降溫至60，打開箱門，取出物品放置備用。注意：滅菌物品不能有水，否則干熱滅菌中易爆裂；滅菌物品不能裝得太擠，以免影響溫度上升；滅菌溫度不能超過180，否則棉塞及牛皮紙會(huì)燒焦，甚至是燃燒；自然降溫至60以下，才能打開箱門，取出物品，以免因突然降溫導(dǎo)致玻

21、璃器炸裂。 實(shí) 驗(yàn) 記 錄實(shí)驗(yàn)時(shí)間： 實(shí)驗(yàn)人員：一、實(shí)驗(yàn)名稱： 二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模喝?、?shí)驗(yàn)材料：四、實(shí)驗(yàn)環(huán)境：五、實(shí)驗(yàn)方法：六、實(shí)驗(yàn)過程：七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：八、結(jié)果分析：實(shí)驗(yàn)五 培養(yǎng)基的制備1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求：(1) 學(xué)習(xí)微生物培養(yǎng)基的制備，了解培養(yǎng)基配方中各成分的作用、制備流程及各環(huán)節(jié)的操作技術(shù)與應(yīng)用。(2) 學(xué)習(xí)并掌握培養(yǎng)基的高壓蒸氣滅菌原理、操作關(guān)鍵技術(shù)和滅菌技術(shù)。2 實(shí)驗(yàn)原理(1) 培養(yǎng)基的制備原理培養(yǎng)基是按照微生物生長發(fā)育的需要，用不同組分的營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)制而成的營養(yǎng)基質(zhì)。人工制備培養(yǎng)基的目的，在于給微生物創(chuàng)造一個(gè)良好的營養(yǎng)條件。把一定的培養(yǎng)基放入一定的器皿中，就提供了人工繁殖微生物的環(huán)境和場所

22、。它含有滿足微生物生長發(fā)育的水分、碳源、氮源、無機(jī)鹽和生長素以及某些特需的微量元素等。此外，培養(yǎng)基還應(yīng)具有適宜的酸堿度(pH值)和一定緩沖能力及一定的氧化還原電位和合適的滲透壓。固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中添加凝固劑制成的，常用的凝固劑有瓊脂、明膠和硅酸鈉，其中以瓊脂最為常用，其主要成份為多糖類物質(zhì)，性質(zhì)較穩(wěn)定，一般微生物不能分解，故用凝固劑而不致引起化學(xué)成份變化。瓊脂在95的熱水中才開始融化，融化后的瓊脂冷卻到45才重新凝固。因此用瓊脂制成的固體培養(yǎng)基在一般微生物的培養(yǎng)溫度范圍內(nèi)(2537)不會(huì)融化而保持固體狀態(tài)。（2） 高壓蒸氣滅菌原理高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，

23、通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時(shí)由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌器內(nèi)的壓力，從而使沸點(diǎn)增高，得到高于100的溫度。導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。 在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，其原因有三：一是濕熱中細(xì)菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低，二是濕熱的穿透力比干熱大；三是濕熱的蒸汽有潛熱存在，這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時(shí)，滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除是否完全極為重要，因?yàn)榭諝馀蛎泬捍笥谒羝呐蛎泬?，所以，?dāng)水蒸汽中含有

24、空氣時(shí)，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。3 實(shí)驗(yàn)器材瓊脂、10HCL、10% NaOH、牛肉膏、蛋白胨、試管、量筒、小燒杯、玻璃棒、骨匙、pH試紙、紗布、棉花、報(bào)紙、麻繩、標(biāo)簽、培養(yǎng)皿、高壓蒸汽滅菌鍋、烘箱、電爐等。4 實(shí)驗(yàn)步驟(1) 稱量：按照培養(yǎng)基配方，準(zhǔn)確稱取各成份放于燒杯中。 (2) 熔化：向上述燒杯中加入所需水量，攪勻，然后加熱使其熔解。如是配制固體培養(yǎng)基，在瓊脂熔化的過程中，需不斷攪拌并控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦，待完全熔解后，補(bǔ)充所失水分。如果配方中含有淀粉，則需要將淀粉用少量冷水調(diào)成糊狀并在火焰上加熱攪拌后加足水份及其他藥品，待完全熔解后，補(bǔ)充水份。 (3

25、) 調(diào)PH值：初制備好的培養(yǎng)基往往不能符合所要求的PH值，故需用PH試紙或酸度計(jì)校正，用1M HCl調(diào)PH至所需范圍。 (4) 過濾：用濾紙或多層紗布過濾，一般無特殊要求的情況下這一步可以省去。 (5) 分裝：根據(jù)不同的需要，可將制好的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)或三角瓶內(nèi)，管（瓶）口塞上棉塞，注意不要使培養(yǎng)基沾在管（瓶）口上以免浸濕棉塞，引起污染。 注意：裝入試管中的量不宜超過試管高度的1/5，裝入三角燒瓶中的量以燒瓶總體積的一半為限。在分裝過程中，應(yīng)注意勿使培養(yǎng)基沾污管口或瓶口、以免弄濕棉塞，造成污染。(6) 高壓滅菌手提式高壓蒸汽滅菌鍋的使用操作步驟： a 首先將內(nèi)層滅菌桶取出，再向外層鍋內(nèi)加入適

26、量的水，使水面與三角擱架相平為宜。 b 放回滅菌桶，并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免防礙蒸汽流通而影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。c 加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層滅菌桶的排氣槽內(nèi)。再以兩兩對稱的方式同時(shí)旋緊相對的兩個(gè)螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。 d 同時(shí)打開排氣閥，使水沸騰以排除渦內(nèi)的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升。當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時(shí)，控制電源，維持壓力至所需時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)用1.05kg/cm2，121.3，20分鐘滅菌。 e 滅菌所需時(shí)間到后，切斷電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降

27、，當(dāng)壓力表的壓力降至0時(shí)，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。如果壓力未降到0時(shí)，打開排氣閥，就會(huì)因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染。 f 將取出的滅菌培養(yǎng)基放入37溫箱培養(yǎng)24小時(shí)，經(jīng)檢查若無雜菌生長，即可待用。實(shí) 驗(yàn) 記 錄實(shí)驗(yàn)時(shí)間： 實(shí)驗(yàn)人員：一、實(shí)驗(yàn)名稱： 二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模喝?、?shí)驗(yàn)材料：四、實(shí)驗(yàn)環(huán)境：五、實(shí)驗(yàn)方法：六、實(shí)驗(yàn)過程：七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：八、結(jié)果分析：實(shí)驗(yàn)六 微生物顯微直接計(jì)數(shù)法1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求（1） 了解血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造和計(jì)數(shù)原理（2） 掌握使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法。（3） 掌握顯微鏡下直接

28、計(jì)數(shù)的技能。2 實(shí)驗(yàn)基本原理在顯微鏡下對酵母菌活細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)的常用工具是血球計(jì)數(shù)板。該計(jì)數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片，計(jì)數(shù)室的規(guī)格有兩種：一種是將計(jì)數(shù)室分成25個(gè)中方格，每個(gè)中方格又分為16個(gè)小方格。另一種是將計(jì)數(shù)室分成16個(gè)中方格，每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格。兩種規(guī)格計(jì)數(shù)室都由400個(gè)小方格組成。3 實(shí)驗(yàn)材料與儀器顯微鏡、蓋玻片、無菌滴管、血球計(jì)數(shù)板、計(jì)數(shù)器、菌種。4 實(shí)驗(yàn)方法和步驟（1）稀釋 根據(jù)待測菌懸液濃度，加無菌水適量稀釋，以每小格510個(gè)菌體為宜。（2）制片 取一清潔干燥的血球計(jì)數(shù)板，蓋上蓋玻片。將菌懸液搖均，用無菌滴管吸取少許，沿蓋玻片的邊緣滴一小滴，使其自行滲入計(jì)數(shù)室。注意不可

29、產(chǎn)生氣泡，兩個(gè)平臺都滴加菌液。多余菌液用吸水紙吸去。（3）顯微鏡計(jì)數(shù) 靜置3min-5min后鏡檢。先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室（光線不宜太強(qiáng)），然后轉(zhuǎn)換高倍接物鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)，規(guī)格為16×25的計(jì)數(shù)板只計(jì)算左上、左下、右上和右下4個(gè)中格（即100小格）內(nèi)的酵母菌數(shù)。若是25×16的計(jì)數(shù)板，除統(tǒng)計(jì)上述4個(gè)中格外，還需增加中央1個(gè)中格（即80小格）的酵母菌數(shù)。如菌體位于中方格的雙線上，只統(tǒng)計(jì)上線和右線上的菌體數(shù)。對于出芽的酵母菌，當(dāng)芽體達(dá)母細(xì)胞大小一半時(shí)，可作為2個(gè)菌體計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)注意轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)節(jié)器，以便上下液層的菌體均可觀測到。每個(gè)樣品重復(fù)計(jì)數(shù)23次（每次數(shù)值不應(yīng)過大，否則重新操

30、作），取其平均值。（4） 計(jì)算16×25規(guī)格的計(jì)數(shù)室：細(xì)胞數(shù)（）=（5） 清洗計(jì)數(shù)板使用完畢后，用自來水龍頭的急水沖洗，切勿用硬物洗刷。洗后自然晾干或電吹風(fēng)吹干，也可用濾紙吸干水份后再用擦鏡紙擦干，鏡檢計(jì)數(shù)室內(nèi)無殘留菌體或其它沉淀物即可。否則應(yīng)重新清洗干凈。實(shí) 驗(yàn) 記 錄實(shí)驗(yàn)時(shí)間： 實(shí)驗(yàn)人員：一、實(shí)驗(yàn)名稱： 二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模喝?、?shí)驗(yàn)材料：四、實(shí)驗(yàn)環(huán)境：五、實(shí)驗(yàn)方法：六、實(shí)驗(yàn)過程：七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：八、結(jié)果分析：實(shí)驗(yàn)七 微生物細(xì)胞大小的測定1 本次實(shí)驗(yàn)的目的和要求 觀察并掌握菌種個(gè)體形態(tài)和菌落特征、學(xué)習(xí)測微技術(shù)，測量細(xì)菌的大小。2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容或原理微生物細(xì)胞的大小可使用測微尺測量。測微尺由目鏡

31、測微尺和鏡臺測微尺兩部分組成。鏡臺測微尺是一塊在中央有精確刻度尺的載玻片?？潭瘸呖傞L1mm，等分為100小格，每小格為0.01 mm(即10um)，是專用來標(biāo)定目鏡測微尺在不同放大倍數(shù)下每小格的實(shí)際長度。目鏡微尺是一塊圓形的特制玻片，其中央是一個(gè)帶刻度的尺，等分成50或100小格。每小格的長度隨顯微鏡的不同放大倍數(shù)而定，測定時(shí)需用鏡臺測微尺進(jìn)行標(biāo)定，求出在某一放大倍數(shù)時(shí)目鏡測微尺每小格代表的實(shí)際長度，然后用標(biāo)定好的目鏡測微尺測量菌體大小3 需用的儀器或試劑鏡臺測微尺、顯微鏡、載玻片及蓋玻片、接種針、0.1%美藍(lán)液、孔雀綠染液、菌種。4 實(shí)驗(yàn)步驟（1） 酵母菌菌體大小的測定 取下鏡臺測微尺，放好

32、事先做好的酵母菌涂片在低倍鏡找到目的物用高 倍鏡或油鏡測菌體大?。╠）（目鏡測微尺格數(shù)×相應(yīng)放大倍數(shù)下每格標(biāo)定長度） 測定1020株菌體，求出平均值，即為該種酵母菌的大小。 （2） 酵母菌數(shù)量的測定 稀釋樣品，（取少量酵母菌100ml水中）標(biāo)準(zhǔn)：每小格內(nèi)約有5-10個(gè)菌體。 檢測血球計(jì)數(shù)板的清潔度（不潔凈要重新清洗）。 加樣 把蓋玻片放在計(jì)數(shù)室上，吸取少量稀釋液于蓋玻片邊緣，使其自行滲入（多余菌液濾紙吸去）。 計(jì)數(shù) 將血球計(jì)數(shù)板放在載物臺上，低倍鏡下找計(jì)數(shù)室，于高倍鏡下找到清晰的計(jì)數(shù)室線條。按下述方法取值： 25中方格：5個(gè)中方格中的菌體數(shù) 16中方格：4個(gè)中方格中的菌體數(shù) 注意：方

33、格邊線上的只計(jì)算上方邊線和右邊線上的菌出芽生殖狀態(tài)的菌，視芽體大小而定，當(dāng)其體積達(dá)母細(xì)胞一半時(shí)，即視作兩個(gè)菌體。 計(jì)數(shù)一個(gè)樣品要從兩個(gè)計(jì)數(shù)室中計(jì)得的值來取平均值 計(jì)算公式 菌細(xì)胞數(shù)/ml=每小格中菌數(shù)平均數(shù)×400×104×稀釋倍數(shù) 清洗血球計(jì)數(shù)板 較大水流沖洗（均勻刷洗）自行晾干。 實(shí) 驗(yàn) 記 錄實(shí)驗(yàn)時(shí)間： 實(shí)驗(yàn)人員：一、實(shí)驗(yàn)名稱： 二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模喝?、?shí)驗(yàn)材料：四、實(shí)驗(yàn)環(huán)境：五、實(shí)驗(yàn)方法：六、實(shí)驗(yàn)過程：七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：八、結(jié)果分析：實(shí)驗(yàn)八 菌種的分離純化1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵髮W(xué)習(xí)采集樣品，分離純化微生物菌種的方法步驟2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容或原理從混雜的微生物群體中獲得只含有某一

34、種微生物的過程稱為微生物的分離純化。欲從含有多種微生物的樣品中直接辯認(rèn)出，并且取得某種所需微生物的個(gè)體，進(jìn)行純培養(yǎng)，那是困難的。由于微生物可以形成菌落，而每個(gè)單一菌落常常是由一種個(gè)體繁殖而成，菌落又是可以識別和加以鑒定的。因此將樣品中不同微生物個(gè)體在特定的培養(yǎng)基上培養(yǎng)出不同單一菌落，再從選定的某一菌落中取樣，移植到新的培養(yǎng)基中去，就可以達(dá)到分離純化的目的。這也就是常用純種分離法的原理。3 需用的儀器或試劑等培養(yǎng)基、試管、培養(yǎng)皿、三角瓶、接種環(huán)、酒精燈、恒溫恒濕培養(yǎng)箱。4 實(shí)驗(yàn)步驟(1) 采樣，樣品稀釋 稀釋土樣。稱取1g樣品，在火焰旁加到有99mL無菌水和少許玻璃珠的三角瓶內(nèi)，振蕩10min，

35、使土壤和水樣充分混合，將菌分散，土樣中的菌樣被稀釋了100倍，土壤懸液的稀釋度為10-2。在火焰處打開無菌吸管的紙?zhí)?，用無菌吸管吸取土壤懸液1ml，加到一個(gè)盛有9ml無菌水的試管內(nèi)，稀釋1000倍制成稀釋度為10-3的土壤懸液，將此吸管在試管內(nèi)反復(fù)吹洗3次，然后取出，通過火焰，再插入紙?zhí)變?nèi)，以備再用。輕輕搖動(dòng)試管，使菌液均勻。再用剛才用過的吸管，插入試管內(nèi)，反復(fù)吹洗3次，然后取出1ml菌液，加到另一支9 ml無菌水中，制成稀釋度為10-4的土壤懸液備培養(yǎng)基平板同法按每級稀釋10倍的次序得到10-5、10-6的土壤稀釋液，稀釋完后，用最后一支吸管，由最小的稀釋液（10-6）開始吸取0.2ml加到

36、編號為10-6的培養(yǎng)皿，再依次分別從10-5、10-4試管中各吸取0.2ml稀釋液，加到相應(yīng)編號的培養(yǎng)皿內(nèi)，每次吸取時(shí)，吸管都要在稀釋液中反復(fù)吹洗幾次。(2) 制備培養(yǎng)基平板 (3) 平板畫線法分離培養(yǎng)a 平板的制作及培養(yǎng)。將已滅菌的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基水浴融化后冷卻至4550（溫度過高，培養(yǎng)皿蓋上凝結(jié)水太多，菌易被沖掉或燙死；溫度過低，培養(yǎng)基凝固不易倒出）。傾倒培養(yǎng)基應(yīng)在酒精燈火焰附近操作，右手持盛培養(yǎng)基的三角瓶（或試管），左手拿培養(yǎng)皿，并松動(dòng)三角瓶的棉塞。培養(yǎng)基一次不能用完時(shí)，棉塞應(yīng)用左手小指夾持，不可放在桌面上，拔出棉塞后，三角瓶口在火焰上滅菌，然后少許打開培養(yǎng)皿蓋，迅速傾入培養(yǎng)基，迅

37、速將皿蓋蓋妥，平放桌上，輕輕旋轉(zhuǎn)，使培養(yǎng)基與懸液混合均勻，待凝固后，即成平板。將培養(yǎng)皿倒置于37恒溫箱中培養(yǎng)24h，細(xì)菌即在所固定的位置長成肉眼可見的菌落。放線菌的稀釋分離法同前，只不過在制土壤懸液時(shí)，于99ml無菌水的三角瓶內(nèi)加入10%的苯酚溶液10滴，以抑制細(xì)菌生長，28恒溫箱中培養(yǎng)7 d10d。b 平板劃線分離法將融化的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基制成平板，待冷凝后，左手持平板，右手持接種針，用接種環(huán)在火焰上滅菌后沾取一環(huán)適宜稀釋度的懸液，在火焰附近用左手拇指、食指掀開皿蓋，使接種環(huán)輕觸培養(yǎng)基，迅速劃線（注意勿將培養(yǎng)基劃破），劃線時(shí)，接種環(huán)與培養(yǎng)基表面的夾角為2030°。常用的劃線方

38、式有兩種,一種是將平板分成三個(gè)區(qū)域，先在第一個(gè)區(qū)域內(nèi)劃34條平行線，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，在火焰上燒掉接種環(huán)上的殘余物后，通過第一次劃線部分，在第二個(gè)區(qū)域內(nèi)劃線；第二個(gè)區(qū)域中的線和第一個(gè)區(qū)域中的線應(yīng)有部分交叉，依法在第三個(gè)區(qū)域中劃線。另一種是先以沾有細(xì)菌懸液的接種環(huán)在平板的一端抹一下，使該處沾上一些細(xì)菌，然后燒掉環(huán)上剩下的細(xì)菌，再用燒過冷卻的接種環(huán)，通過剛才涂抹的部分，左右劃線，不能互相接觸。劃線分離對細(xì)菌、酵母菌較為適宜，而霉菌和放線菌的分離多采用稀釋分離法。分離純化工作可反復(fù)進(jìn)行，直至獲得滿意的單菌落純培養(yǎng)為止。（4）觀察、鏡檢、純培養(yǎng)實(shí) 驗(yàn) 記 錄實(shí)驗(yàn)時(shí)間： 實(shí)驗(yàn)人員：一、實(shí)驗(yàn)名稱： 二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

39、：三、實(shí)驗(yàn)材料：四、實(shí)驗(yàn)環(huán)境：五、實(shí)驗(yàn)方法：六、實(shí)驗(yàn)過程：七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：八、結(jié)果分析：實(shí)驗(yàn)九 食品中菌落總數(shù)的測定1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵笳莆站溆?jì)數(shù)的方法，掌握食品細(xì)菌菌落總數(shù)的測定報(bào)告方式。2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容或原理菌落總數(shù)是指食品經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后，所得1g或1ml檢樣中所含細(xì)菌菌落總數(shù)。菌落總數(shù)主要作為判別食品被污染程度的標(biāo)志，也可以應(yīng)用這一方法觀察細(xì)菌在食品中繁殖的動(dòng)態(tài)過程，以便對被檢樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評價(jià)時(shí)提供依據(jù)。菌落總數(shù)并不表示樣品中實(shí)際存在的所有細(xì)菌總數(shù)，菌落總數(shù)也并不能區(qū)分其中細(xì)菌的種類，所以有時(shí)被稱為雜菌數(shù)，需氧菌數(shù)等。3 實(shí)驗(yàn)材料與儀器食品檢樣、牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、無菌生理

40、鹽水、無菌培養(yǎng)皿、無菌移液管、無菌不銹鋼勺。 4 實(shí)驗(yàn)步驟（1）取樣、稀釋和培養(yǎng)a 以無菌操作取檢樣25g（或ml），放于225ml滅菌生理鹽水的滅菌玻璃瓶內(nèi)（瓶內(nèi)預(yù)置適量的玻璃珠），經(jīng)充分振要或研磨制成1：10的均勻稀釋液。b 用1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水的試管內(nèi)，振搖試管混合均勻，制成1：100的稀釋液。c 另取1ml滅菌吸管，按上項(xiàng)操作順序，制10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次即換用1支10ml吸管。d  根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)ξ廴厩闆r的估計(jì)，選擇23個(gè)適宜稀釋度，分別在制作10倍遞增稀釋的同時(shí)，以吸取該稀釋度的吸管移取1ml稀釋液

41、于滅菌平皿中，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。e  稀釋液移入平皿后，將涼至4550牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15ml，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，混合均勻。同時(shí)將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1ml稀釋液（不含樣品）的滅菌平皿內(nèi)作空白對照。f  待培養(yǎng)基凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置37溫箱內(nèi)培養(yǎng)48h，取出計(jì)算平板內(nèi)菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得每克（每毫升）樣品所含菌落總數(shù)。(2)  菌落計(jì)數(shù)方法作平皿菌落計(jì)數(shù)時(shí)，可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平皿的菌落總數(shù)后，求出同稀釋度的各平皿平均菌落數(shù)。到達(dá)規(guī)定培養(yǎng)時(shí)間，應(yīng)立即計(jì)數(shù)。如果不能立即計(jì)數(shù)，應(yīng)將平板放置于04，但不要超

42、過24h。(3) 菌落計(jì)數(shù)報(bào)告方法a 平皿菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在30300之間的平皿作為菌落總數(shù)測定標(biāo)準(zhǔn)。每一個(gè)稀釋度應(yīng)采用兩個(gè)平皿平均數(shù)，其中一個(gè)平皿有較大片狀菌落生長時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平皿作為該稀釋度的菌落數(shù)，若片狀菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，則可以計(jì)算半個(gè)平皿后乘以2以代表全皿菌落數(shù)。b  稀釋度的選擇 應(yīng)選取平均菌落數(shù)在30300之間的稀釋度報(bào)告細(xì)菌菌落總數(shù)是指檢樣在培養(yǎng)基上3724小時(shí)培養(yǎng)所長出的菌落數(shù)。菌落總數(shù)的多少可以說明污染的程度。 若有二個(gè)稀釋度均在30300之間時(shí)，應(yīng)以二者比值決定，比值 2取平均數(shù)，比值>2則其較

43、小數(shù)字。 若所有稀釋度均>300，則取最高稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。 若所有稀釋度均<30，則以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)。 若所有稀釋度均不在30300之間，有的>300，有的又<30，則應(yīng)以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。c 菌落計(jì)數(shù)報(bào)告方法菌落數(shù)在1100時(shí)，按實(shí)有數(shù)字報(bào)告，如大于100時(shí)，則報(bào)告前面兩位有效數(shù)字，第三位數(shù)按四舍五入計(jì)算，為了縮短數(shù)字后面的零數(shù)，也可以10的指數(shù)表示。實(shí) 驗(yàn) 記 錄實(shí)驗(yàn)時(shí)間： 實(shí)驗(yàn)人員：一、實(shí)驗(yàn)名稱： 二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模喝?、?shí)驗(yàn)材料：四、實(shí)驗(yàn)環(huán)境：五、實(shí)驗(yàn)方法：六、實(shí)驗(yàn)過程：七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：八、結(jié)果分析：

44、實(shí)驗(yàn)十 食品中大腸菌群的測定1實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵髮W(xué)習(xí)食品中大腸菌群檢測程序方法，掌握食品中大腸菌群檢測結(jié)果的報(bào)告方式。2實(shí)驗(yàn)內(nèi)容或原理大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。該菌主要來于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標(biāo)來評價(jià)食品的衛(wèi)生質(zhì)量，推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能。食品中大腸菌群數(shù)是以100ml(g)檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)(MPN)表示。本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)多管發(fā)酵法檢測食品中的大腸菌群。a 初發(fā)酵試驗(yàn)用于初步發(fā)酵試驗(yàn)的液體培養(yǎng)基含有乳糖、蛋白胨和溴甲酚紫。許多細(xì)菌不能發(fā)酵乳糖，而大腸菌群可發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸（有機(jī)酸），產(chǎn)氣（CO2+H2）。乳糖起選擇性碳源的作用。溴

45、甲酚紫是pH指示劑（堿性條件：紫蘭色；酸性條件：黃色，變色點(diǎn)pH=6.7），當(dāng)大腸菌群的細(xì)菌利用乳糖產(chǎn)酸后，使原來的pH由中性下降成酸性，培養(yǎng)基從紫色變?yōu)辄S色。另外，溴甲酚紫還具有抑制其他細(xì)菌生長的作用。b 平板分離為進(jìn)一步證明大腸菌群的存在，需進(jìn)行平板分離，所用培養(yǎng)基為伊紅美藍(lán)瓊脂。伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基中含有伊紅與美藍(lán)兩種苯胺類染料，可以抑制G+菌和一些難培養(yǎng)的G-菌，而且在低酸度時(shí)，兩種染料結(jié)合形成沉淀，起著產(chǎn)酸指示劑的作用。大腸菌群因其強(qiáng)烈發(fā)酵乳糖而產(chǎn)生大量混合酸，使菌體表面帶上正電荷，可染上伊紅染液，伊紅與美藍(lán)結(jié)合，菌體被著上深紫色，形成帶核心、具金屬光澤的特征性菌落。c 復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)陽性

46、菌落經(jīng)涂片染色鑒別為G-，無芽孢者，再經(jīng)過乳糖發(fā)酵管液體培養(yǎng)進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，經(jīng)24h培養(yǎng)產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，可確認(rèn)為大腸菌群陽性結(jié)果。3 實(shí)驗(yàn)材料與儀器食品檢樣、乳糖蛋白胨發(fā)酵管、伊紅美藍(lán)瓊脂平板、EC 肉湯、磷酸鹽緩沖稀釋液、蛋白胨稀釋液、無菌生理鹽水、革蘭氏染色液、恒溫箱、冰箱、恒溫水浴、天平、顯微鏡、直徑為90mm的平皿、試管、吸管、廣口瓶或三角燒瓶、玻璃珠、載玻片、酒精燈、試管架。4 實(shí)驗(yàn)操作步驟（1） 檢樣處理液態(tài)檢樣可用振搖的方式，使充分均勻混合后，取50ml加入 450ml已滅菌的稀釋液中，即為10倍稀釋檢液。凝態(tài)及濃稠液態(tài)檢體如布丁、煉乳等,經(jīng)適當(dāng)攪拌均勻后，取50g加入450ml滅菌

47、之稀釋液中，用攪拌均質(zhì)器攪拌(攪拌方法同前)，即為10倍稀釋檢液。（2） 檢樣稀釋以無菌操作將上述處理樣25ml放于有225ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(nèi)(瓶內(nèi)予置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)，經(jīng)充分振搖后，制成1:10的均勻稀釋液。用1ml滅菌吸管吸取1:10稀釋液1ml，注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混勻，制成1:100的稀釋液。另取1ml滅菌吸管，按上條操作依次做10倍遞增稀釋液,每遞增稀釋一次，換用1支1ml滅菌吸管。根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況的估計(jì)，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度，接種3管。（3） 初發(fā)酵試驗(yàn)將已選擇的稀釋檢液及原液(液體檢樣)充分振

48、搖、混合均勻后,分別吸取1ml接種于已裝有9ml乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)（內(nèi)倒置小管）。接種量在1ml以上者，用雙倍乳糖膽鹽發(fā)酵管（內(nèi)倒置小管），1ml及1ml以下者，用單倍乳糖膽鹽發(fā)酵管（內(nèi)倒置小管）。每一稀釋度接種3管，置37 溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進(jìn)行。（4） 分離培養(yǎng)經(jīng)24h培養(yǎng)后，將產(chǎn)氣（倒管頂部有空氣）的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置37 溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24h，然后取出，觀察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色和證實(shí)試驗(yàn)。（5） 復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落12個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，置 37溫