園林植物育種學(xué)植物組織培養(yǎng)技術(shù)及其在育種中應(yīng)用PPT課件

1、一、 現(xiàn)代生物技術(shù)及其基本概念（一）生物技術(shù)概念 生物技術(shù)（Biotechnology)，有時(shí)也稱生物工程（Bioengineering）, 是指人們以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合先進(jìn)的工程技術(shù)手段和其他基礎(chǔ)科學(xué)的原理，按照預(yù)先的設(shè)計(jì)改造生物體或加工生物原料，為人類產(chǎn)出所需產(chǎn)品。生物技術(shù)是一門綜合性學(xué)科?，F(xiàn)代生物技術(shù)已成功地應(yīng)用于植物育種中。第1頁/共45頁（二）生物技術(shù)的種類1.基因工程（Gene Engineering）2.細(xì)胞工程（Cell Engineering ）3.酶工程（Enzyme Engineering ）4.發(fā)酵工程（Fermentation Engineering ）5.蛋白

2、質(zhì)工程（Protein Engineering ）第2頁/共45頁（三）細(xì)胞工程 細(xì)胞工程就是在細(xì)胞水平研究開發(fā)、利用各類細(xì)胞的工程。亦即人們根據(jù)科學(xué)設(shè)計(jì)改變細(xì)胞的遺傳基礎(chǔ)，通過無菌操作，大量培養(yǎng)細(xì)胞、組織乃至完整個(gè)體的技術(shù)。第3頁/共45頁（四）克隆概念1.分離基因的技術(shù)；2.擴(kuò)增基因的技術(shù)；3.將單一細(xì)胞擴(kuò)增成細(xì)胞群體的技術(shù)；4.將一個(gè)生命體復(fù)制成一個(gè)與之完全相同的新個(gè)體的過程；5.將單一個(gè)體擴(kuò)增成一個(gè)遺傳上完全相同的群體。6.一個(gè)遺傳上來源完全相同的生物群體。第4頁/共45頁二、植物組織培養(yǎng)的基本步驟1、植物細(xì)胞的全能性（Cell Totipotency） 一個(gè)植物細(xì)胞能產(chǎn)生一個(gè)完整植株

3、的固有能力稱之為細(xì)胞的全能性。第5頁/共45頁2、植物離體分化的類型無菌短枝型叢生芽增殖型器官發(fā)生型胚狀體發(fā)生型原球莖發(fā)生型第6頁/共45頁3、植物組織培養(yǎng)的特點(diǎn) 培育材料經(jīng)濟(jì)； 培養(yǎng)條件可人為控制； 生長周期短，繁殖率高； 管理方便，利于自動(dòng)化控制。第7頁/共45頁5、植物組織培養(yǎng)的基本操作 無菌操作技術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 原生質(zhì)體融合技術(shù)第8頁/共45頁v 接種用具的滅菌接種用具的滅菌 接種前，必須把用具放入接種室或箱內(nèi)，初用接種室或箱時(shí)要用甲醛（一般市售分析純的有效成份為 36-38% 熏蒸5小時(shí)以上再開紫外光燈照射40-60分鐘，以后在每次接種之前，把要接種的試管或三角瓶放入接種室（箱）內(nèi)

4、，用5%的煤酚瓶皂溶液即來蘇爾（一般市售的有效成份為47-53%）或 5% 的石灰炭酸液噴霧消毒，再打開紫外光燈照20-40分鐘，這樣消毒后，再經(jīng)30-40分鐘便可進(jìn)行接種。 第9頁/共45頁v 接種材料的表面滅菌接種材料的表面滅菌 接種前花蕾或穗的徹底滅菌是杜絕污染的主要關(guān)鍵，先用70-75%的酒精浸泡10-15秒鐘或用酒精棉球擦兩遍，初步殺死表面所帶的微生物，放在10%的漂白粉液或飽和漂白粉液中浸泡15-30分鐘殺菌，然后用無菌水沖洗2-3次。 消毒過的穗子或花蕾用消毒紗布包好，待取花藥接種，注意，穗子或花蕾的操作要在無菌條件下進(jìn)行。第10頁/共45頁5、植物組織培養(yǎng)所需營養(yǎng)與環(huán)境條件（1

5、）無機(jī)營養(yǎng)大量元素：大量元素： 一般是指濃度大于0.5mmol/L.氮(N) 、磷(P) 、鉀(K) 、鈣(Ca) 、鎂(Mg) 、硫(S) 。微量元素：微量元素： 包括鐵(Fe) 、銅(Cu) 、鉬(Mo) 、鋅(Zn) 、鈉(Na) 、錳(Mn) 、鈷(Co) 、硼(B) 、碘(I)。（2）有機(jī)營養(yǎng)維生素、肌醇、氨基酸、有機(jī)添加物。維生素、肌醇、氨基酸、有機(jī)添加物。（3）生長調(diào)節(jié)物 生長素生長素：2，4 - D、奈乙酸(NAA)、吲哚丁酸（IBA）、吲哚乙酸(IAA) 。 細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素：激動(dòng)素（KT）、6-芐基氨基嘌呤（6BA） 、玉米素（ZT）。 赤霉素赤霉素（GA） ：脫落酸（

6、ABA） 、乙烯利（CEDP）。第11頁/共45頁（4）瓊脂（5）能源和滲透壓（6）其他成分（7）溫度（8）光照（光強(qiáng)、光質(zhì)）培養(yǎng)基的配制：培養(yǎng)基的配制： 培養(yǎng)基母液的配制培養(yǎng)基母液的配制 ；配制培養(yǎng)基的步驟；配制培養(yǎng)基的步驟；培養(yǎng)基的分裝及滅菌。培養(yǎng)基的分裝及滅菌。第12頁/共45頁6、植物組織培養(yǎng)經(jīng)歷的五個(gè)階段：（1）預(yù)備階段預(yù)備階段 外植體的獲得； 接種材料的消毒處理； 配制適宜的培養(yǎng)基；（2）誘導(dǎo)去分化階段誘導(dǎo)去分化階段（3）繼代增殖階段）繼代增殖階段（4）生根成芽階段）生根成芽階段（5）移栽成活階段）移栽成活階段第13頁/共45頁三、植物組織培養(yǎng)技術(shù)在育種中的應(yīng)用 種質(zhì)資源保護(hù)； 優(yōu)

7、良品種快速繁殖； 誘發(fā)和離體篩選突變體； 克服遠(yuǎn)緣雜交困難； 克服種子發(fā)育中的障礙； 單倍體育種的技術(shù)環(huán)節(jié) 基因工程的基礎(chǔ)技術(shù)第14頁/共45頁（一）單倍體育種1. 單倍體的概念及其特點(diǎn) 只含有一套染色體組的生物體； 被子植物的配子體世代。矮小性；不育性；全顯性。第15頁/共45頁2. 單倍體植物在育種上的意義1.單倍體植物的直接利用；2.克服雜種分離，縮短育種年限；3.快速獲得異花授粉植物的自交系；4.單倍體植物的誘變育種；5.克服遠(yuǎn)緣雜種不孕性與不穩(wěn)定的現(xiàn)象；第16頁/共45頁3. 單倍體植株和愈傷組織的培養(yǎng)（1）單倍體材料的采集 單倍體育種的首要問題是如何獲得大最的單倍體植株。據(jù)現(xiàn)有的研

8、究材料，用花藥培養(yǎng)產(chǎn)生單倍體植株有兩個(gè)途徑: 第一是在離體培養(yǎng)的花藥中，花粉經(jīng)過類似胚胎發(fā)育的過程直接形成單倍體植物，如煙草、曼陀羅等。 第二是在離體培養(yǎng)的花藥中，花粉形成愈傷組織，再從愈傷組織分化出單倍體植株。第17頁/共45頁（2）花藥的接種v接種前的準(zhǔn)備工作 接種和培養(yǎng)花藥是在無菌條件下進(jìn)行的，所用的一切用具必須徹底滅菌。v花粉發(fā)育時(shí)期的鑒定 適宜的花粉發(fā)育時(shí)期對(duì)于提高花粉誘導(dǎo)愈傷組織分化的頻率是很重要的，為此，進(jìn)行花藥培養(yǎng)前，要用顯微鏡進(jìn)行花粉發(fā)育時(shí)期的鑒定。 經(jīng)顯微鏡檢查后，把花粉細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)期與花藥或花序的外部形態(tài)聯(lián)系起來，找出花粉單核期或單核期的花蕾或花序的外部形態(tài)標(biāo)志選取花藥進(jìn)

9、行接種培養(yǎng)。 第18頁/共45頁 誘導(dǎo)愈傷組織分化出根、莖、葉的方法是在愈傷組織長到1-3毫米大?。ㄈ缧∶状螅r(shí)，即可轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上，促使分化長出植株。一般說來，愈傷組織如果先形成芽，隨后根自然會(huì)發(fā)生，如果先有根，以后不一定會(huì)出芽。因此，掌握芽分化的條件是十分重要的。 愈傷組織轉(zhuǎn)移培養(yǎng)工作是在無菌室或接種箱內(nèi)進(jìn)行的，轉(zhuǎn)移后愈傷組織培養(yǎng)在23-28恒溫室內(nèi)，每日光照9-11小時(shí)，可用日光燈作輔助光，光強(qiáng)度在2000勒克斯以上。 在轉(zhuǎn)移愈傷組織時(shí)，應(yīng)注意其極性，原來向上的一但轉(zhuǎn)移后的一但轉(zhuǎn)移后仍應(yīng)向上，否則會(huì)影響生長，同時(shí)在轉(zhuǎn)移時(shí)，就避免沾帶過多的培養(yǎng)基。 第19頁/共45頁4. 染色體加

10、倍處理方式：試管內(nèi)進(jìn)行；花粉植株定植后進(jìn)行；藥劑處理；植株鑒定。 第20頁/共45頁單倍體育種程序：材料采集 接種培養(yǎng) 誘導(dǎo)愈傷組織 獲得再生植株 染色體加倍 幼苗培育和品種選擇 第21頁/共45頁（二）原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交 常規(guī)雜交育種由于物種間難以逾越的天然屏障而舉步維艱。 科學(xué)家們受細(xì)胞全能性理論及組織培養(yǎng)成功的啟示，逐漸將眼光轉(zhuǎn)向細(xì)胞融合，試圖通過這種嶄新的手段沖破自然界的禁錮。第22頁/共45頁1.原生質(zhì)體的概念 植物細(xì)胞原生質(zhì)體是指那些以去除全部細(xì)胞壁的細(xì)胞。 此時(shí)，細(xì)胞外僅由細(xì)胞膜包裹， 呈圓形只有在高滲溶液中才能相對(duì)穩(wěn)定。 原生質(zhì)體經(jīng)適當(dāng)處理，可與其他細(xì)胞融合成新的體細(xì)胞。

11、第23頁/共45頁2. 原生質(zhì)體的特點(diǎn) 比完整的細(xì)胞更容易獲得外來遺傳物質(zhì)，為實(shí)現(xiàn)異源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化提供了較好的實(shí)驗(yàn)材料。 原生質(zhì)體在一定條件下可以融合成雜種細(xì)胞，開辟了一條新的育種途徑。第24頁/共45頁3. 發(fā)展概況1892， J. A. Klerker 用機(jī)械法獲得原生質(zhì)體；1960，E.C. Cocking 用酶法首先從番茄根尖中分離出大量有活性的原生質(zhì)體并通過培養(yǎng)再生出細(xì)胞壁形成再生植株;1960，G. Barski發(fā)現(xiàn), 題細(xì)胞原生質(zhì)體能融合在一起形成單核的、并能進(jìn)行分裂的雜種細(xì)胞；1972，P.S.Carlon首次獲得煙草體細(xì)胞種間雜種。80s 此項(xiàng)技術(shù)在我國得到發(fā)展。第25頁/共

12、45頁4. 原生質(zhì)體的制備（1）取材與滅菌（2）酶解 (纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶) （3）分離 （沉淀法、漂洗法、滴洗法）（4）洗滌（5）鑒定（形態(tài)觀測、活性鑒定）原生質(zhì)體的培養(yǎng)：細(xì)胞壁再生；細(xì)胞分裂；植株再生。第26頁/共45頁5. 原生質(zhì)體的融合v化學(xué)法誘導(dǎo)融合化學(xué)法誘導(dǎo)融合1) 按比例混合雙親原生質(zhì)體- 2) 滴加PEG- 3) 滴加高鈣高PH值溶液- 4) 洗滌原生質(zhì)體溶液- 5) 離心獲得原生質(zhì)體溶液-6) 篩選雜種細(xì)胞-7) 再生雜種細(xì)胞。第27頁/共45頁v 物理法誘導(dǎo)融合物理法誘導(dǎo)融合基本程序：基本程序：l原生質(zhì)體的獲得；原生質(zhì)體的獲得；l電擊融合；電擊融合；l篩選雜種細(xì)胞

13、；篩選雜種細(xì)胞；l雜種細(xì)胞再生和完雜種細(xì)胞再生和完整植株的形成。整植株的形成。第28頁/共45頁6. 融合細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定與篩選 雜和細(xì)胞的顯微鏡鑒別； 互補(bǔ)法鑒定雜和細(xì)胞； 細(xì)胞與分子生物學(xué)法； 植株形態(tài)的鑒別。第29頁/共45頁第30頁/共45頁（三）人工種子 人工種子即人為制造的種子，它是一種含有植物胚狀體或芽、營養(yǎng)成分、激素、及其他成分的人工膠囊。其具有種子的功能，可直接用于田間播種。第31頁/共45頁 1、人工種子的構(gòu)成人工種子的構(gòu)成 人工種皮 胚 狀 體 人工胚乳第32頁/共45頁2、人工種子的特點(diǎn)人工種子的特點(diǎn)：（1）可以不受環(huán)境條件的限制，周年進(jìn)行生產(chǎn)；（2）經(jīng)人工無性繁殖產(chǎn)生，

14、有利于保存該種系 的優(yōu)良性狀；（3）成本低，適于田間機(jī)械化生產(chǎn)；（4）可根據(jù)需要調(diào)節(jié)胚乳成分。第33頁/共45頁3、人工種子的制備人工種子的制備（1）胚狀體的制備及其同步生長；（2）人工胚乳的制備；（3）配制包埋劑及人工包埋。第34頁/共45頁人工種子包埋示意圖 4%海藻酸鈉 體細(xì)胞胚 包埋丸 2% CaCl 人工種子 水 第35頁/共45頁4、人工種子的貯存與萌發(fā) 低溫、干燥、潔凈。第36頁/共45頁（四）基因工程（一）基因工程的含義 按照人們的愿望， 進(jìn)行嚴(yán)密的設(shè)計(jì)， 通過體外 DNA重組技術(shù) 和DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)，有目的地改造生物種性， 使現(xiàn)有物種在短時(shí)間內(nèi)趣于完善， 創(chuàng)造出新的生物類型。第37頁/共45頁致癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法第38頁/共45頁2、重組DNA的直接轉(zhuǎn)化法微粒散射技術(shù) (Particle bombardment)第39頁/共45頁（二）基因工程的基本步驟1、目的基因的克隆與鑒定；2、植物表達(dá)載體的構(gòu)建；3、植物的遺傳轉(zhuǎn)化；4、轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選；5、轉(zhuǎn)基因植株的鑒定。第40頁/共45頁基因基因克隆基因轉(zhuǎn)化DNA重組技術(shù)植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)植物組織培養(yǎng)技術(shù)第41頁/共45頁分子標(biāo)記技術(shù)在育種中的應(yīng)用1. DNA1. DNA遺傳標(biāo)記的特點(diǎn)：遺傳標(biāo)記的特點(diǎn)：v 數(shù)量極多；數(shù)