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文檔簡介

1、 紅細胞膜蛋白提取鑒定紅細胞膜蛋白提取鑒定內(nèi)容內(nèi)容 1. 紅細胞膜提取紅細胞膜提取 2. 膜蛋白提取及定量測定(膜蛋白提取及定量測定(lowry法)法) 3.膜蛋白電泳分離、分子量測定膜蛋白電泳分離、分子量測定 sds-page 4.western blotting 鑒定鑒定-actin 實驗報告要求實驗報告要求: 分別按上各點,寫出:原理,操作步驟,結(jié)果,討論,結(jié)論分別按上各點,寫出:原理,操作步驟,結(jié)果,討論,結(jié)論 手寫,手寫,a4 紙大小紙大小 ,報告首頁寫明,報告首頁寫明 實驗者,專業(yè)。實驗者,專業(yè)。實驗分組每個班分三大組,每組十人左右,選出組長每個班分三大組,每組十人左右,選出組長實

2、驗進行一大組為單位實驗進行一大組為單位 1.1.純化純化rbcrbc膜膜 2.sds-page 22.sds-page 2塊膠(一個凝膠架)塊膠(一個凝膠架) 3.western blot3.western blot 4.3-4 4.3-4 人一小組測定蛋白質(zhì)含量人一小組測定蛋白質(zhì)含量 一一.紅細胞膜提取制備(低滲法紅細胞膜提取制備(低滲法)原理:原理: rbc置低滲緩沖液置低滲緩沖液(ph7.4),破裂溶血,破裂溶血 溶血液。溶血液。 溶血液置高速離心作用中,去除溶液中溶血液置高速離心作用中,去除溶液中hb和和其它內(nèi)含物,制得純凈的其它內(nèi)含物,制得純凈的rbc膜稱為血影膜稱為血影 “ghos

3、t”注意事項:注意事項:1.1.離心步驟一定要離心步驟一定要“平衡、對稱放置平衡、對稱放置”2.2.溶血液離心后上清吸取小心,以免丟失溶血液離心后上清吸取小心,以免丟失“膜膜”3. 3. 緩沖液緩沖液ph7.4ph7.4,偏酸使,偏酸使hbhb殘留增加殘留增加4.4.此分離方法適合于人、大鼠;牛、豬等易使此分離方法適合于人、大鼠;牛、豬等易使脂蛋白脫落,脂蛋白脫落,1mmcacl1mmcacl2 2可防止此種膜的不穩(wěn)可防止此種膜的不穩(wěn)定性。定性。5.5.本實驗因條件限制,在常溫離心。如需保持本實驗因條件限制,在常溫離心。如需保持蛋白活性,應在蛋白活性,應在4 4c c離心。離心。(1)rbc分

4、離:分離: 15 ml rbc液液 2000rpm 5分鐘分鐘 rbc(沉淀)(沉淀)3倍體積倍體積等滲等滲磷酸磷酸buffer 2000rpm 5分鐘分鐘2 洗凈之洗凈之rbc (2)溶血液制備)溶血液制備 rbc加入加入低滲低滲磷酸磷酸buffer(1:50) (在在 燒杯中)燒杯中) 稍攪拌稍攪拌 置冰箱凍格(置冰箱凍格(4c)溶血過夜)溶血過夜 (以上步驟已完成?。ㄒ陨喜襟E已完成?。┤苎?,用溶血液,用“水泵水泵”吸去上清。吸去上清。 ?。耗ず茌p?。耗ず茌p二、二、 rbc膜純化(洗滌)膜純化(洗滌) rbc膜轉(zhuǎn)至膜轉(zhuǎn)至 1.5ml塑料管(塑料管(2個個/大組)大組) 9000rpm

5、5 沉淀(膜)沉淀(膜)低滲低滲磷酸磷酸buffer(ph7.4) ?ml (吹打)(吹打) 9000rpm 54 沉淀沉淀 等滲等滲磷酸磷酸buffer 1ml 9000rpm 5分鐘分鐘 沉淀(沉淀(rbc膜)膜)0.6ml等滲等滲buffer (即為(即為rbc原液)原液)三、三、 樣品處理:樣品處理: 1.sds-page用樣品處理(一大組):用樣品處理(一大組): 0.3ml rbc原液原液+0.3ml 樣品溶解液樣品溶解液 沸水浴沸水浴 5 2.lowry法測定用樣品處理法測定用樣品處理 (3-4 人人/group): a. 取取0.3ml rbc原液原液 1.5ml h2o 15

6、0ul naoh 沸水浴沸水浴 5 待測管待測管1: 取取a液液0.1ml0.9ml h2o 待測管待測管2: 取取a液液0.3ml0.7ml h2o四、四、lowry法測定膜蛋白含量法測定膜蛋白含量立即搖勻,放置立即搖勻,放置15分鐘。以第管為空白管,在分光光度計上以分鐘。以第管為空白管,在分光光度計上以620比色,讀取。比色,讀取。以各管標準蛋白濃度為橫座標,各管吸光度值為縱座標作圖,畫出標準曲線。以各管標準蛋白濃度為橫座標,各管吸光度值為縱座標作圖,畫出標準曲線。2.2.紅細胞膜樣品蛋白含量的測定紅細胞膜樣品蛋白含量的測定 將待測管將待測管1、2同上加入堿性銅及酚試劑,一同測定同上加入堿

7、性銅及酚試劑,一同測定 管號管號試劑試劑h2o (ml) 0.90.80.60.40.21.0標準蛋白標準蛋白0.10.20.40.60.8_堿性銅試劑堿性銅試劑搖勻,放置分鐘搖勻,放置分鐘酚試劑酚試劑含標準蛋白含標準蛋白ug255010015020001.1.標準曲線制備標準曲線制備作圖作圖: 橫坐標以標準蛋白含量橫坐標以標準蛋白含量 縱坐標以縱坐標以a620a620吸光度值吸光度值 圖比例應為圖比例應為3:23:2(橫:縱)(橫:縱)計算:計算: 在標準曲線上查出待測樣品的濃度,計算在標準曲線上查出待測樣品的濃度,計算 提取膜的提取膜的 pr mgpr mg數(shù)數(shù)/ml/ml樣品樣品 注意稀

8、釋倍數(shù)注意稀釋倍數(shù)要求要求:計算原提取計算原提取rbcrbc液的液的prpr含量含量五、五、sds-page測定膜蛋白分子量測定膜蛋白分子量 不連續(xù)電泳系統(tǒng)不連續(xù)電泳系統(tǒng): 電泳緩沖液電泳緩沖液ph離子強度與凝膠中不同(濃縮效應)離子強度與凝膠中不同(濃縮效應) (一)垂直板安裝(一)垂直板安裝 每套板兩塊玻璃下端對齊,每套板兩塊玻璃下端對齊,夾好,放在膠架上!夾好,放在膠架上! (二)凝膠制備(見表)(二)凝膠制備(見表) 先配好分離膠(留距齒先配好分離膠(留距齒梳梳1cm),待其凝固后,),待其凝固后,再配濃縮膠。再配濃縮膠。 (三)電泳裝置安裝(三)電泳裝置安裝 先裝內(nèi)槽,試無滲漏;先裝

9、內(nèi)槽,試無滲漏; 放入外槽中,加放入外槽中,加buffer。 上樣品:上樣品: 每孔每孔18ul,2塊塊/組組 每塊板留一每塊板留一標準蛋白孔標準蛋白孔(四)(四) 電泳:電泳: 100v進分離膠調(diào)至進分離膠調(diào)至80v 約約1.5小時小時 10分離膠分離膠 10 ml5濃縮膠濃縮膠 5ml30凝膠儲備液凝膠儲備液3.31.0蒸餾水蒸餾水4.04.01.5mol/l tris-hcl buffer2.51mol/l tris-hcl buffer1.010sds0.10.0810 過硫酸銨過硫酸銨0.06(60ul)0.06(60ul)temed8ul8ul加入過硫酸銨,加入過硫酸銨,temed

10、即刻灌膠。即刻灌膠。(五)取膠(五)取膠: : 用專用板平面輕輕用專用板平面輕輕“橇橇”開板,推入小平皿中。開板,推入小平皿中。 注意:注意: 一塊半干轉(zhuǎn)移(浸入轉(zhuǎn)移一塊半干轉(zhuǎn)移(浸入轉(zhuǎn)移buffer20minbuffer20min) 另一塊考馬斯亮藍染色另一塊考馬斯亮藍染色 染色染色2 2小時后,小時后,7%7%醋酸脫色(醋酸脫色(4 4) 每組做好標記(寫好名字),交生化室掃描或攝像每組做好標記(寫好名字),交生化室掃描或攝像保留。保留。分子量計算分子量計算1.測量:測量: cmcm a.a.每條帶距離每條帶距離 (起始點至帶中心)(起始點至帶中心) b b. .起始至示蹤染料距離起始至示

11、蹤染料距離2. mr2. mr: 條帶距離條帶距離(a)(a) mr= mr= 起始至示蹤染料距離起始至示蹤染料距離 (b)(b)ab1410062403024分子量分子量kd遷移距離遷移距離cmmr705540352515預染標準蛋白3.半對數(shù)圖:(六條標準蛋白)半對數(shù)圖:(六條標準蛋白)(參照統(tǒng)計學散點法)參照統(tǒng)計學散點法) 橫坐標橫坐標為遷移率為遷移率mr 縱坐標縱坐標為為logm(直接按每一蛋白分子量標在半對數(shù)圖中)(直接按每一蛋白分子量標在半對數(shù)圖中)4.計算待測樣品蛋白質(zhì)分子量:計算待測樣品蛋白質(zhì)分子量: 選在標準蛋白遷移范圍內(nèi)的相應待測樣品中的三選在標準蛋白遷移范圍內(nèi)的相應待測樣

12、品中的三條帶,測量距離計算條帶,測量距離計算mr,mw 9876543210.1 0.2 0.3 0.4.橫坐標為遷移率橫坐標為遷移率mr;(六條標準蛋白);(六條標準蛋白)縱坐標為縱坐標為logm(直接按每一標準蛋白分子量)(直接按每一標準蛋白分子量)2060100六、六、western blotting(-actin鑒定鑒定)1.轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜 將與凝膠塊將與凝膠塊(切去多余部分切去多余部分)一般大小的一般大小的nc膜、濾紙均浸入轉(zhuǎn)移膜、濾紙均浸入轉(zhuǎn)移buffer中中20分鐘,取出,在半干轉(zhuǎn)移槽中按以下順序放置:分鐘,取出,在半干轉(zhuǎn)移槽中按以下順序放置: (上)上)陰極端陰極端 濾紙濾紙-凝膠凝膠-膜膜-濾紙濾紙 陽極端(下)陽極端(下) 用玻棒滾動去除空氣氣泡,蓋好上蓋。用玻棒滾動去除空氣氣泡,蓋好上蓋。 開啟電源,調(diào)電壓時間開啟電源,調(diào)電壓時間20 v, 20分鐘分鐘2.封閉封閉 將膜取出將膜取出tbst中洗中洗5,放置于封閉液中,放置于封閉液中10分鐘,用分鐘,用tbst洗洗53;3.一抗孵育一抗孵育 將膜放入已放一抗溶液塑料袋中,室溫孵育將膜放入已放一抗溶液塑料袋中,室溫孵育 1小時,用小時,用tbst洗洗5分鐘分鐘3;4.二抗孵育二抗孵育 將膜放入已放二抗溶液的

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