小鼠移植瘤模型動(dòng)態(tài)觀察

1、小鼠移植瘤模型動(dòng)態(tài)觀察 摘要：利用小鼠移植瘤模型動(dòng)態(tài)觀察血管生成擬態(tài)的時(shí)空變化。方法：采用B16黑色素瘤細(xì)胞和C57小鼠制作小鼠惡性黑色素移植瘤動(dòng)物模型，成瘤后根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表每天隨機(jī)抽取一只小鼠處死，共12d，獲得腫瘤樣本114例。常規(guī)HE染色和CD31、PAS染色。顯微鏡下分別計(jì)數(shù)腫瘤組織中央?yún)^(qū)和外周區(qū)的高倍視野（400）下血管生成擬態(tài)以及內(nèi)皮依賴性血管。結(jié)果：在移植瘤形成的第18天，腫瘤組織內(nèi)存在血管生成擬態(tài)。第912天該結(jié)構(gòu)被內(nèi)皮依賴性血管替代。腫瘤中央?yún)^(qū)、外周區(qū)血管生成擬態(tài)密度均呈現(xiàn)先遞增后遞減趨勢(shì)；兩個(gè)區(qū)域內(nèi)的血管生成擬態(tài)密度比較：在第16天內(nèi)腫瘤中央?yún)^(qū)高于外周區(qū)，在第78天腫瘤外周

2、區(qū)高于中央?yún)^(qū)。內(nèi)皮依賴性血管在腫瘤組織的中央?yún)^(qū)和外周區(qū)呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)。兩個(gè)區(qū)域內(nèi)的內(nèi)皮依賴性血管密度比較：在第17天腫瘤中央?yún)^(qū)內(nèi)皮依賴性血管密度高于外周區(qū)，在第812d兩個(gè)區(qū)域內(nèi)的內(nèi)皮依賴性血管密度無明顯差別。血管生成擬態(tài)密度與腫瘤組織的壞死率之間呈密切負(fù)相關(guān)（r=-0.978,P<0.05）；內(nèi)皮依賴性血管密度與腫瘤組織壞死率之間亦存在負(fù)相關(guān)（r=-0.230,P<0.05）。結(jié)論：黑色素瘤移植瘤中血管生成擬態(tài)是腫瘤細(xì)胞為適應(yīng)環(huán)境而產(chǎn)生的一種暫時(shí)性的血液供應(yīng)方式，與內(nèi)皮依賴性血管并存于腫瘤組織內(nèi)。隨腫瘤生長(zhǎng)變化而與內(nèi)皮依賴性血管之間存在一定的時(shí)空變化規(guī)律。 【關(guān)鍵詞

3、】 血管生成擬態(tài)；腫瘤血管生成；惡性黑色素瘤 血管生成擬態(tài)是一種與傳統(tǒng)的腫瘤血管生成途徑完全不同的、不依賴內(nèi)皮細(xì)胞的全新的腫瘤細(xì)胞的血液供應(yīng)方式。1999年由美國lowas大學(xué)的Maniotis和Folberg等提出，他們對(duì)眼葡萄膜惡性黑色素瘤微循環(huán)研究時(shí)發(fā)現(xiàn)惡性黑色素瘤細(xì)胞通過自身變形和與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，模擬血管壁結(jié)構(gòu)形成可輸送血液的管道，從而重塑腫瘤的微循環(huán)，并且與宿主血管相連通，使腫瘤獲得血液供應(yīng)，命名為血管生成擬態(tài)16。 2005年10月河北北方學(xué)院學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）第5期2005年10月張 凡等：小鼠黑色素瘤移植瘤中血管生成擬態(tài)的時(shí)空變化第5期血管生成擬態(tài)概念的提出豐富了腫瘤血液供應(yīng)

4、理論，但目前對(duì)它與內(nèi)皮依賴性血管之間的演變規(guī)律缺乏認(rèn)識(shí)，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上首次提出了血管生成擬態(tài)的時(shí)空變化概念：即血管生成擬態(tài)是腫瘤血液供應(yīng)的一種暫時(shí)性替代模式，在腫瘤發(fā)生發(fā)展的一定時(shí)期內(nèi)存在，在腫瘤的不同區(qū)域存在不同的變化趨勢(shì)，并利用小鼠移植瘤模型連續(xù)觀察對(duì)我們的假說進(jìn)行驗(yàn)證。 1 材料和方法 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57小鼠購自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物室，68周齡，共20只，雌雄各半，體重2530g，編號(hào)后天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心潔凈實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。 1.2 實(shí)驗(yàn)方法 先將黑色素瘤細(xì)胞株B16復(fù)蘇，1640細(xì)胞培養(yǎng)基上培養(yǎng)6d，使細(xì)胞排滿瓶底，0.2%胰酶消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度達(dá)到11

5、07/ml。75%酒精消毒小鼠鼠蹊部，每只小鼠鼠蹊部皮下注射0.2ml細(xì)胞懸液。每天觀察動(dòng)物生命體征及腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，10d后接種部位開始出現(xiàn)皮下腫塊。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表每天抽取一只小鼠處死，共持續(xù)12d。解剖并仔細(xì)檢查動(dòng)物全身，共獲得腫瘤樣本114例。全部標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋。 1.3 計(jì)算機(jī)圖象處理 一抗CD31、HMB45為鼠抗小鼠單克隆抗體，即用型，6ml包裝，SNATA CRUZ生產(chǎn)，進(jìn)口分裝；CathepsinD、MMP2、MMP9兔抗多克隆抗體，使用空軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)工程研究所的BIN DAF IMG圖象采集處理系統(tǒng)（91年版）計(jì)算每張切片中壞死面積。 1.4 計(jì)數(shù)

6、方法 1.4.1 區(qū)域劃分 中央?yún)^(qū)與外周區(qū)的劃分：避開腫瘤壞死,將每張切片中腫瘤組織鏡下視野均勻分成三等份，即內(nèi)1/3、中1/3、外1/3三個(gè)區(qū)域，內(nèi)1/3區(qū)域即為中央?yún)^(qū)，外1/3即為外周區(qū)。血管生成擬態(tài)周圍與遠(yuǎn)離血管生成擬態(tài)、內(nèi)皮依賴性血管周圍與遠(yuǎn)離內(nèi)皮依賴性血管的劃分：以血管生成擬態(tài)、內(nèi)皮依賴性血管為中心的高倍視野定義為血管生成擬態(tài)、內(nèi)皮依賴性血管周圍；距離上述視野一個(gè)高倍視野的腫瘤細(xì)胞即為遠(yuǎn)離血管生成擬態(tài)和內(nèi)皮依賴性血管。血管生成擬態(tài)判斷標(biāo)準(zhǔn)：無內(nèi)皮細(xì)胞襯復(fù)的PAS陽性管道、襯復(fù)PAS陽性物質(zhì)的腫瘤細(xì)胞圍成不規(guī)則管腔，且管腔內(nèi)存在紅細(xì)胞，周圍沒有出血壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。 1.4.2 計(jì)數(shù)

7、方法 低倍鏡下找到血管生成擬態(tài)和內(nèi)皮依賴性血管存在的典型區(qū)域，換成高倍鏡（400），連續(xù)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野內(nèi)的血管生成擬態(tài)、內(nèi)皮依賴性血管，取其均值即為血管生成擬態(tài)密度、內(nèi)皮依賴性血管密度。同時(shí)計(jì)數(shù)血管生成擬態(tài)周圍、內(nèi)皮依賴性血管周圍、遠(yuǎn)離血管生成擬態(tài)、遠(yuǎn)離內(nèi)皮依賴性血管的腫瘤細(xì)胞中各種指標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)（各項(xiàng)指標(biāo)均連續(xù)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野內(nèi)隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，取其均值）。 1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)該實(shí)驗(yàn)資料進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2 結(jié)果 2.1 腫瘤組織內(nèi)的血管生成擬態(tài)的形態(tài)學(xué)特點(diǎn) 通過CD31和PAS

8、雙重染色，在該移植瘤的第18天可見到腫瘤間質(zhì)中櫻桃紅色的PAS陽性血管樣圖案，在第912天該結(jié)構(gòu)逐漸被內(nèi)皮依賴性血管所替代。PAS陽性血管樣圖案呈現(xiàn)多種形狀（直的、平行的、交叉的、環(huán)狀的、有分支的和網(wǎng)狀的），PAS管狀結(jié)構(gòu)的管壁厚薄不一，有的PAS管狀結(jié)構(gòu)中可以見到單行排列的紅細(xì)胞。同時(shí)可見到典型的血管生成擬態(tài)樣結(jié)構(gòu)：外層為CD31染色陰性的腫瘤細(xì)胞，內(nèi)襯櫻桃紅色的PAS陽性物質(zhì)，管腔內(nèi)有成堆的紅細(xì)胞，證實(shí)惡性黑色素移植瘤中也存在血管生成擬態(tài)結(jié)構(gòu)，并且具有腫瘤血液供應(yīng)功能。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)有的血管生成擬態(tài)中腫瘤細(xì)胞圍成的不規(guī)則管腔內(nèi)無PAS陽性物質(zhì)襯復(fù)，同時(shí)管腔內(nèi)存在紅細(xì)胞。 2.2 血管生成擬態(tài)

9、和內(nèi)皮依賴性血管在黑色素瘤不同移植時(shí)間和不同區(qū)域變化 本實(shí)驗(yàn)小鼠移植腫瘤組織內(nèi)的血管生成擬態(tài)出現(xiàn)在移植瘤形成后的第18天，并與內(nèi)皮依賴性血管共同存在。隨著移植腫瘤的發(fā)展，血管生成擬態(tài)在腫瘤的不同區(qū)域呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)。腫瘤中央?yún)^(qū)的血管生成擬態(tài)密度在移植瘤形成后的第13天呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，在第48天呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)。腫瘤外周區(qū)的血管生成擬態(tài)密度在第14天呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，在第58天呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)。從空間上對(duì)比兩個(gè)區(qū)域內(nèi)的血管生成擬態(tài)密度顯示：在第16天腫瘤中央?yún)^(qū)的密度高于外周區(qū)的密度，在第78天腫瘤外周區(qū)的密度高于中央?yún)^(qū)的密度。內(nèi)皮依賴性血管密度在腫瘤的中央?yún)^(qū)和外周區(qū)均呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)。空間上對(duì)比兩個(gè)區(qū)域內(nèi)的內(nèi)皮

10、依賴性血管密度發(fā)現(xiàn)：在第17天腫瘤中央?yún)^(qū)的密度高于外周區(qū)密度，在第812天腫瘤兩個(gè)區(qū)域內(nèi)密度差別不明顯。對(duì)腫瘤中央?yún)^(qū)和外周區(qū)的血管生成擬態(tài)密度和內(nèi)皮依賴性血管密度做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示兩個(gè)區(qū)域內(nèi)的血管生成擬態(tài)密度和內(nèi)皮依賴性血管密度均無差別。表1 不同區(qū)域血管生成擬態(tài)密度的比較（個(gè)/高倍視野）表2 不同區(qū)域內(nèi)皮依賴性血管密度的比較（個(gè)/高倍視野） 2.3 CD31在腫瘤不同區(qū)域的表達(dá) 顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)部分的腫瘤細(xì)胞表達(dá)CD31抗原，同時(shí)圍成血管生成擬態(tài)的腫瘤細(xì)胞不表達(dá)或極少表達(dá)CD31抗原，血管生成擬態(tài)周圍的腫瘤細(xì)胞高表達(dá)CD31抗原。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示：血管生成擬態(tài)周圍的腫瘤細(xì)胞CD31的表達(dá)高于遠(yuǎn)離血管生成擬態(tài)腫瘤細(xì)胞的表達(dá)，內(nèi)皮依賴性血管周圍腫瘤細(xì)胞的CD31表達(dá)與遠(yuǎn)離內(nèi)皮依賴性血管腫瘤細(xì)胞的表達(dá)之間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，血管生成擬態(tài)周圍腫瘤細(xì)胞CD31的表達(dá)與內(nèi)皮依賴性血管周圍腫瘤細(xì)胞表達(dá)之間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表3）。表3 CD31在腫瘤不同區(qū)域的表達(dá)（個(gè)/高倍視野）表4 血管生成擬態(tài)密度、內(nèi)皮依賴性血管密度與壞死之間的關(guān)系 3 討論 血管生成擬態(tài)的概念提出豐富和完善了腫瘤血液供應(yīng)理論，同時(shí)也對(duì)很多