三黃片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草說(shuō)明

1、 三黃片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草說(shuō)明 組別： 組員：三黃片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草說(shuō)明【名稱】三黃片【處方】大黃 300g 鹽酸小檗堿 5g 黃芩浸膏 21g【制法】見正文，按制成1000粒?！拘誀睢勘酒窞樘前禄虮∧ぐ?，除去包衣后顯棕色；味微苦、澀【鑒別】（1）鹽酸小檗堿的TLC鑒別 鹽酸小檗堿為該藥的主要成分，參照2010版中國(guó)藥典黃柏的TLC鑒別方法，以鹽酸小檗堿為對(duì)照品（購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所），用薄層微量進(jìn)樣器分別吸取鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品配制成的對(duì)照品溶液和供試品溶液各2ul, 用薄層電動(dòng)點(diǎn)樣器分別點(diǎn)同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上, 以乙酸乙酯- 丁酮- 甲酸- 水( 10：7：1 ：1)

2、為展開劑, 展開, 取出, 晾干, 置紫外光燈( 365 nm) 下檢視。此外，令使用苯- 醋酸乙酯- 甲醇- 異丙醇- 濃氨試液(12 6 3 3 1) 為展開劑進(jìn)行驗(yàn)證，置用氨氣預(yù)飽和15min 的展開缸內(nèi)。展開，取出，晾干，紫外光燈(365nm) 下檢視，供試品色譜在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同的一個(gè)黃色熒光斑點(diǎn)。陰性對(duì)照色譜在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上無(wú)斑點(diǎn)。（2）大黃的TLC鑒別：大黃為本方的君藥，所含的大黃酸、大黃素、大黃酚是主要有效成分，參照2010版中國(guó)藥典大黃的TLC鑒別方法，以大黃素對(duì)照品、大黃酸對(duì)照品、大黃酚對(duì)照品及大黃對(duì)照藥材（購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所） 吸取上述供

3、試品溶液、陰性對(duì)照溶液及對(duì)照藥材溶液各10L ,對(duì)照品溶液5L ,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以石油醚(3060 ) - 甲酸乙酯- 甲酸(1551) 的上層溶液為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外光燈(365nm) 下檢視。此外以石油醚(3060 ) - 甲酸乙酯- 乙酸(1541.5) 的上層溶液為展開劑進(jìn)行驗(yàn)證，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm) 下檢視。供試品色譜中在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同5 個(gè)橙黃色熒光斑點(diǎn),在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同橙黃色斑點(diǎn),置氨氣中熏后,日光下檢視,斑點(diǎn)為紅色。陰性對(duì)照色譜在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上無(wú)斑點(diǎn)。 （3）黃芩的TLC鑒別：黃芩為

4、本方的臣藥，其含有的黃芩苷，漢黃芩素，黃芩素為主要成分，參照2010版中國(guó)藥典黃芩的TLC鑒別方法，以黃芩苷對(duì)照品、黃芩素對(duì)照品、漢黃芩素對(duì)照品及黃芩對(duì)照藥材（購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所） 吸取上述溶液各5L ,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以乙酸乙酯- 丁酮- 甲酸- 水(5 3 11) 為展開劑,展開,取出,晾干,噴以5 %三氯化鐵乙醇液。另以醋酸乙酯一丁酮一甲酸一水(5：3：1：1)為展開劑驗(yàn)證，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，展開，取出，晾干，噴以5三氯化鐵乙醇液。結(jié)果供試品色譜在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點(diǎn)。結(jié)果供試品色譜在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色斑點(diǎn)。陰性對(duì)照色譜

5、在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上無(wú)斑點(diǎn)?！緳z查】重量差異： 取供試品20片，除去糖衣，得到的片芯應(yīng)檢查重量差異并符合規(guī)定，精密稱定總重量，求得平均片重后，再分別精密稱定每片的重量，每片重量與標(biāo)示片重相比較（無(wú)標(biāo)示片重的片劑，與平均片重比較），按表中的規(guī)定，超出重量差異限度的不得多于2片，并不得有1片超出限度1倍。標(biāo)示片重或平均片重重量差異限度0.3g以下0.3g及0.3g以上±7.5%±5%崩解時(shí)限：照2010版中國(guó)藥典附錄I D片劑制劑通則檢查項(xiàng)下崩解時(shí)限檢查法采用升降式崩解儀檢查。崩解時(shí)限的考察批號(hào) 水分 崩解時(shí)限水甲醇乙醇【含量測(cè)定】黃芩苷、大黃素、大黃酚以及鹽酸小檗堿是本

6、方的主要成分，按照2010版中國(guó)藥典黃芩、大黃、黃柏藥材的定量檢查。鹽酸小檗堿的定量檢查：1 儀器與試藥DIONEX高效液相色譜儀，包括Ultimate 3000四元低壓梯度泵，UltiMate 3000二極管陣列檢測(cè)器，Chromeleon色譜工作站；日本島津AEU-210電子天平；HS-2060型超聲波清洗器（天津恒奧科技有限公司）；鹽酸小檗堿對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110713-200208）；三黃片；甲醇為色譜純；水為已濾純化水；其它試劑均為分析純。2 方法與結(jié)果2.1 色譜條件色譜柱：DIONEX-C18（250 nm×4.6 nm，5 m）；流動(dòng)相：乙腈-0

7、.05 mol/L磷酸二氫鉀水溶液（5248, 每100 mL含0.1 g十二烷基磺酸鈉）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：354 nm；進(jìn)樣量：20 L；柱溫：30。在此色譜條件下，樣品中鹽酸小檗堿色譜峰與其他組分色譜峰可達(dá)基線分離，且與其他相鄰色譜峰分離度>1.5；理論板數(shù)按鹽酸小檗堿色譜峰計(jì)算>2000。2.2 供試品溶液的制備2.2.11提取方法考察：供試品溶液制備精密量取三黃片1g，置25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，超聲處理10 min，靜置1 h，上清液用0.45 m微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。提取方法 面積1 面積2 面積3 鹽酸小檗堿的含量（mg/

8、g）超聲索氏2.2.1.2提取時(shí)間考察提取時(shí)間（h） 面積1 面積2 面積3 鹽酸小檗堿的含量（mg/g）0.511.52.2.1.3提取溶劑考察提取溶劑 面積1 面積2 面積3 鹽酸小檗堿的含量（mg/g）水甲醇乙醇2.2.2 陰性對(duì)照溶液的制備按照三黃片處方，依制備工藝制備成缺鹽酸小檗堿的陰性對(duì)照品，按供“2.2.1”法制成陰性對(duì)照溶液。2.2.3 對(duì)照品溶液的制備精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品6.2 mg，置25 mL棕色量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得248 g·mL-1鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液。2.3 系統(tǒng)試應(yīng)性試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品、供試品及陰性對(duì)照2.4 線性關(guān)系考察精密

9、吸取鹽酸小檗堿對(duì)照品儲(chǔ)備液0.25，0.5，1.0，2.0，3.0，6.0 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別取上述不同濃度的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液20 L，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以鹽酸小檗堿濃度為橫坐標(biāo)，鹽酸小檗堿色譜峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算得線性回歸方程為：Y=9.8516C+1.5232，r=0.9995；鹽酸小檗堿線性范圍為：6.2-148.8 g/mL。2.3.1提取溶劑考察進(jìn)樣量（ug） 2 4 6 8 10 峰面積甲醇乙醇2.5 精密度試驗(yàn)取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次20 L，測(cè)定峰面積，結(jié)果鹽酸小檗堿峰面積的RSD%為0.46%，表明儀器精密度

10、良好。2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液于室溫放置，分別在0、1、2、4、8、12 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果鹽酸小檗堿峰面積的RSD%為1.68%。表明處理后的供試品溶液在12 h內(nèi)保持穩(wěn)定。2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)取同一批號(hào)三黃片樣品6份，按“2.2.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液，各吸取20 L，按“2.1項(xiàng)”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得樣品中鹽酸小檗堿含量為0.13 mg/mL，RSD%為1.02%。2.8 加樣回收率試驗(yàn)精密量取同一批號(hào)已知含量的三黃片樣品6份（鹽酸小檗堿含量為0.1326 mg/mL）,每份2.5 mL，精密加入鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，按“2.2.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液，依“2.1項(xiàng)”色譜條件

11、進(jìn)樣20 L測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算鹽酸小檗堿含量與回收率。（見表1）表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）供試品 加入量 測(cè)得量 回收率 平均回收率 RSD(mg) (mg) (mg) (%) (%) (%)2.9 樣品含量測(cè)定分別精密量取3批三黃片1g，按“2.2.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液，注入高效液相色譜儀，按“2.1項(xiàng)”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定峰面積，由外標(biāo)法計(jì)算鹽酸小檗堿含量。（見表2）表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）制劑批號(hào) 鹽酸小檗堿含量RSD(mg/mL) (%)大黃素和大黃酚含量測(cè)定1.材料和儀器 1.1 儀器：高效液相色譜儀；TG-332 精密分析天平（上海天平儀器廠）；超聲波清洗器 1

12、.2 試劑：流動(dòng)相所用甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。1.3 試藥：大黃素、大黃酚對(duì)照品 三黃片（三組 標(biāo)記 第一組 第二組 第三組）2. 實(shí)驗(yàn)方法2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性：色譜柱：Dikma Diamondsil C18（250mm×4.6 mm，5m）；流動(dòng)相：甲醇-0.2%磷酸（85:15）；流速：1ml/min；進(jìn)樣量：10l；檢測(cè)波長(zhǎng): 254nm；柱溫：35。理論塔板數(shù) 按大黃素峰計(jì)算不低于2 000。2.2 溶液的制備2.2.1 對(duì)照品溶液的制備：精密稱取大黃素與大黃酚對(duì)照品適量，于50ml 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，配成含大黃素101.26g/ml、大黃酚10

13、9.24g/ml 的對(duì)照品貯備溶液，再精密量取5ml 置10ml 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成含大黃素50.63g/ml、大黃酚54.62g/ml 的對(duì)照品溶液。2.2.2 供試品溶液的制備：取本品20 片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)（過(guò)3 號(hào)篩），精密稱取適量（約相當(dāng)于1 片的重量），置于具塞錐形瓶中，精密加甲醇25mL，密塞，稱定重量，置超聲清洗器中超聲20min（超聲功率為400W，超聲頻率為40kHz），放冷，用甲醇補(bǔ)足，減失的重量，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液10 mL，置于燒瓶中，水浴蒸干，加30%乙醇- 鹽酸（101）溶液15 mL，置于水浴中加熱水解1h，立即冷卻,用三氯甲烷強(qiáng)力

14、振搖提取4d，每次15 mL，合并三氯甲烷液，置于水浴上蒸干，殘?jiān)脽o(wú)水乙醇- 乙酸乙酯（21）混合溶液溶解，移至25 mL 容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。2.2.2.1 提取方法的考察：采用本法，三黃片要研磨成細(xì)粉，加甲醇在超聲波儀上超聲振蕩20min 制備成供試品溶液，如超聲少于20min，則溶解不充分，影響測(cè)定準(zhǔn)確性，如多于20min，于測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著差異，一般選擇20min 超聲振蕩即可。回流法是常用的提取方法，但大量有機(jī)溶劑的使用會(huì)導(dǎo)致環(huán)境污染，成本增加，有機(jī)溶劑殘留等問(wèn)題；相比較而言，超聲法提取大黃素和大黃酚的含量與傳統(tǒng)回流提取法提取后的含量相當(dāng)，且較回

15、流法大大縮短了時(shí)間，可操作性強(qiáng)。提取方法 面積1 面積2 面積3 大黃素的含量（mg/g） 大黃酚的含量（mg/g）超聲索氏2.2.1.2提取時(shí)間考察提取時(shí)間（h） 面積1 面積2 面積3 大黃素的含量（mg/g） 大黃酚的含量（mg/g）0.511.522.2.1.3提取溶劑考察提取溶劑 面積1 面積2 面積3 大黃素的含量（mg/g） 大黃酚的含量（mg/g）水甲醇乙醇2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備：按處方比例稱取缺大黃的其它藥材，按中國(guó)藥典一部三黃片“制法”項(xiàng)下方法制成缺大黃的陰性樣品，按供試品溶液制備項(xiàng)下方法同法處理，即得陰性對(duì)照溶液。在上述色譜條件下，精密吸取對(duì)照品、供試品和陰性對(duì)照

16、溶液各10l 進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果陰性樣品對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。2.3 線性關(guān)系考察：分別精密量取含大黃素（101.26g/ml）、大黃酚（109.24g/ml）的對(duì)照品溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml 置5ml 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成含大黃素20.25g/ml、40.50g/ml、60.76g/ml、81.01g/ml、101.26g/ml，含大黃酚21.85g/ml、43.70g/ml、65.54g/ml、87.39g/ml、109.24g/ml 的對(duì)照品溶液。精密吸取上述對(duì)照品溶液各10l，注入高效液相色譜儀,記錄色譜圖,并以峰面積Y 為縱坐標(biāo),大黃素、大黃酚的濃度X(g/ml

17、)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。進(jìn)樣量（ug） 2 4 6 8 10 12峰面積2.4 精密度試驗(yàn)：精密吸取2.2.1 項(xiàng)下對(duì)照品溶液10l，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄大黃素、大黃酚的峰面積。2.5 重復(fù)性試驗(yàn)：稱取三黃片（第一號(hào)）樣品5 份，按供試品溶液制備項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定大黃素、大黃酚含量。2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液（第一號(hào)），分別在制備后0、2、4、8、12h 進(jìn)樣10l，記錄峰面積，計(jì)算結(jié)果。2.7 加樣回收率試驗(yàn)：精密稱取已知含量（第一號(hào)）的樣品細(xì)粉6 份，每份約1.5g，置圓底燒瓶中，并精密加入濃度為0.6457mg/ml的大黃素對(duì)照品溶液2ml

18、和濃度為0.9647mg/ml 的大黃酚對(duì)照品溶液3ml，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試液，測(cè)定峰面積。 表一大黃素加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 編號(hào) 稱樣量 （g） 樣品中大黃素含量（mg）對(duì)照品加入量（mg）測(cè)得量（mg）回收率（%）平均回收率（%）RSD（%） 1 2 3表二 大黃酚加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 編號(hào) 稱樣量 （g） 樣品中大黃酚含量（mg）對(duì)照品加入量（mg）測(cè)得量（mg）回收率（%）平均回收率（%）RSD（%） 1 2 32.8 樣品含量測(cè)定：取3 批（第一號(hào) 第二號(hào) 第三號(hào)）樣品，每批3 份，均按2.2.2 項(xiàng)下同法操作，制備供試品溶液，測(cè)定其中大黃素、大黃酚的含量。表三樣品含量測(cè)定結(jié)

19、果 組號(hào) 大黃素含量（mg/片） RSD（%） 大黃酚含量（mg/片） RSD（%） 第一組 第二組 第三組黃芩苷的定量檢查1 儀器與試藥11儀器HP1100型系列高效液相色譜儀 (美國(guó)) ; AE -240電子分析天平 (瑞士 Mettler); KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。12試藥黃芩苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所, 批號(hào)0826-9502); 三黃片(南寧市冠峰制藥有限公司, 批號(hào) 20090601 , 20090902 , 20090906 , 規(guī)格為每片片芯重 0.25g) ; 甲醇為色譜純 (德國(guó)M erck), 水為超純水(韓國(guó) Po w er Ip

20、lus超純水系統(tǒng)) , 其他試劑均為分析純。2 方法與結(jié)果21色譜條件色譜柱: Hypersi l ODS2 ( 4.6mm # 200mm,5um ); 流動(dòng)相: 甲醇 0.2 % 磷酸溶液 ( 45:55 );檢測(cè)波長(zhǎng): 280nm; 流速: 1.0 mL/min; 柱溫: 30 。進(jìn)樣量: 10uL。理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低2500。在此條件下, 黃芩苷與相鄰峰可達(dá)基線分離, 方中其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾, 2.2溶液的制備2.2.1對(duì)照品溶液的制備精密稱取在 60 減壓干燥 4h的黃芩苷對(duì)照品約 20mg , 置于 50mL量瓶中, 用甲醇溶解并稀釋至刻度。再精密吸取 0.5 , 1.

21、0, 2.0 , 4.0 , 6.0mL ,置 20mL量瓶中, 配成各個(gè)濃度的黃芩苷對(duì)照品溶液。2.2.2供試品溶液的制備取本品 20片, 除去包衣, 精密稱定, 研細(xì) (過(guò)三號(hào)篩) , 精密稱取約 0.05g , 置具塞三角瓶中, 精密加入 70 %乙醇 50mL , 密塞, 稱定重量, 超聲提取 30min , 放冷, 補(bǔ)足重量, 過(guò)濾, 取濾液適量即得。提取方法 面積1 面積2 面積3 黃芩苷的含量（mg/g） 超聲索氏2.2.1.2提取時(shí)間考察提取時(shí)間（h） 面積1 面積2 面積3 黃芩苷的含量（mg/g） 0.511.522.2.1.3提取溶劑考察提取溶劑 面積1 面積2 面積3

22、黃芩苷的含量（mg/g）水甲醇乙醇2.2.3陰性樣品的制備按處方比例制備缺黃芩的三黃片, 照 2.2.2項(xiàng)下操作, 制備陰性樣品溶液。2.3線性關(guān)系考察分別精密量取各個(gè)黃芩苷對(duì)照品溶液 10uL , 依次進(jìn)樣, 測(cè)定峰面積。以測(cè)得的峰面積為縱坐標(biāo),對(duì)照品進(jìn)樣量( ug)為橫坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 求得回歸方程 Y= 3 866.2 X 87.923 , r = 0.999 8 , 黃芩苷進(jìn)樣量在 0.1 1.2ug內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。2.3.1提取溶劑考察進(jìn)樣量（ug） 2 4 6 8 10 峰面積甲醇乙醇2.4精密度試驗(yàn)精密吸取同一批供試品溶液, 重復(fù)進(jìn)樣 6次,依法測(cè)定, 黃芩苷峰面積的 RSD= 0.6%, 結(jié)果表明儀器精密度良好。2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一對(duì)照品溶液 10uL, 按上述色譜條件分別在 0,