實(shí)驗(yàn)五原核表達(dá)

1、實(shí)驗(yàn)五實(shí)驗(yàn)五 原核原核表達(dá)表達(dá)一、原理一、原理v1、 e.colie.coli表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)ve.colie.coli是重要的原核表達(dá)體系。在重是重要的原核表達(dá)體系。在重組基因轉(zhuǎn)化入組基因轉(zhuǎn)化入e.colie.coli 菌株以后，通過菌株以后，通過溫度的控制，誘導(dǎo)其在宿主菌內(nèi)表達(dá)溫度的控制，誘導(dǎo)其在宿主菌內(nèi)表達(dá)目的蛋白質(zhì)，將表達(dá)樣品進(jìn)行目的蛋白質(zhì)，將表達(dá)樣品進(jìn)行sds-sds-page page 以檢測(cè)表達(dá)蛋白質(zhì)以檢測(cè)表達(dá)蛋白質(zhì)。v本實(shí)驗(yàn)采用異丙基硫代本實(shí)驗(yàn)采用異丙基硫代-d-d-半乳糖半乳糖昔（昔（iptgiptg）誘導(dǎo)外源基因表達(dá)）誘導(dǎo)外源基因表達(dá)2.sds-2.sds-聚丙烯酰胺凝膠電

2、泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（sds-pagesds-page） 使用含有十二烷基硫酸鈉（使用含有十二烷基硫酸鈉（ sdssds）和還原劑）和還原劑（通常為巰基乙醇）的樣品處理液對(duì)蛋白質(zhì)樣（通常為巰基乙醇）的樣品處理液對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行處理（一般煮沸品進(jìn)行處理（一般煮沸3-53-5分鐘），通過加熱分鐘），通過加熱和和sdssds可以使蛋白質(zhì)變性，多亞基的蛋白質(zhì)也可以使蛋白質(zhì)變性，多亞基的蛋白質(zhì)也將解離為單亞基。將解離為單亞基。vsdssds是變性劑，它能破裂蛋白質(zhì)分子中的氫鍵是變性劑，它能破裂蛋白質(zhì)分子中的氫鍵和疏水作用。巰基乙醇打開二硫鍵，因此使和疏水作用。巰基乙醇打開二硫鍵，因此使蛋白質(zhì)分子處于伸

3、展?fàn)顟B(tài)。蛋白質(zhì)分子處于伸展?fàn)顟B(tài)。聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn) 蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的遷移率取決于它所帶的蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的遷移率取決于它所帶的凈電荷以及分子大小和形狀等因素。凈電荷以及分子大小和形狀等因素。加入加入sdssds（十二烷基磺酸鈉）和少量巰基乙（十二烷基磺酸鈉）和少量巰基乙醇，則蛋白質(zhì)分子的遷移率主要取決于它醇，則蛋白質(zhì)分子的遷移率主要取決于它的的分子量，而與原來所帶電荷、分子形狀分子量，而與原來所帶電荷、分子形狀無關(guān)。無關(guān)。電泳過程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，大分電泳過程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，大分子滯后。電泳凝膠相當(dāng)于凝膠過濾中的一個(gè)帶孔膠粒子滯

4、后。電泳凝膠相當(dāng)于凝膠過濾中的一個(gè)帶孔膠粒。混合樣品混合樣品帶孔膠帶孔膠 按分子按分子大小分離大小分離電泳方向電泳方向 電泳電泳 小分子小分子大分子大分子二、試劑二、試劑vlb培養(yǎng)基培養(yǎng)基 vsoc培養(yǎng)液培養(yǎng)液 v50 g/ml ampviptg vsds-page loading buffer sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳：試劑聚丙烯酰胺凝膠電泳：試劑v30%丙烯酰胺凝膠貯液丙烯酰胺凝膠貯液： 丙烯酰胺30 g， n, n-亞甲雙丙烯酰胺 0.8 gv4triscl/sds ph 8.8：18.2 g tris堿溶解于40 ml水中，用1 mol/l的鹽酸調(diào)ph為8.8后，定容到100 ml，

5、再加0.4 g sds。v4triscl/sds ph 6.8：6.05 g tris堿溶解于40 ml水中，用1 mol/l的鹽酸調(diào)ph為6.8后，定容到100 ml，再加0.4 g sds。v樣品緩沖液：樣品緩沖液：1 ml 4triscl/sds(ph 6.8)，1 g sds，2 ml -巰基乙醇，巰基乙醇，1 ml 0.1%溴酚蘭，溴酚蘭，5 ml 甘油，加蒸餾水定容甘油，加蒸餾水定容到到50 ml。v電極緩沖液：電極緩沖液：0.6 g tris堿，堿，2.88 g甘氨酸甘氨酸，0.1 g sdsv固定液固定液：50%甲醇，甲醇，10%冰醋酸冰醋酸v染色液：染色液：0.05%(w/v

6、)考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)r-250，50%甲醇，甲醇，10%冰醋酸冰醋酸v脫色液：脫色液：7%冰醋酸，冰醋酸，5%甲醇甲醇 三、設(shè)備三、設(shè)備四、步驟四、步驟v1. e. coli bl21 (de3) 感受態(tài)的制備感受態(tài)的制備v2. 重組子轉(zhuǎn)化重組子轉(zhuǎn)化bl21v1）在預(yù)冷的）在預(yù)冷的ep管中加入管中加入1 l質(zhì)粒質(zhì)粒dna，加入，加入200 l bl21 (de3)感受態(tài)細(xì)胞，混勻后在冰浴感受態(tài)細(xì)胞，混勻后在冰浴上靜置上靜置30 min。v2） 42水浴熱沖擊水浴熱沖擊30 s，冰浴上放置，冰浴上放置10 min，加入加入0.8 ml soc培養(yǎng)液。置于培養(yǎng)液。置于37 振蕩培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)1 h

7、。v3） 取取0.1 ml涂布于加有抗生素的涂布于加有抗生素的lb培養(yǎng)基平板培養(yǎng)基平板（50 g/ml amp）上，）上，37 培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)過夜。 3.3.原核表達(dá)原核表達(dá)v1)挑取上述方法得到的單菌落于挑取上述方法得到的單菌落于2 ml lb液液體培養(yǎng)基體培養(yǎng)基(氨芐青霉素氨芐青霉素50 g/ml)中。同時(shí)，中。同時(shí)，bl21作為對(duì)照（不加抗生素）。于作為對(duì)照（不加抗生素）。于37培養(yǎng)培養(yǎng)至至od600為為 0.5. v2)取取20 l菌液接種菌液接種2 ml lb液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基(氨氨芐青霉素芐青霉素50 g/ml), 37培養(yǎng)培養(yǎng)od600為為 0.5，v3)加入加入iptg最終濃

8、度梯度最終濃度梯度2mm ，18誘導(dǎo)誘導(dǎo)表達(dá)表達(dá)16h。v4)誘導(dǎo)結(jié)束后，用超聲波破碎細(xì)胞。誘導(dǎo)結(jié)束后，用超聲波破碎細(xì)胞。v5）1ml菌液加入菌液加入100l的的sds-page loading buffer，100煮沸煮沸5min。v6）?。┤?0l上清樣品點(diǎn)樣，分析上清樣品點(diǎn)樣，分析sds-page膠，觀察表達(dá)結(jié)果。膠，觀察表達(dá)結(jié)果。4.sds-pagev1) 1) 按下表配方制備按下表配方制備sds-pagesds-page凝膠，凝膠，加樣。先加樣。先10 ma10 ma恒流電泳至分離膠，恒流電泳至分離膠，再調(diào)為再調(diào)為15 ma15 ma恒流到電泳結(jié)束。恒流到電泳結(jié)束。sds-pagesds-page膠配方膠配方組分組分 12%分離膠分離膠(ml) 3.9%濃縮膠濃縮膠(ml) 丙烯酰胺貯液丙烯酰胺貯液 60.654triscl/sds, ph 8.83.754triscl/sds, ph 6.8 1.25ddh2o5.253.0510%過硫酸銨過硫酸銨 0.050.025temed 0.010.005v2) 考馬斯亮藍(lán)染色考馬斯亮藍(lán)染色v（1）：將聚丙烯酰胺凝膠用固定液固定）：將聚丙烯酰胺凝膠用固定液固定2