微透析技術(shù)與方法-研究生

1、微透析技術(shù)與方法洪洪 宗宗 元元皖南醫(yī)學(xué)院定量藥理研究所微透析技術(shù)是一種微量化學(xué)采樣與檢測(cè)技術(shù)微透析技術(shù)微透析技術(shù)l 微透析系統(tǒng)組成l 微透析技術(shù)原理l 微透析技術(shù)特點(diǎn)l 透析相關(guān)儀器及透析液l 微透析實(shí)驗(yàn)操作l 微透析實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)一、微透析系統(tǒng)組成一、微透析系統(tǒng)組成 Perfusion medium: aCSF Flow rate: 2 l/minDialysis probeArea of diffusionFreely moving rats二、微透析技術(shù)原理二、微透析技術(shù)原理 微透析探頭是由具有一定截留分子量的纖維半透膜制成(microdialysis probe，MDP)； 將探頭埋

2、入待測(cè)的組織區(qū)域，以恒定速度向探頭內(nèi)灌注與組織液成分相近的等滲灌流液； 當(dāng)灌流液流經(jīng)探頭前端透析膜時(shí)，組織內(nèi)小分子量生物活性物質(zhì)即順濃度梯度從膜外擴(kuò)散入膜內(nèi)，并隨灌流液被引流至探頭外； 按一定的時(shí)間間隔連續(xù)收集透析液，檢測(cè)其中待測(cè)生物活性物質(zhì)水平，可監(jiān)測(cè)該區(qū)域內(nèi)細(xì)胞外生物活性物質(zhì)濃度的經(jīng)時(shí)變化過(guò)程微透析技術(shù)原理微透析技術(shù)原理優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)組織損傷小、取樣少、方便、快捷、可連續(xù)監(jiān)測(cè)且易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。微透析系統(tǒng)示意圖微透析系統(tǒng)示意圖-Anesthesized ratsAnesthesized rats微透析系統(tǒng)示意圖微透析系統(tǒng)示意圖- Freely moving rats Perfusion med

3、ium: aCSF Flow rate: 2 l/minDialysis probeArea of diffusionFreely moving ratsMDP：常用管式半透膜與不銹鋼、石英或塑料毛細(xì)管構(gòu)成，半透膜由再生纖維素、聚碳酸脂或聚丙烯腈制成。截留分子量 5,000-100,000 dolton不等。適合神經(jīng)遞質(zhì)等小分子物質(zhì)通透，而蛋白質(zhì)難以通透 ；三、微透析技術(shù)特點(diǎn)三、微透析技術(shù)特點(diǎn)灌流液：腦微透析的灌流液一般采用人工腦脊液 (artificial cerebral spinal fluid, aCSF)、Ringer或 Krebs 溶液；檢測(cè)方法：微透析技術(shù)特點(diǎn)(續(xù)）-單胺類物質(zhì)測(cè)

4、定主要采用高效液相色譜 (HPLC-ECD 法；-氨基酸類物質(zhì)多用 HPLC-熒光法測(cè)定；-乙酰膽堿、乳酸、抗壞血酸、丙酮酸和嘌呤類等物質(zhì)多采用 HPLC-紫外檢測(cè)法；-神經(jīng)肽類物質(zhì)主要用放射免疫法測(cè)定。（一）微透析探針（一）微透析探針組成成分：小口徑的透析膜、硅管、防水萬(wàn)用膠、硅膠毛細(xì)管 1.橡膠管；2.硅膠管（silica tubing）粗管；3.硅膠管（silica tubing）細(xì)管；4.聚乙烯管(PE-10 (polyethylene tubing)；5.透析膜（Dialysis membrane）；6.環(huán)氧乙烷（epoxy adhesive）；7.注射針頭。四、透析相關(guān)儀器及透析液

5、四、透析相關(guān)儀器及透析液 （二）透析泵（二）透析泵 1.流速穩(wěn)定且緩慢，介于 1-5l/min 2.快速的前進(jìn)/后退模式，連續(xù)而可調(diào)整的流速，和微調(diào)控制選擇（microprocessor control option） 3.液體轉(zhuǎn)動(dòng)軸（liquid swivel）:動(dòng)物可自由行動(dòng)，不會(huì)被透析管纏住 4.常用透析泵 CMA/100, Harvard Microliter , Sage Model 341A （三）透析液轉(zhuǎn)換器（三）透析液轉(zhuǎn)換器Carnegie Medicine 公司發(fā)展了一個(gè)全自動(dòng)的透析液轉(zhuǎn)換器 CMA/110 及 CMA/111。因這個(gè)機(jī)器有微調(diào)的功能，馬達(dá)驅(qū)動(dòng)的設(shè)備，來(lái)轉(zhuǎn)換透

6、析液，在轉(zhuǎn)換過(guò)程中不會(huì)讓空氣進(jìn)入。 （四）（四）透析液收集透析液收集1.手動(dòng)收集透析液 雖然耗時(shí)間，但可使一臺(tái) HPLC 發(fā)揮最大功用。例如收集時(shí)間要 20 分鐘，測(cè)定一個(gè)樣品只要 7-8 分鐘，則一臺(tái) HPLC 力足以應(yīng)付 3 種樣品；使樣品分離和分析很明確2.自動(dòng)收集器 (CMA/140) 按一定間間隔將透析液收集在冷藏（refrigerated）設(shè)備的旋轉(zhuǎn)盤上的玻璃小瓶?jī)?nèi),這就不需在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中一直看守著儀器。但就無(wú)法一邊收一邊分析透析液3.在線收集與檢測(cè) (Online)將探針出口直接連到 HPLC 的承載閥（load-valve）上，而直接在線上自動(dòng)分析透析液。即把一臺(tái) HPLC 限制

7、在單一動(dòng)物身上，使透析實(shí)驗(yàn)全自動(dòng)化（五）灌流液（五）灌流液 (perfusate) 1. Ringers solution： 140 mM NaCl 3.0 mM KCl 1.2-3.4 mM CaCl2 1.0 mM MgCl2 1.2 mM Na2HPO4 0.27 mM NaH2PO4 7.2 mM glucose pH 7.42. 人工腦積液 (artificial cerebrospinal liquid, aCSF) 147 mM Na+ 4.0 mM K+ 2.0 mM Ca2+ 大多數(shù)微透析使用的透析液，都含有1-3.4 mM 濃度的鈣離子。 動(dòng)物組織不同區(qū)域，鈣離子濃度從1-

8、3 mM 不等。透析液中含有3.4 mM 和含有1.2 mM 鈣離子時(shí)，對(duì) 藥 物 引 起 的 D A 變 化 ， 會(huì) 有 定 量 的（quantitative）不同。 目前我們雖知透析液中鈣離子的含量，對(duì)單胺的釋出有影響，但影響的程度則未知。組織間的不同差異，鈣離子可能是一個(gè)影響因素。 （六）透析液中鈣離子的濃度（六）透析液中鈣離子的濃度五、微透析實(shí)驗(yàn)操作五、微透析實(shí)驗(yàn)操作（一）透析探針的植入（一）透析探針的植入 1.必須的儀器：外科器械、鉆孔機(jī)、立體定位儀 2.定位軟件、圖譜：Paxinos, G., and W. C. (1997) The Rat Brain in Stereotaxi

9、c Coordinates (The Third Edition): San Diego, Academic Press.Paxinos, G., and F. K. B. J. (2001) The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates (The Second Edition): San Diego, Academic Press. （二）微透析探針植入前的準(zhǔn)備（二）微透析探針植入前的準(zhǔn)備1.手術(shù)前，將透析探針（儲(chǔ)存在干的狀態(tài)下）連上透析系統(tǒng)，并安置在立體定位儀的把手。2.將把手夾在一個(gè)小蒸餾架上，將探針浸到含有透析液的燒杯中，使透析膜完全浸濕和微微張

10、開(kāi)。一旦透析膜弄濕后，就不可將透析膜移出溶液，因?yàn)橥肝瞿じ傻艉?，?huì)影響單胺的回收率。3.檢查透析膜，確定它是流通而不滲漏的；并排空系統(tǒng)內(nèi)氣體。 （三）麻醉（三）麻醉1.非復(fù)原性（急性實(shí)驗(yàn) acute preparation）實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中，用加溫毯或臺(tái)燈將動(dòng)物體溫維持在 37 C。手術(shù)（30min），然后等 2 小時(shí)作基礎(chǔ)值測(cè)定期（baseline period）,看(單胺釋出量)有否趨于穩(wěn)定，然后藥物注射之后，繼續(xù)測(cè)定 2 小時(shí)左右的給藥測(cè)定期（post-drug）。用 chloral hydrate 或 urethane麻醉，麻醉時(shí)間較長(zhǎng)用 pentobarbital 或 halothane

11、(0.15% halothane/air mixture, air mixture: 95% O2 + 5% CO2)麻醉Halothane麻醉恢復(fù)快又比較不會(huì)發(fā)生意外,但要求小動(dòng)物麻醉機(jī) 2.自由活動(dòng)實(shí)驗(yàn)（慢性實(shí)驗(yàn) chronic preparation）需要液體轉(zhuǎn)動(dòng)軸，動(dòng)物在自由運(yùn)動(dòng)的情形下，不受限制地收集透析液需要適當(dāng)?shù)膭?dòng)物活動(dòng)室(動(dòng)物行為合乎生理狀況,如隔音、保溫、保濕、光控等)六、微透析實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)六、微透析實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng) （一）組織損害（一）組織損害 腦組織急性植入小導(dǎo)管或探針，導(dǎo)致立即地，但數(shù)分鐘到數(shù)小時(shí)內(nèi)可恢復(fù)的變化，如在探針鄰近區(qū)域， 組織被壓凹， 血腦障壁被破壞， 葡萄糖代謝受影響， 神經(jīng)元損害損害微透析探針植入幾天，透析膜附近的組織，立即發(fā)生神經(jīng)膠質(zhì)（gliotic）反應(yīng)，結(jié)果造成炎癥細(xì)胞和結(jié)締組織覆蓋在半透膜上，形成障壁（barrier）阻礙透析進(jìn)行。例如：（二）慢性實(shí)驗(yàn)過(guò)程（二）慢性實(shí)驗(yàn)過(guò)程探針植入后幾天，基本的單胺釋出和藥物引起的單胺釋出都會(huì)下降 無(wú)論是術(shù)后 4 天紋狀體的 DA,還是術(shù)后 7 天海馬回的 5-HT，其