生物工程畢業(yè)論文

1、武漢生物工程學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文學(xué)士學(xué)位論文煙色曲霉原生質(zhì)體制備與紫外誘變題 目 類 別 畢業(yè)論文 系 別 生物工程系 專 業(yè) 班 級(jí) 08014101 學(xué) 生 姓 名 張尚昆 指 導(dǎo) 老 師 周念波 輔 導(dǎo) 老 師 黃 英 起 止 時(shí) 間 2011年10月至2012年5月 論文提交時(shí)間 2012年5月 二零一二年五月論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。對(duì)本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)

2、位論文作者簽名： 年 月 日目錄摘 要關(guān)鍵詞abstractkey words前言11.1 材料41.1.1 樣品41.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑41.1.3 酶41.1.4 儀器與設(shè)備41.1.5 培養(yǎng)基41.2 實(shí)驗(yàn)方法51.2.1 篩選育種過程51.2.2 出發(fā)菌株煙色曲霉分解殼聚糖能力檢測(cè)51.2.3 酶液的配制51.2.4 孢子懸液的制備51.2.5 制備原生質(zhì)體51.2.6 原生質(zhì)體的紫外誘變及再生51.2.7 高產(chǎn)菌株的檢出52 結(jié)果和分析62.1 煙色曲霉原生質(zhì)體制備培養(yǎng)條件優(yōu)化62.1.1菌齡對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)率的影響62.1.2 酶液ph對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)率的影響62.1.3 酶作用溫度對(duì)原生質(zhì)

3、體產(chǎn)率的影響72.1.4 酶作用時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)率的影響82.2 原生質(zhì)體紫外照射劑量的確定92.3 紫外誘變結(jié)果93 結(jié)論10參考文獻(xiàn)11致 謝12煙色曲霉原生質(zhì)體制備與紫外誘變摘 要本實(shí)驗(yàn)以煙色曲霉（monacus fulginosus）為出發(fā)菌株,用混合酶制取原生質(zhì)體并對(duì)原生質(zhì)體形成條件進(jìn)行探討,并進(jìn)行紫外誘變選育。采用18 h菌齡的菌絲體,使用ph為5.0的蝸牛酶（5mg/ml）+纖維素酶（5 mg/ml）復(fù)合酶液，30 下酶解2.5 h,在該條件下原生質(zhì)體濃度可達(dá)6.5×106個(gè)/ml,再生率為6.3%。在最佳紫外線照射時(shí)間90 s下,突變株經(jīng)篩選,得到一株降解殼聚糖的酶活

4、顯著提高、遺傳性能穩(wěn)定的誘變株。其酶活比出發(fā)菌株提高了1.23倍。關(guān)鍵詞煙色曲霉；殼聚糖酶；原生質(zhì)體；紫外誘變protoplast preparation and breeding of higher esterifying enzyme activit mutants by protoplast mutagenesis of ultraviolet irradiation of monacus fulginosus abstract using monacus fulginosus as the original strain,studied on the preparation and r

5、egeneration conditions of protoplasts by mutagenesis of ultraviolet irradiation。the results showed that treated 18h culture of monascus ruber with 5mg/ml snail enzyme and 5mg/ml cellulose enzyme whose ph is 5.0, the enzymolysis time was 2.5 hours, the enzymolysis temperature was 30 , the protoplasts

6、 could reach 6.5×106 unit/ml, and the regeneration rate reached up to 6.3%。under uv irradiation time in the best case for the 90s, after initially sieving and duplicate sieves,the mutagenesis strain which own increasing enzyme activity and transmissibility was obtained。its esterifying enzyme co

7、ntent is 1.23 times higher than the original strain。key wordsmonacus fulginosus; chitosan enzymes; protoplast; ultraviolet mutagenesis11前言 原生質(zhì)體是指細(xì)胞壁被酶水解剝離后，剩下由原生質(zhì)膜包圍的原生質(zhì)部分原生質(zhì)體通常是由對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞制備而來的，代謝旺盛復(fù)制頻繁生活力強(qiáng)對(duì)誘變劑的敏感性也強(qiáng)，誘變后易于形成單菌落而便于篩選；同時(shí)，原生質(zhì)體還具有細(xì)胞壁再生能力，保持了細(xì)胞的全能性，可以按照常規(guī)的細(xì)胞誘變方式對(duì)其進(jìn)行誘變，從而提高突變株的變異幅度，誘變效果更為理

8、想1。1研究背景與意義自buchman和bonner在1959年首次報(bào)道利用酶解破壁方法從粗糙脈孢霉菌絲體釋放原生質(zhì)體以后，在其他各種真菌的原生質(zhì)體制備和再生的研究陸續(xù)開展，極大豐富了人們對(duì)真菌細(xì)胞外表和其生理功能的知識(shí)，尤其對(duì)于20世紀(jì)70年代中期興起的原生質(zhì)體融合遺傳育種手段在絲狀真菌的應(yīng)用起到了啟動(dòng)作用2。對(duì)于煙色曲霉的原生質(zhì)體制備、再生以及原生質(zhì)體誘變育種技術(shù)的研究也日益增多。但是自然篩選的煙色曲霉產(chǎn)酶水平一般較低，無商業(yè)開發(fā)價(jià)值，而誘變育種是一種簡便易行而且快速的選育方法。由于各種誘變劑對(duì)微生物的作用位點(diǎn)和方式不盡相同， 因此，反復(fù)使用同一誘變因子會(huì)出現(xiàn)鈍化現(xiàn)象可能引起微生物的回復(fù)突

9、變，這就要求在煙色曲霉進(jìn)行誘變育種時(shí)要盡量選用新的誘變因子，才會(huì)有較大可能性取得成功。原生質(zhì)體由于去除外壁障礙，對(duì)各種誘變劑敏感性較強(qiáng)，往往正突變率高，因而利用原生質(zhì)體直接誘變經(jīng)過多種誘變劑處理過的鈍化株，是較有意義的誘變方法。 基于上述原因，人們采取各種手段以獲得穩(wěn)定性產(chǎn)酶菌株。潘力等人2006年對(duì)醬油曲霉孢子原生質(zhì)體的制備條件進(jìn)行優(yōu)化，得到醬油曲霉bi孢子原生質(zhì)體的制備條件為：選取培養(yǎng)5 d、綠色孢子開始旺盛生長的新鮮斜面培養(yǎng)物制備孢子懸浮液，采用25 mmol/ l-巰基乙醇 + 5 mmol/l na2 edta 體系預(yù)處理20 min，酶解條件是1%溶菌酶 + 1%蝸牛酶 + 1%纖

10、維素酶，山梨醇滲透壓穩(wěn)定劑(0.6 mol/ l，ph 6.88)，酶解溫度33 ，酶解5 h，再生培養(yǎng)基為0.6 mol/l nacl 高滲透壓豆汁培養(yǎng)基，涂布法再生。選用致死率為99.95%以上的誘變劑量對(duì)制備的原生質(zhì)體進(jìn)行紫外誘變處理，最終從230余株突變株中篩選得到7株酶活有較大提高的菌株系列u，遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)證明它們均具有高水平且穩(wěn)定的中性蛋白酶酶活3。王燕2007年對(duì)雙親滅活米曲霉原生質(zhì)體融合中原生質(zhì)體制備的研究得出原生質(zhì)體制備最佳條件為：最佳破壁酶為纖維素酶、溶壁酶、蝸牛酶3種酶混合，混合濃度比為5:3:1；菌絲培養(yǎng)15 h，酶解時(shí)加入dtt 3 mmol/l；酶解2.5 h，0

11、.8 mol/l nacl作為滲穩(wěn)劑，制備所得原生質(zhì)體融合后融合率達(dá)到3.31%4。 李萍等于2000年對(duì)黑曲霉原生質(zhì)體進(jìn)行紫外、licl復(fù)合誘變，獲得了1株產(chǎn)-葡萄糖甘酶活較高的菌株，其酶活有出發(fā)菌株的10 u/ml提高到14.7 u/ml2。郭魯宏等2000年以黑曲霉（aspergillus niger）no.13為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線處理，獲得1株制備原生質(zhì)體的起始菌，該菌株單寧酶活性比no.13提高55%；并對(duì)制備原生質(zhì)體的條件進(jìn)行了研究，在優(yōu)化方案基礎(chǔ)上，紫外誘變?cè)|(zhì)體，誘變菌株經(jīng)篩選，得到1株產(chǎn)單寧酶活是出發(fā)菌株的2倍的菌株2。彭益強(qiáng)等2002年將2株黑曲霉菌株（i、ii）在誘導(dǎo)產(chǎn)

12、植酸酶的條件下分別制備成原生質(zhì)體，并考察其原生質(zhì)形成及再生，經(jīng)紫外誘變后，發(fā)現(xiàn)涂平板的黑曲霉（ii）原生質(zhì)體在再生過程中菌落形態(tài)發(fā)生明顯變化?？疾橥蛔兙N的植酸酶酶活，篩選到其中1個(gè)變異株比原始黑曲霉（ii）親本株的植酸酶酶活提高了2.2倍2。2曲霉原生質(zhì)體的性質(zhì)2.1 煙色曲霉原生質(zhì)體weibull13等于1953年首先提出原生質(zhì)體概念。用水解酶將細(xì)胞壁水解剝離，剩下由原生質(zhì)體膜包圍著的原生質(zhì)體部分稱為原生質(zhì)體（protoplast）。其形狀隨不同菌類而異。原生體基本保持原細(xì)胞結(jié)構(gòu)、活性和功能，只是因?yàn)槿サ袅思?xì)胞壁，對(duì)滲透壓和外界環(huán)境特別敏感。為制備原生質(zhì)體，必須有效地除去細(xì)胞外的細(xì)胞壁。去

13、壁的方法有機(jī)械法、非酶分離法和酶法。實(shí)際工作中絕大多數(shù)采用酶法，時(shí)間短，效果好2。2.2 原生質(zhì)體的生物學(xué)特性原生質(zhì)體與完整細(xì)胞相比，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能是相類似的；來自不同菌絲部位的原生質(zhì)體，生理生化特性不同，對(duì)誘變劑的敏感也不同，從菌絲頂端分離出的原生質(zhì)體代謝活動(dòng)要強(qiáng)；去壁后的原生質(zhì)體對(duì)外界條件敏感，并且外界大分子如外源dna等容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；原生質(zhì)體在一定條件下容易再生成細(xì)胞壁而復(fù)原為完整細(xì)胞形態(tài)；原生質(zhì)體由于剝?nèi)チ思?xì)胞壁，等于失去了屏障，外界的因素本身對(duì)它就有影響，再加上用誘變劑誘變，對(duì)原生質(zhì)體的變異作用更強(qiáng)?？梢蕴岣哒T變強(qiáng)度，增加誘變的力度，提高高頻誘變的機(jī)率，使菌株變異的幅度大大加強(qiáng)，有

14、可能從中篩選出變異特性更強(qiáng)、性狀改變更大的菌株2。2.3 曲霉原生質(zhì)體的釋放過程 曲霉原生質(zhì)體和其他許多常見絲狀真菌一樣，可以從菌絲頂端和其他部位釋放，同時(shí)出現(xiàn)菌絲膨大變形，這是由于細(xì)胞壁已被水解掉，細(xì)胞膜凸出將要成為原生質(zhì)體。原生質(zhì)體釋放時(shí)，通常是在菌絲體的釋放部位先膨大形成一個(gè)小球體，然后該球體逐漸增大，最后脫離菌絲，有的還可以在原有的釋放部位緊接著又形成一個(gè)或幾個(gè)原生質(zhì)體，這可能是由于菌絲體有關(guān)泡囊形成與細(xì)胞膜融合的機(jī)制所導(dǎo)致的。有報(bào)道認(rèn)為，在菌絲上緩慢膨大脫落的原生質(zhì)體較為穩(wěn)定，很快形成的原生質(zhì)體則很脆弱。釋放的原生質(zhì)體多呈球形，大小不一，直徑為1 m20 m，但以直徑為5 m10 m

15、 的中等大小的原生質(zhì)體最多，其原生質(zhì)體中一般含一個(gè)巨大的液泡，其余的內(nèi)含物呈月牙形，透明性較液泡差。郝勃等在相差顯微鏡下詳細(xì)地觀察了2 株黑曲霉在最適條件下形成原生質(zhì)體的過程。結(jié)果表明，曲霉的原生質(zhì)體均能從菌絲體的頂端及其他部位釋放出來，釋放的原生質(zhì)體呈球形，大小不一，大多數(shù)原生質(zhì)體內(nèi)均能清晰地看見含有一個(gè)巨大的液泡2。2.4 曲霉原生質(zhì)體的制備制備原生質(zhì)體是原生質(zhì)體技術(shù)的前提和基礎(chǔ)，但是不同微生物的細(xì)胞壁組成各不相同，所以制備其原生質(zhì)體的最佳條件也存在著很大差異。早期人們?cè)剿魇褂醚心サ葯C(jī)械方法和超聲波等物理方法來制備原生質(zhì)體，制備效果都不理想，目前人們主要運(yùn)用酶法來制備原生質(zhì)體。對(duì)于曲霉，

16、由于其細(xì)胞壁組成較為復(fù)雜，人們多傾向于使用復(fù)合酶進(jìn)行處理，常用的酶有纖維素酶、蝸牛酶和幾丁酶等。不同黑曲霉菌種在制備原生質(zhì)體時(shí)所需酶和種類不同，而且所需酶濃度、酶解液配比、菌絲的菌齡、酶處理的溫度和時(shí)間、培養(yǎng)方法及其他因素也存在著差異2。2.5 煙色曲霉酶解殼聚糖的催化特性大部分殼聚糖酶屬于內(nèi)切酶，降解殼聚糖生成殼二糖、殼三糖等寡聚體的混合物，殼聚糖酶在酶解過程中的活性是隨著一乙?；?、一取代基團(tuán)及其不同取代位置以及均相和非均相反應(yīng)體系而變化的。研究顯示，殼聚糖酶在降解殼聚糖時(shí)，需要有一定的乙酰基協(xié)助催化降解，在乙酰度不高的情況下，隨著殼聚糖的乙酰度降低，酶的活性增高，低聚殼聚糖的收率增大，而

17、且降解時(shí)間是控制產(chǎn)物聚合度的關(guān)鍵因素。一些研究表明，不同來源的殼聚糖酶由于其氨基酸排列順序及分子量不同，其催化作用模式也不同。yoon等5對(duì)bacillus sp.ck 4產(chǎn)的殼聚糖酶進(jìn)行了定點(diǎn)突變研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)asp-66改為asp或glu時(shí)酶活力顯著下降，推測(cè)asp-66是該酶催化活性中心所必需的氨基酸殘基。來源于不同微生物的殼聚糖酶對(duì)不同脫乙?；潭鹊臍ぞ厶呛蜌ぞ厶茄苌?乙二醇?xì)ぞ厶?、羧甲基纖維素和羥乙基殼聚糖)有不同的特異性，但是一般不能降解膠體幾丁質(zhì)和纖維素，這也是判斷殼聚糖酶和幾丁質(zhì)酶的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)。hutadilok等6研究發(fā)現(xiàn)bacillus pumilus產(chǎn)的殼聚糖酶在均相體

18、系反應(yīng)中，隨著n-乙?；潭鹊奶岣?，米氏常數(shù)( km)升高，最大反應(yīng)速率( vmax)降低。在非均相反應(yīng)中，具有一定取代度的n一乙?；瘹ぞ厶潜葰ぞ厶歉菀妆凰猓?dāng)脫乙?；刃∮?6 時(shí)，殼聚糖不溶于水，因而難以被水解。3原生質(zhì)體紫外誘變微生物在一定酶的作用下，脫去細(xì)胞壁，只有在高滲壓培養(yǎng)基中存活， 并在合適的培養(yǎng)基中恢復(fù)細(xì)胞壁而再生7。由于原生質(zhì)體失去細(xì)胞壁的屏障，故對(duì)環(huán)境、誘變劑等更為敏感，因此用原生質(zhì)體作為誘變材料，誘變效果較傳統(tǒng)方法理想。酶法制備原生質(zhì)體的方法：首先選擇原始親株，用培養(yǎng)皿玻璃紙法或搖瓶振蕩法培養(yǎng)，取年輕的菌體轉(zhuǎn)入高滲溶液中，加入有關(guān)水解酶，在一定條件下（溫度、ph值等

19、）酶解細(xì)胞壁。酶解后混合液用玻璃漏斗過濾，濾液進(jìn)一步離心洗滌棄上清液，沉淀懸浮同一種高滲液中，即可得純化原生質(zhì)體8。原生質(zhì)體失去了細(xì)胞壁的屏障，外界的因素本身對(duì)它就有影響，再加上用誘變劑誘變，對(duì)原生質(zhì)體的變異作用更強(qiáng)。可以提高誘變強(qiáng)度，增加誘變的力度，提高高頻誘變的機(jī)率， 使菌株變異的幅度大大加強(qiáng)，有可能從中篩選出變異特性更強(qiáng)，性狀改變更大的菌株。原生質(zhì)體誘變經(jīng)常會(huì)引起較多菌株形態(tài)變異，如孢子顏色、菌落形態(tài)不同等，因此，在進(jìn)行原生質(zhì)體誘變?cè)偕N時(shí)，結(jié)合分離形態(tài)突變株，可以在短期內(nèi)獲得超敏高產(chǎn)菌株。4本實(shí)驗(yàn)研究意義煙色曲霉是發(fā)酵工業(yè)和食品加工業(yè)的重要菌種9?，F(xiàn)代工業(yè)常利用煙色曲霉生產(chǎn)各種酶制劑

20、。殼聚糖酶屬于其中的一種，殼聚糖酶屬于o-糖苷水解酶，能專一性降解殼聚糖生成單糖和殼寡糖，殼寡糖具有較高的溶解性和生理活性，能提高機(jī)體的免疫和抗癌能力，改善腸道微生物的區(qū)系分布，刺激有益菌的生長，還可作為植物功能調(diào)節(jié)劑，刺激植物生長。但煙色曲霉的產(chǎn)殼聚糖酶的水平比較有限，而且目前有關(guān)于提高煙色曲霉篩選產(chǎn)殼聚糖酶的報(bào)道較少，有的幾篇也只局限于從天然源獲得的產(chǎn)酶菌株，因此有必要對(duì)煙色曲霉產(chǎn)霉菌進(jìn)行誘變選育，以提高產(chǎn)殼聚糖酶的水平和生產(chǎn)出更加優(yōu)質(zhì)的酶制劑。而且隨著原生質(zhì)體技術(shù)的出現(xiàn),原生質(zhì)體誘變被廣泛應(yīng)用于菌株的選育。原生質(zhì)體是脫除了細(xì)胞壁的細(xì)胞, 具有細(xì)胞全能性及很強(qiáng)的細(xì)胞壁再生能力,是很理想的誘

21、變材料。 本課題正是針對(duì)在分解殼聚糖酶源菌種的選育過程中通過常規(guī)的篩選獲得的菌株品質(zhì)往往不盡如人意,因此有必要在已獲得的優(yōu)良菌種基礎(chǔ)上,對(duì)其改良,以便獲得更加優(yōu)良菌種,提高殼聚糖的分解效率。1材料與方法 1.1 材料1.1.1 樣品煙色曲霉菌種一支，由武漢生物工程學(xué)院酶工程實(shí)驗(yàn)室提供。1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑(nh4)2so4（ar），天津市博迪化工有限公司；k2hpo4（ar），天津南開化工廠；nacl（ar），天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠kh2po4（ar），湘中地質(zhì)實(shí)驗(yàn)研究所；mgso47h2o（ar）、mnso47h2o（ar）、feso47h2o（ar），洛陽市化學(xué)試劑廠；瓊脂（br）、葡萄

22、糖（ar）、蛋白胨（br），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；殼聚糖，濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司；冰醋酸（ar），天津市博迪化工有限公司；nano3（ar）、kcl（ar），天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠。1.1.3 酶纖維素酶（ar），北京輝宏德業(yè)生物科技有限公司；蝸牛酶（ar），北京輝宏德業(yè)生物科技有限公司。1.1.4 儀器與設(shè)備電子天平（bs124s），北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；海爾電冰箱（bcd206t xz），青島海爾股份有限公司；冷凍超速離心機(jī)（gl16 g），上海安亭科學(xué)儀器廠；紫外分光光度計(jì)（sp2101uvpc），上海光譜儀器有限公司；電熱恒溫干燥箱（202ob），天津市泰斯特

23、儀器有限公司；霉菌培養(yǎng)箱（mjx250b），天津市泰斯特儀器有限公司；恒溫?fù)u床（hq 45z），武漢中科科技有限責(zé)任公司；恒溫水浴鍋（dk981），天津市泰斯特儀器有限公司；顯微鏡（ts-b），廣州啟躍光電儀器有限公司；血球計(jì)數(shù)板（tqak），上海泛柯生化試劑有限公司；凈化工作臺(tái)（jhtdsc），濟(jì)南康寶凈化設(shè)備有限責(zé)任公司；高壓滅菌鍋（yx 280b），上海三申醫(yī)療器械有限公司。1.1.5 培養(yǎng)基平板培養(yǎng)基6(%)：殼聚糖 1.0，(nh4)2so4 0.50，k2hpo4 0.20，nacl 0.50，mgso47h2o 0.10，瓊脂 2.0，ph7.0。斜面培養(yǎng)基：組分配方同平板培養(yǎng)基

24、。菌絲生長培養(yǎng)基7(%)：蛋白胨 0.30，葡萄糖 1.50，mgso47h2o 0.05，mnso47h2o 0.003，feso47h2o 0.003，ph5.5。再生培養(yǎng)基(%)10：葡萄糖4.0，nano3 0.30， mgso47h2o 0.05，feso47h2o 0.001， k2hpo4 0.01，自然ph。上培養(yǎng)基均用蒸餾水配制，0.1 mpa滅菌20 min。1.2 實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 篩選育種過程實(shí)驗(yàn)室提供菌種誘變前分解殼聚糖能力檢測(cè)孢子懸液的制備制備原生質(zhì)體原生質(zhì)體的紫外誘變及再生高產(chǎn)菌株的檢出1.2.2 出發(fā)菌株煙色曲霉分解殼聚糖能力檢測(cè)將煙色曲霉菌種活化，挑取單菌落

25、接于平板培養(yǎng)基，于30 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)23 d。肉眼觀察平板培養(yǎng)基上長出菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈，記錄產(chǎn)生透明圈和菌落形態(tài)特征，測(cè)量透明圈的直徑大小。挑取比值較大者進(jìn)行分離純化，于斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行純培養(yǎng)，以供單因子實(shí)驗(yàn)選用。1.2.3 酶液的配制 配制0.7 mol/l nacl溶液，稱取纖維素酶1000 mg、蝸牛酶400 mg，用200 ml nacl溶液溶解，充分振蕩30 min，冷凍離心(4000 r/min，4 )15 min，留上清液待用。1.2.4 孢子懸液的制備將培養(yǎng)活化菌株的新鮮斜面加入適量的無菌水，刮下菌株的孢子于三角燒瓶中，玻璃珠充分振蕩30 min，8層無菌紗布過濾菌絲體，

26、收集液體即為孢子懸液，用顯微鏡觀察血球計(jì)數(shù)板計(jì)算所得孢子懸液的單位個(gè)數(shù)。1.2.5 制備原生質(zhì)體 用無菌水將所得孢子懸液稀釋至 104-105個(gè)/ml，將純化的菌種斜面加入適量的無菌水，吸取1 ml孢子懸液接入盛有50 ml菌絲生長培養(yǎng)基的250 ml三角燒瓶中，置于30 ，150 r/min恒溫?fù)u床上搖瓶培養(yǎng)一定時(shí)間。搖瓶培養(yǎng)懸液在4000 r/min離心10 min，棄去上清液，再用0.7 mol/l nacl溶液反復(fù)離心2次洗滌菌絲球，每5 ml菌懸液加入2 ml纖維素酶、蝸牛酶混合，在一定溫度下恒溫水浴一定時(shí)間，間或震蕩，酶解停止后4000 r/min離心10 min除去未完全消化的菌

27、體碎片，用0.7 mol/l nacl溶液反復(fù)離心洗滌3次，收集原生質(zhì)體懸于nacl溶液中，制得原生質(zhì)體懸液用血球計(jì)數(shù)板數(shù)。1.2.6 原生質(zhì)體的紫外誘變及再生使用0.7 mol/l nacl溶液調(diào)整原生質(zhì)體的濃度為106 個(gè)/ml，吸取原生質(zhì)體懸液10 ml，置于直徑6 cm的無菌平皿中，在距離15 w的紫外燈30 cm處進(jìn)行照射，照射時(shí)間為90 s，紅光下吸取照射后的原生質(zhì)體懸液0.5 ml涂于再生培養(yǎng)基上，于30 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)23 d。1.2.7 高產(chǎn)菌株的檢出從再生培養(yǎng)基中挑取單菌落點(diǎn)接種到平板培養(yǎng)基中，由于平板培養(yǎng)基是以殼聚糖為唯一碳源，可通過記錄產(chǎn)生透明圈和菌落形態(tài)特征，測(cè)量透明圈

28、的直徑大小來判斷煙色曲霉產(chǎn)殼聚糖酶的能力11，并與出發(fā)菌種產(chǎn)酶能力進(jìn)行比較。根據(jù)此現(xiàn)象挑選高活力的菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。 2 結(jié)果和分析2.1 煙色曲霉原生質(zhì)體制備培養(yǎng)條件優(yōu)化2.1.1菌齡對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)率的影響 將活化后的出發(fā)菌體分別接入滅菌的菌絲培養(yǎng)基中，于30 、150 r/min條件下培養(yǎng)16 h、17 h、18 h、19 h、20 h，分別離心后收集菌絲球進(jìn)行酶解反應(yīng)，用顯微鏡血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1和圖1。微生物生理狀態(tài)是決定原生質(zhì)體產(chǎn)率的主要因素之一13，圖1表明，菌齡明顯地影響原生質(zhì)體的產(chǎn)率。隨著培養(yǎng)時(shí)間的不同，菌體原生質(zhì)體的產(chǎn)率也不同，處于對(duì)數(shù)生長期的菌體更容易酶解生成原生質(zhì)

29、體。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到18 h時(shí)，原生質(zhì)體的得率達(dá)到5.0×106個(gè)/ml，因此確定菌齡為18 h。表1菌齡對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)率的影響菌齡/h原生質(zhì)體數(shù)量（個(gè)/ml）162.2×106173.5×106185.0×106194.7×106204.0×106 圖1 菌齡對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)率的影響2.1.2 酶液ph對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)率的影響用ph分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的緩沖溶液配制纖維素酶、蝸牛酶混合酶液。將活化后的出發(fā)菌體分別接入滅菌的菌絲培養(yǎng)基中，于30 、150 r/min條件下培養(yǎng)18 h，離心后收集菌絲球再32 條件下用不同p

30、h的酶液進(jìn)行酶解反應(yīng)，酶解作用時(shí)間為3 h，酶解后用顯微鏡血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2和圖2。圖2表明，酶液的ph值也可以直接影響到原生質(zhì)體的制備，因?yàn)橹挥性谧钸mph值時(shí)，酶的活性才最高，酶促反應(yīng)速率才最大。根據(jù)酶液ph的不同，菌體原生質(zhì)體的產(chǎn)率也不同。當(dāng)酶液的ph為5.0時(shí)，煙色曲霉原生質(zhì)體的得率達(dá)6.1×106個(gè)/ml。因此ph確定5.0。表2酶液ph對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)率的影響酶作用ph原生質(zhì)體數(shù)量（個(gè)/ml）3.02.8×1064.03.2×1065.06.1×1066.04.4×1067.03.7×106 圖2 酶液ph對(duì)原生質(zhì)體

31、產(chǎn)率的影響2.1.3 酶作用溫度對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)率的影響 取培養(yǎng)18 h的菌絲體，在ph為5.0的纖維素酶、蝸牛酶混合酶液作用下，分別在26 、28、30 、32 、34 下各酶解3 h，用顯微鏡血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3和圖3。圖3可知，酶解溫度過高或過低對(duì)原生質(zhì)體的產(chǎn)率都有影響，30 為酶解的最適反應(yīng)溫度。表3 酶作用溫度對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)率的影響酶解溫度/原生質(zhì)體數(shù)量（個(gè)/ml）262.3×106283.1×106305.7×106324.6×106344.1×106 圖3 酶作用溫度對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)率的影響2.1.4 酶作用時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)率的影

32、響 將活化后的出發(fā)菌體分別接入滅菌的菌絲培養(yǎng)基中，于30 、150 r/min條件下培養(yǎng)18 h，在ph為5.0的纖維素酶、蝸牛酶混合酶液作用下，30 下各酶解1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h，用顯微鏡血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4和圖4。圖4表明，酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體的產(chǎn)率影響明顯。在酶解時(shí)間小于2.0 h時(shí)，菌絲體未完全酶解，原生質(zhì)體的產(chǎn)率隨時(shí)間延長而增加。當(dāng)大于2.5 h時(shí)，菌絲體酶解完全，形成的原生質(zhì)體因酶解時(shí)間過長發(fā)生破裂，導(dǎo)致數(shù)量開始減少。故選2.5 h作為酶解的最適時(shí)間。表4 酶作用時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)率的影響酶解時(shí)間/h原生質(zhì)體數(shù)量（個(gè)/ml）1.51.2×

33、;1062.04.6×1062.55.5×1063.04.6×1063.54.3×106 圖4 酶作用時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)率的影響2.2 原生質(zhì)體紫外照射劑量的確定為了能夠確定合適的原生質(zhì)體紫外誘變照射時(shí)間，對(duì)紫外線照射時(shí)間與致死率的關(guān)系做了實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果如圖5所示。圖5可知，原生質(zhì)體的致死率和紫外線的照射時(shí)間成正比關(guān)系，即照射時(shí)間越長致死率越高。根據(jù)育種工作者長期的研究和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，一般認(rèn)為致死率以90%99%效果較好。有報(bào)道認(rèn)為致死率高，在單位存活細(xì)胞中負(fù)突變多，但在不多的正突變株中可能篩選到產(chǎn)量提高幅度大的突變株。故選用致死率為92% 的照射時(shí)間90 s1

34、2作為照射劑量對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行誘變。 圖5 紫外線照射時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體的致死率2.3 紫外誘變結(jié)果將誘變菌株再生后平板培養(yǎng)基上透明圈的直徑大小進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。并且將誘變前后透明圈的直徑大小關(guān)系做了比較，其結(jié)果如表5所示。表5 誘變時(shí)間與誘變前后透明圈直徑的關(guān)系平板編號(hào)出發(fā)菌種透明圈直徑/cm誘變后透明圈直徑/cm透明圈增長幅度12.152.110.9822.152.231.0432.152.411.1242.152.651.2352.152.561.1962.152.030.9472.152.331.0882.152.451.14表5可以看出，雖然誘變前后透明圈直徑的變化并非嚴(yán)格線性相關(guān)，但趨勢(shì)不變，誘

35、變后絕大部分透明圈直徑大于誘變前，即原生質(zhì)體的紫外誘變提高了煙色曲霉分解殼聚糖的能力。3 結(jié)論本試驗(yàn)中，煙色曲霉的原生質(zhì)體制備的最佳條件是：采用在液體培養(yǎng)條件下培養(yǎng)18 h的菌絲，用ph為5.0的混合酶液蝸牛酶、纖維素酶14同時(shí)處理菌絲，在30 酶解2.5 h，用 0.7 mol/l的氯化鈉為滲穩(wěn)劑，此時(shí)原生質(zhì)體形成數(shù)可達(dá)到6.5×106個(gè)/ml。經(jīng)過90 s紫外誘變后，涂布再生后分解殼聚糖的能力增加，比出發(fā)菌株提高了1.23倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,通過對(duì)煙色曲霉原生質(zhì)體直接進(jìn)行紫外誘變育種,對(duì)改良菌種特性具有良好的效果。參考文獻(xiàn)1 錢志偉，楊丹丹，方尚玲，李小強(qiáng), 陳茂彬.酯化紅曲霉原生質(zhì)體制備及紫外線誘變育種j.釀酒，2009，36（6）4750.2 李秀珍，楊平平，王燕.黑曲霉原生質(zhì)體誘變育種技術(shù)研究進(jìn)展j.中國釀造,2007 , 12：15.3潘力，李立風(fēng)，彭昶，葉燕銳，