王沛-微流控芯片檢測(cè)

1、微流控芯片檢測(cè)器微流控芯片檢測(cè)器主講人 ：王沛 微流控芯片檢測(cè)器的作用是將測(cè)定被分析樣品經(jīng)微流控芯片系統(tǒng)分離或處理后有關(guān)組成的組成及含量。是分析系統(tǒng)中必不可少的部分。檢測(cè)器的總體性能將影響整個(gè)微流控分析系統(tǒng)的檢出限、檢測(cè)速度、適用范圍、體積等指標(biāo)，是微流控分析系統(tǒng)的關(guān)鍵部位之一。2、微流控芯片檢測(cè)器分類(lèi)、微流控芯片檢測(cè)器分類(lèi), LIF檢測(cè)器是應(yīng)用最早、最多的光學(xué)檢測(cè)器，也是目前唯一被檢測(cè)器是應(yīng)用最早、最多的光學(xué)檢測(cè)器，也是目前唯一被商品化的檢測(cè)器，多應(yīng)用于毛細(xì)管電泳芯片中。商品化的檢測(cè)器，多應(yīng)用于毛細(xì)管電泳芯片中。特點(diǎn)：特點(diǎn)：n檢測(cè)限低：一般可達(dá)檢測(cè)限低：一般可達(dá)10-9mol/L10-12m

2、ol/L，最高可達(dá)單分子，最高可達(dá)單分子檢測(cè)；檢測(cè)；n選擇性好；選擇性好；n線性范圍寬。線性范圍寬。不足：不足：n通用性差，體積較大，結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，成本高。通用性差，體積較大，結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，成本高。2.1.1 激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器(Laser induced fluorescence, LIF)2.1.1 激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器 激發(fā)光源 單色激光 激光器 氬離子激光器 半導(dǎo)體激光器 2.1.1 激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器檢測(cè)元件：n 光電倍增管（PMT ）n 單光子雪崩型光電二級(jí)管（SPAD） n 電荷耦合器件CCD非共聚焦型非共聚焦型LIF檢測(cè)器基本光路

3、結(jié)構(gòu)示意圖檢測(cè)器基本光路結(jié)構(gòu)示意圖Analytical Chemistry, Vol. 68, No. 5, March 1, 1996正交型正交型LIF檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)共聚焦型共聚焦型LIF檢測(cè)器基本光路結(jié)構(gòu)示意圖檢測(cè)器基本光路結(jié)構(gòu)示意圖LED是一種可發(fā)射準(zhǔn)單色光、體積小、壽命長(zhǎng)和價(jià)廉的發(fā)光器件。雖然在發(fā)光強(qiáng)度、光譜純度、聚光性等方面不及半導(dǎo)體二極管激光器，靈敏度也有所下降，但可以簡(jiǎn)化檢測(cè)器的結(jié)構(gòu)，大大降低成本。Science 1998，282, 484490. 集成化的集成化的DNA分析芯片分析芯片集成化的集成化的DNA分析芯片分析芯片Science 1998，282, 484490Ana

4、lytical Chemistry, Vol. 73, No. 18, September 15, 2001液芯波導(dǎo)通道微芯片結(jié)構(gòu)和液芯波導(dǎo)通道微芯片結(jié)構(gòu)和LED熒光誘導(dǎo)檢測(cè)示意圖熒光誘導(dǎo)檢測(cè)示意圖2.1.3 集成一次性微流控芯片的便攜式熒光檢集成一次性微流控芯片的便攜式熒光檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)系統(tǒng)CHEN Xing et al.Nanotechnology and Precisio Engineering,2009,7(2):127-131特點(diǎn)：n可測(cè)定的物質(zhì)種類(lèi)多；n結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單。不足：n相對(duì)靈敏度低。n當(dāng)前微流控芯片紫外吸收光度檢測(cè)存在的主要問(wèn)題是檢測(cè)靈敏度較低，難以滿(mǎn)足以低濃度生化樣品為主要對(duì)象的檢

5、測(cè)要求。解決的辦法除了優(yōu)化檢測(cè)器光路結(jié)構(gòu)外，更多的應(yīng)該從微流控芯片本身來(lái)考慮。芯片材質(zhì)必須選用石英等紫外吸收小的材料，還應(yīng)鼓勵(lì)通過(guò)增加光程或集成樣品預(yù)濃縮單元如等速電泳、樣品堆積等來(lái)提高檢測(cè)的靈敏度。n普通光程吸收光度檢測(cè)芯片常用的玻璃，塑料等芯片材料對(duì)紫外線都有較大吸收，不適宜用于紫外檢測(cè)，石英或PDMS等紫外吸收小的芯片材料是較為合適的選擇。紫外吸收光度檢測(cè)器紫外吸收光度檢測(cè)器n固定波長(zhǎng)n可變變長(zhǎng)n多波長(zhǎng)快速掃描2.2.1 短光程吸收檢測(cè)池吸收光度檢測(cè)器短光程吸收檢測(cè)池吸收光度檢測(cè)器檢測(cè)偶氮砷-U（）金屬配合物，檢出限達(dá)23ug/L2.2.1 短光程吸收檢測(cè)池吸收光度檢測(cè)器短光程吸收檢測(cè)池

6、吸收光度檢測(cè)器2.2.2 長(zhǎng)光程吸收光度檢測(cè)長(zhǎng)光程吸收光度檢測(cè)2.2.2 長(zhǎng)光程吸收光度檢測(cè)長(zhǎng)光程吸收光度檢測(cè)n增加芯片吸收光程能將檢測(cè)靈敏度提高l2個(gè)數(shù)量級(jí)。n然而過(guò)度增加光程使峰展寬，柱效降低。n選擇通過(guò)增加光程長(zhǎng)度來(lái)提高靈敏度，要考慮其對(duì)柱效的影響，最終找到一個(gè)既能提高靈敏度而又不會(huì)顯著降低柱效的合適光程。2.3 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器 基態(tài)的分子吸收化學(xué)反應(yīng)中釋放的能量，躍遷至激發(fā)態(tài)，處于激發(fā)態(tài)的分子以光輻射的形式返回基態(tài)，從而產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。2.3.1 普通化學(xué)發(fā)光普通化學(xué)發(fā)光2.3.1 普通化學(xué)發(fā)光普通化學(xué)發(fā)光2.3.2 電致化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器電致化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器脯氨酸的LOD為 1

7、.2molL，線性范圍5600molL 2.4 電化學(xué)檢測(cè)器電化學(xué)檢測(cè)器2.4.1 安培檢測(cè)器安培檢測(cè)器2.4.1 安培檢測(cè)器安培檢測(cè)器 安培檢測(cè)法具有操作簡(jiǎn)便、背景噪聲電流小等優(yōu)點(diǎn)，1998年由Woolley等首次在芯片電泳上實(shí)現(xiàn)，現(xiàn)已發(fā)展成為微流控芯片中應(yīng)用最多的一種電化學(xué)檢測(cè)方式。 安培法不是通用型檢測(cè)方法，它要求被檢測(cè)物質(zhì)具有電化學(xué)活性，如果沒(méi)有則應(yīng)通過(guò)衍生反應(yīng)產(chǎn)生具有電化學(xué)活性的基團(tuán)或者在溶液中加入具有電化學(xué)活性的物質(zhì)以實(shí)現(xiàn)對(duì)被測(cè)物如DNA、蛋白質(zhì)和氨基酸的間接檢測(cè)。 安培檢測(cè)法的類(lèi)型芯片分離通道中的電流一般在幾到幾十個(gè)微安，而安培檢測(cè)的工作電極上產(chǎn)生的電流一般在納安級(jí)甚至更小，所以

8、在安培檢測(cè)法中如何減小甚至隔離分離電壓對(duì)檢測(cè)的影響是一個(gè)至關(guān)重要的問(wèn)題。根據(jù)隔離分離電壓的方式，安培檢測(cè)器可分為離柱式（off -colunmn）和端柱式（end-column）。2.4.1 安培檢測(cè)器安培檢測(cè)器n工作電極的材料 碳電極 金屬電極 化學(xué)修飾電極 Four configurations for aligning the working electrode in amperometric detection that facilitate isolation of the EC detector from the separation voltageSusan M. Lunte，e

9、t al. Electrophoresis 2004, 25, 352835492.4.1 安培檢測(cè)器安培檢測(cè)器-陣列工作電極陣列工作電極芯片毛細(xì)管電泳芯片毛細(xì)管電泳-陣列工作電極安培檢測(cè)系統(tǒng)陣列工作電極安培檢測(cè)系統(tǒng)2.4.2 電導(dǎo)檢測(cè)器電導(dǎo)檢測(cè)器 根據(jù)組分帶電組分對(duì)溶液電導(dǎo)率的貢獻(xiàn)而進(jìn)行檢測(cè)的。是一種通用型的檢測(cè)器，尤其適用于檢測(cè)無(wú)機(jī)離子、氨基酸等小分子離子的檢測(cè)。 易于微型化和集成化2.4.2 電導(dǎo)檢測(cè)器電導(dǎo)檢測(cè)器n接觸式電導(dǎo)檢測(cè)器n非接觸式電導(dǎo)檢測(cè)器接觸式電導(dǎo)檢測(cè)器接觸式電導(dǎo)檢測(cè)器電導(dǎo)檢測(cè)芯片結(jié)構(gòu)及電導(dǎo)電極示意圖電導(dǎo)檢測(cè)芯片結(jié)構(gòu)及電導(dǎo)電極示意圖 接觸式電導(dǎo)檢測(cè)器由于工作電極和通道里的溶液

10、直接接觸，可能會(huì)有以下問(wèn)題：n檢測(cè)系統(tǒng)難以與電泳分離電壓有效隔離，由于共地產(chǎn)生漏電干擾，使基線噪聲大。n反應(yīng)產(chǎn)生的氣泡或電極表面的污染均會(huì)影響檢測(cè)n通道流體中的某些成分會(huì)吸附在傳感電極表面，改變電極的性質(zhì)。2.4.3 電位檢測(cè)法電位檢測(cè)法2.4.3 電位檢測(cè)法電位檢測(cè)法電位檢測(cè)示意圖電位檢測(cè)示意圖復(fù)合式電化學(xué)檢測(cè)法復(fù)合式電化學(xué)檢測(cè)法 復(fù)合式電化學(xué)檢測(cè)法是將多種電化學(xué)檢測(cè)方式聯(lián)用使用可以充分發(fā)揮每種檢測(cè)方式的優(yōu)點(diǎn)，相互補(bǔ)充，實(shí)現(xiàn)更多被分析物的同時(shí)分離和檢測(cè)，因而也得到了廣泛的關(guān)注。 Wang和Pumera發(fā)展了一種新型的可以實(shí)現(xiàn)非接觸電導(dǎo)和安培法同時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)。CE microchip syste

11、m with a dual amperometric/conductivity detection system: (a) glass microchip, (b) run buffer reservoir, (c) sample reservoir, (d) unused reservoir, (e) aluminum electrodes for contactless conductivity detection, (f) channel outlet,(g) thick-film working electrode for amperometric detection.Erkang W

12、ang,et al.Electrophoresis 2005, 26, 687693n雙通道檢測(cè)器是指將兩種檢測(cè)器同時(shí)集成在芯片上，以實(shí)現(xiàn)對(duì)管道內(nèi)信號(hào)變化的同時(shí)檢測(cè)。雙通道檢測(cè)可獲得更多分析物質(zhì)的信息，更能真正體現(xiàn)微全分析的概念。n近年來(lái)，在玻璃電泳芯片上集電導(dǎo)和熒光雙通道檢測(cè)器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)無(wú)機(jī)離子、熒光素和氨基酸等物質(zhì)的同時(shí)在線檢測(cè)，其將接觸式電導(dǎo)(CCD)檢測(cè)器與LED檢測(cè)器同集一芯片上時(shí)檢測(cè)帶具有光學(xué)活性和非具有光學(xué)活性的物質(zhì)，拓寬了檢測(cè)對(duì)象的范圍。Fig. 1 A scheme of the dual detector. (A) Box for circuitboard; (B) bot

13、tom board; (C) contactless electrode plate; (D)thin microchip. (1) LED; (2, 3) the electrodes of contactlessconductivity detection; (4) pinhole; (5, 6) wires connectingthe electrodes of contactless conductivity detection withthe circuit board; (7) cut off filter; (8) photodiode; (9, 10)cables connec

14、ting the photodiode with the circuit board.Zuan-guang Chen,et al.analytica chimica acta 621 (2008) 171177 集成電導(dǎo)檢測(cè)器應(yīng)用于實(shí)際樣品是其發(fā)展的必然趨勢(shì)，而如何有效排除實(shí)際樣品中的干擾組分對(duì)檢測(cè)的影響是電導(dǎo)檢測(cè)在實(shí)際樣品應(yīng)用中的關(guān)鍵所在。 實(shí)現(xiàn)高通量是微流控芯片研究中提高分析效率的重要研究目標(biāo)之一，因此，多通道陣列式檢測(cè)器的研究也成為了熱點(diǎn)，而電導(dǎo)檢測(cè)器易于微型化的優(yōu)勢(shì)特別適于與高通量芯片集成。 微流控芯片集成電導(dǎo)檢測(cè)器具有操作方便、使用壽命長(zhǎng)等特點(diǎn)，尤其適合離子化合物的分離分析。其加工工

15、藝與MEMS技術(shù)兼容，使其在微流控的集成化、微型化方面顯示出強(qiáng)大的發(fā)展?jié)摿?。檢測(cè)電極在微流控芯片上可采用不同的布置方式，并結(jié)合芯片微管道網(wǎng)絡(luò)本身靈活多樣的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)出多種多樣具有各自特點(diǎn)與功能的微流控芯片集成電導(dǎo)檢測(cè)器。其可應(yīng)用于生化樣品和實(shí)際樣品的檢測(cè)，顯示出芯片集成電導(dǎo)檢測(cè)器具有巨大的潛在商業(yè)價(jià)值。n質(zhì)譜（MS）技術(shù)能夠提供試樣組分中分子的結(jié)構(gòu)和定量信息。電噴霧離子化（ESI）和基質(zhì)輔助激光解析離子化(MALDI)技術(shù)使其在特定的條件下電離時(shí)依然可以保持生物大分子的非共價(jià)相互作用，使得質(zhì)譜在蛋白質(zhì)和多肽的研究中必不可少。nMS檢測(cè)的高效率、高靈敏度和高通量迎合了芯片微小樣品量及微流控系統(tǒng)的

16、目標(biāo)，兩者聯(lián)用可滿(mǎn)足基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)等生物分析的需要。n芯片與ESI-MS接口n芯片與MAIDL-MS接口2.5.1 芯片與芯片與ESI-MS接口接口n外接毛細(xì)管的引入雖然簡(jiǎn)化了接口裝置，卻也帶來(lái)了一定的死體積。這種死體積的存在在一定程度上稀釋了待測(cè)物、延長(zhǎng)了組分的遷移時(shí)間，使質(zhì)譜分析的分辨率和靈敏度下降。小死體積甚至零死體積接口的研制是這個(gè)領(lǐng)域研究的一個(gè)熱點(diǎn)，其中以Harrison和Thibault實(shí)驗(yàn)室的工作較為突出。他們?cè)谛酒┒算@一個(gè)平面的孔對(duì)準(zhǔn)通道，將一根毛細(xì)管插入孔中用環(huán)氧膠固定，使毛細(xì)管和通道連接的死體積大大降低。n由于傳統(tǒng)的鞘流液輔助的電噴霧接口對(duì)樣品的稀釋作用明顯，造成檢

17、測(cè)靈敏度低，因此一般采用無(wú)鞘流液輔助的納米電噴霧接口。較為普遍方法是將連接在芯片上的毛細(xì)管的末端拉細(xì)至220nm形成“納米”噴頭，或者通過(guò)一個(gè)套管與制備好的納米噴頭連接，不僅節(jié)省一整套輔流或液接部件，還簡(jiǎn)化了接口的復(fù)雜性。但是此結(jié)構(gòu)的接口需要在納米噴頭的末端鍍上金屬或?qū)щ姼叻肿訉?，或者在納米噴頭中插人電極絲用于施加ESI的電壓。不同死體積的芯片不同死體積的芯片毛細(xì)毛細(xì)管連接管連接2.5.1 芯片與芯片與ESI-MS接口接口Analytical Chemistry, Vol. 71, No. 15, August 1, 1999微流控芯片通過(guò)鞘和霧化器微流控芯片通過(guò)鞘和霧化器-ESI聯(lián)用示意圖聯(lián)

18、用示意圖2.5.1 芯片與芯片與ESI-MS接口接口-2.5.1 芯片與芯片與ESI-MS質(zhì)譜實(shí)時(shí)檢測(cè)酯化反應(yīng)2.5.2 芯片與MALDI-MS接口 與ESIMS相比MALDIMS更適于用作微流控分析系統(tǒng)的檢測(cè)器。因?yàn)樗哂邢率鎏攸c(diǎn)：n對(duì)樣品組成要求低，能耐高濃度鹽和非揮發(fā)性緩沖劑(包括芯片電泳體系中常用的硫酸鹽、磷酸鹽、硼酸鹽等)。n靈敏度高。樣品量只需1pmol甚至更低。n譜圖中單電荷、雙電荷的分子離子峰很強(qiáng)，便于峰信號(hào)重組和解析。 由于MALDI離子化過(guò)程中通常要求樣品與基質(zhì)共結(jié)晶，要實(shí)現(xiàn)微流控芯片微液中流體系與MALDI離子源的直接聯(lián)用仍行在很大的困難。就目前的發(fā)展來(lái)看微流控芯片與MA

19、LDIMS的聯(lián)用仍處于起步階段。2.6 其他檢測(cè)其他檢測(cè)激光熱透鏡檢測(cè)器機(jī)構(gòu)示意圖激光熱透鏡檢測(cè)器機(jī)構(gòu)示意圖優(yōu)點(diǎn)：其檢測(cè)靈敏度很高，可接優(yōu)點(diǎn)：其檢測(cè)靈敏度很高，可接近熒光檢測(cè)方法的水平。近熒光檢測(cè)方法的水平。不足：但裝置較為精密和復(fù)雜，不足：但裝置較為精密和復(fù)雜，很難微型化，由此其應(yīng)用尚不廣很難微型化，由此其應(yīng)用尚不廣泛。泛。2.6.2 折光率檢測(cè)器折光率檢測(cè)器2.6.2 折光率檢測(cè)器折光率檢測(cè)器2.6.3 分子發(fā)射光譜檢測(cè)器分子發(fā)射光譜檢測(cè)器離子體發(fā)射光譜檢測(cè)芯片結(jié)構(gòu)示意圖離子體發(fā)射光譜檢測(cè)芯片結(jié)構(gòu)示意圖發(fā)射光譜檢測(cè)裝置示意圖發(fā)射光譜檢測(cè)裝置示意圖1.氣體進(jìn)口 2.氣體出口3.壓力傳感器接口

20、4.電極 5.等離子腔6.電極連接端7.進(jìn)口通道 8.出口通道對(duì)鈉離子的檢測(cè)為對(duì)鈉離子的檢測(cè)為1ug/L2.7 紙質(zhì)微流控芯片與商用電化學(xué)檢測(cè)器聯(lián)用紙質(zhì)微流控芯片與商用電化學(xué)檢測(cè)器聯(lián)用n紙質(zhì)微流控芯片與電化學(xué)檢測(cè)器聯(lián)用為開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)易、 便攜化的診斷平臺(tái)提供了一種新的手段。近期， 美國(guó)哈佛大學(xué)的Nie等研制了一種新型紙質(zhì)微流控芯片， 可替代商品化的血糖試紙條， 并與血糖檢測(cè)儀配合使用， 實(shí)現(xiàn)了對(duì)血液樣本內(nèi)葡萄糖的定量檢測(cè)。該芯片化試紙條具有降低檢測(cè)成本、 擴(kuò)展檢測(cè)范圍的潛力。 George M. Whitesides et al.Lab Chip, 2010, 10, 3163-3169 該芯片化試紙條具有降低檢測(cè)成本、 擴(kuò)展檢測(cè)范圍的潛力。利用這種新型芯片試紙條進(jìn)行血糖檢測(cè)， 檢出限可達(dá)26mg/dL ， 最小樣品消耗量約為50L， 與商用試紙條相當(dāng)。此外，它還可以檢測(cè)體液中的膽固醇和乳酸 （檢出限分別為