生化討論第八組

1、放射免疫法和ELISA之間的差別 小組成員：劉蓉小組成員：劉蓉 鞏朵朵鞏朵朵 饒慧云饒慧云 李沖沖李沖沖放射免疫法放射免疫法一、原理： 利用放射性同位素標(biāo)記抗原或抗體，然后與被測的抗體或抗原結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物的原理來進(jìn)行分析的。分析方法分析方法放射免疫法分析有兩種方法：競爭性競爭性RIA,又稱傳統(tǒng)又稱傳統(tǒng)RIA非競爭性非競爭性RIA，又稱免疫放射分析（，又稱免疫放射分析（IRMA)2021-10-31 浙江萬里學(xué)院競爭性競爭性RIA 主要特點：標(biāo)記的是抗原。其原理：未知抗原Ag+標(biāo)記抗原Ag+已知定量抗體Ab標(biāo)記抗原與抗體復(fù)合物AgAb+未知抗原與抗體復(fù)合物AgAb+游離標(biāo)記抗原Ag（去

2、除）。2021-10-31 浙江萬里學(xué)院基本原理基本原理 Ag-Ab + Ag *Ag AbAg+*Ag-Ab + *Ag (B)復(fù)合物復(fù)合物 (F)游離物游離物 4*Ag與與Ag的免疫活性相同的免疫活性相同4*AgAg AbAg= * Ag , AgAb=*AgAbAg *Ag , *AgAb (B) *Ag(F)Ag 90%2）半衰期足夠長）半衰期足夠長3）保持原有抗原的特性）保持原有抗原的特性125I大分子、3H or 125I小分子2021-10-31 浙江萬里學(xué)院（二）（二） B和和F的分離的分離1、第一類、第一類2、第二類、第二類雙抗體沉淀法雙抗體沉淀法PEG沉淀法沉淀法固相第二抗

3、體法固相第二抗體法二、基本方法二、基本方法+AgAb(1)Ab(2)試管試管Ab(2)Ab(1)Ag可溶性復(fù)合物可溶性復(fù)合物可沉淀復(fù)合物可沉淀復(fù)合物2021-10-31 浙江萬里學(xué)院三、質(zhì)量控制（三、質(zhì)量控制（quality controlquality control） 1、精密度（、精密度（precision） 變異系數(shù)（變異系數(shù)（ CV ）2、準(zhǔn)確度（、準(zhǔn)確度（accuracy） 回收率回收率=測定值測定值/真實值真實值100% 90%110% 3、靈敏度、靈敏度 （sensitivity）方法的最小可測量方法的最小可測量4、特異性（、特異性（specificity）交叉反應(yīng)率交叉反應(yīng)率

4、5、可靠性（、可靠性（validity）平行性試驗平行性試驗6、穩(wěn)定性（、穩(wěn)定性（stability）B0%，NSB，ED25，ED50，ED75 ABC2021-10-31 浙江萬里學(xué)院RIA RIA 小小 結(jié)結(jié)靈敏度高靈敏度高特異性好特異性好精確的定量精確的定量方法操作簡便方法操作簡便2021-10-31 浙江萬里學(xué)院非競爭性非競爭性RIA（MISA) 主要特點：標(biāo)記的是抗體。按反應(yīng)原理又分兩種：單位點IRMA,其原理：抗原只有一個抗原決定簇，所測的抗原為小分子抗原。雙位點IRMA：抗原有兩個抗原決定簇，所使用的兩種亞型抗體在與同一抗原分子結(jié)合時互不干擾。2021-10-31 浙江萬里學(xué)院

5、免疫放射分析法免疫放射分析法*Ab+Ag-*Ab + *Ab（immunoradiometric assay,IRMA）B% Ag（B）（F）2021-10-31 浙江萬里學(xué)院 IRMA與與RIA工作原理的主要區(qū)別工作原理的主要區(qū)別2021-10-31 浙江萬里學(xué)院ELISAELISA即酶聯(lián)免疫吸附測定。其基本原理有三條： （1）抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫學(xué)活性； （2）抗原或抗體可通過共價鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性； （3）酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)

6、來判定是否有免疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗結(jié)果。 2021-10-31 浙江萬里學(xué)院 ELISA過程包括：抗原（抗體）吸附在固相載體上稱為包被，加待測抗體（抗原）, 再加相應(yīng)酶標(biāo)記抗體（抗原）,生成抗原（抗體）待測抗體（抗原）酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物，再與該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。借助分光光度計的光吸收計算抗體（抗原）的量。待測抗體（抗原）的定量與有色產(chǎn)生成正比。2021-10-31 浙江萬里學(xué)院 ELISA常用的四種方法常用的四種方法 1直接法測定抗原直接法測定抗原 1、將抗原吸附在載體表面； 2、加酶標(biāo)抗體，形成抗原

7、抗體復(fù)合物； 3、加底物。底物的降解量抗原量。 2間接法測定抗體間接法測定抗體 1、將抗原吸附于固相載體表面； 2、加抗體, 形成抗原-抗體復(fù)合物； 3、加酶標(biāo)抗體； 4、加底物。 測定底物的降解量抗體量。2021-10-31 浙江萬里學(xué)院洗滌洗滌洗滌洗滌洗滌洗滌待測抗體待測抗體酶標(biāo)抗抗體酶標(biāo)抗抗體2021-10-31 浙江萬里學(xué)院3.雙抗體夾心法測定抗原雙抗體夾心法測定抗原 1、將抗原免疫第一種動物獲得的抗體吸附于固相表面; 2、加抗原，形成抗原-抗體復(fù)合物; 3、加抗原免疫第二種動物獲得的抗體，形成抗體抗原抗體復(fù)合物; 4、加酶標(biāo)抗抗體（第二種動物抗體的抗體）; 5、加底物。底物的降解量抗

8、原量。2021-10-31 浙江萬里學(xué)院洗洗滌滌洗洗滌滌洗洗滌滌待測抗原待測抗原2021-10-31 浙江萬里學(xué)院 4. 競爭法測定抗原競爭法測定抗原（1）將抗體吸附在固相載體表面;（2）加入酶標(biāo)抗原（3）加入酶標(biāo)抗原和待測抗原；（4) 加底物。 對照孔與樣品孔底物降解量的差未知抗原量。 2021-10-31 浙江萬里學(xué)院洗滌洗滌洗滌洗滌待測抗原待測抗原酶標(biāo)抗原酶標(biāo)抗原2021-10-31 浙江萬里學(xué)院2021-10-31 浙江萬里學(xué)院每空加洗滌液 350ul，30秒甩去孔內(nèi)液體，吸水紙上拍干吸干孔內(nèi)液體，吸水紙上拍干重復(fù)3次2021-10-31 浙江萬里學(xué)院標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的OD值減去空白孔的O

9、D值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，查出標(biāo)本濃度2021-10-31 浙江萬里學(xué)院放射免疫法和ELISA之間的差別 1)放射免疫分析通過放射活性分子共價交聯(lián)至抗體或抗原上，免疫反應(yīng)后測定放射活性分子的放射信號來定量檢測相應(yīng)抗體或抗原等，可用于測定包括病毒、細(xì)菌、寄生蟲、腫瘤以及小分子藥物等的多種抗原和抗體。由于該方法特異性好，靈敏度高，且儀器自動化，操作簡便，樣品制備簡單等，因而自50年代末問世以來已在許多領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用。但該方法中操作人員需要接觸放射性物質(zhì)，會損害操作人員的身體，同時測定完成后放射性材料的處置也是個嚴(yán)重的問題。2021-10-31 浙江萬里學(xué)院總結(jié) 2)酶免疫分析是將抗原、抗體的特異性免疫反應(yīng)和酶的高效催化作用有機結(jié)合起來的一種免疫分析方法。將特定的酶標(biāo)記在抗原或抗體上，在免疫反應(yīng)后，通過肉眼觀察或借助簡單的光學(xué)儀器測定酶催化底物所生成的有色產(chǎn)物的顏色或吸光度可方