凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)EMSA技術(shù)

1、· 什么是凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)？· 凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。這一技術(shù)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白，目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。 通常將純化的蛋白和細(xì)胞粗提液和32P同位素標(biāo)記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針。DNA-復(fù)合物或RNA-復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動得慢。同位素標(biāo)記的探針依研究的結(jié)合蛋白的不同，可是雙鏈或者

2、是單鏈。當(dāng)檢測 如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子一類的DNA結(jié)合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或核細(xì)胞抽提液。在檢測RNA結(jié)合蛋白時，依據(jù)目的RNA結(jié)合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也可用核或胞質(zhì)細(xì)胞抽提液。競爭實(shí)驗(yàn)中采用含蛋白結(jié)合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特異）， 和其它非相關(guān)的片段（非特異），來確定DNA或RNA結(jié)合蛋白的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下，依據(jù)復(fù)合物的特點(diǎn)和強(qiáng)度來確定特異結(jié)合。EMSA原理示意圖如下： · 凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)常用的實(shí)驗(yàn)手段有同位素32P法和非同位素法（化學(xué)發(fā)光法）。· 一般做這樣的實(shí)驗(yàn)需要什么試

3、劑？凝膠遷移實(shí)驗(yàn)需要的結(jié)合蛋白，可來源于純化或部分純化的蛋白，或粗的核和胞質(zhì)抽提液。還必須制備同位素標(biāo)記的DNA或RNA。一般，DNA核苷酸探針用g-32P和T4多核苷酸激酶來作末端標(biāo)記，同位素標(biāo)記的RNA用噬菌體RNA聚合酶和同位素標(biāo)記的核苷酸在體外合成。結(jié)合反應(yīng)所需的組分有：含鹽的溶液（氯化鎂，氯化鈉，或氯化鉀）、緩沖體系（Tris-HCl或HEPES）、還原劑（DTT）、甘油、非特異的競爭DNA（poly(dI:dC)(dI:dC)），也可能含非離子去污劑。在結(jié)合蛋白和同位素標(biāo)記的探針作用后，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物，隨后將凝膠干燥并放射自顯影， 或用PhosphorIma

4、ge分析。  · 成功進(jìn)行凝膠遷移實(shí)驗(yàn)，需要優(yōu)化哪些因素？凝膠遷移實(shí)驗(yàn)在理論上很簡單也很快速，但要成功地進(jìn)行凝膠遷移實(shí)驗(yàn)，需要優(yōu)化一些參數(shù)，這主要受結(jié)合蛋白的來源和探針結(jié)合位點(diǎn)特點(diǎn)的影響。以下是需要優(yōu)化的因素：抽提液的制備（核酸酶和磷酸酶污染會使探針降解），結(jié)合蛋白的濃度，探針的濃度，非特異性探針的濃度，緩沖液的配方和pH, 聚丙烯凝膠電泳的特點(diǎn)和電泳條件，保溫時間和溫度，載體蛋白， 是否有輔助因子（比如鋅，或鎘等金屬離子，或激素）。總之，反應(yīng)總體積應(yīng)最?。?0uL）。為滿足一般要求，結(jié)合緩沖液含4%甘油，1mM MgCl2, 0.5mM EDTA, 0.5mM DTT,

5、50mM NaCl, 10mM Tris-HCl(pH7.5), 0.05mg/mL poly(dI:dC)?dI:dC,或10mM HEPES(pH7.9), 50mM KCl, 1mM DTT, 1mM EDTA, 10%甘油，0.05mg/mL poly(dI:dC)?dI:dC可作為優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的起始。  · 常用的同源的多核苷酸引物，這些引物的序列來源是什么？有各類dsDNA探針，它們含各種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的同源結(jié)合位點(diǎn)。下表列出了所能提供的探針，和這些引物序列的出處。轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子探針探針名 / 目錄號 / 序列（上鏈） / 序列的出處Sp1 / E3231 E3232

6、/ 5-ATT CGA TCG GGG CGG GGC GCG-3 / SV40啟動子（1）AP1 / E3201 E3202 / 5-CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA-3 / 膠原酶基因TRE（2）AP2 / E3211 E3212 / 5-GAT CGA ACT GAC CGC CCG CGG CCC GT-3 / 人金屬硫堇II a（3）基因NF-kB / E3291 E3292 / 5-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3 / 鼠Igk輕鏈基因（4）Oct1 / E3241 E3242 / 5-TGT CGA ATG CAA ATC AC

7、T AGA A-3 / Ig重鏈基因（5）CREB / E3281 E3282 / 5-AGA GAT TGC CTG ACG TCA GAC AGC TAG-3 / 大鼠生長激素抑制基因（6）TFIID / E3221 E3222 / 5-GCA GAG CAT ATA AGG TGA GGT AGG A-3 / belta-1球蛋白啟動子注：只列出了上鏈的序列，探針是雙鏈，下鏈序列和上鏈序列配對。粗體字表明序列來源于指定的基因序列，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合的序列用下線表明。一般而言，周圍的核苷酸是任意。· 在DNA探針的選擇上，要考慮哪些重要因素？目的DNA的長度應(yīng)小于300bp，以有利

8、于非結(jié)合探針和蛋白DNA復(fù)合物的電泳分離。雙鏈的合成的寡核苷酸和限制性酶切片段可在凝膠遷移實(shí)驗(yàn)中用作探針。如目的蛋白已被鑒定，則應(yīng)用短的寡核苷酸片段（約為25bp）,這樣結(jié)合位點(diǎn)可和其他因子的結(jié)合位點(diǎn)區(qū)別開。長的限制性酶切片段可用于對推定的啟動子/增強(qiáng)子區(qū)域內(nèi)的蛋白結(jié)合位點(diǎn)定位。隨后可用DNaseI 印跡對蛋白結(jié)合的特異區(qū)域在DNA序列水平上作出分析。· 用以下一些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和HeLa細(xì)胞核抽提物可形成哪些復(fù)合物：AP1, AP2, CREB, NFkB, Oct1, Sp1, TFIID, TFIIB?當(dāng)用HeLa細(xì)胞核抽提物作為結(jié)合蛋白的來源時，每1個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和它相關(guān)的DN

9、A同源序列結(jié)合形成特征型的結(jié)合形態(tài)。以下的文字描述了每一個單獨(dú)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，包括識別的同源序列，因子的大小，特定的結(jié)合條件，以及和HeLa細(xì)胞核抽提物可形成的復(fù)合物的數(shù)目。 1AP1：AP1（激活蛋白1）是一個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它結(jié)合的同源序列為5-TGAGTCA-3。當(dāng)基因的啟動子區(qū)域存在AP1的結(jié)合位點(diǎn)時，這些基因可以被誘導(dǎo)，比如用佛波酯可誘導(dǎo)蛋白激酶C（2，7）。在細(xì)胞中，AP1形成c-Jun或Jun相關(guān)蛋白的同聚雙體，或者形成c-Jun或Jun相關(guān)蛋白和c-Fos或Fos相關(guān)抗原（Fras）的異源雙體。Fos蛋白自身不能形成同聚雙體，并不能單獨(dú)和AP1結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。c-Jun蛋白是一個4

10、0kDa的單體蛋白并通過亮氨酸拉鏈形成同聚雙體。在HeLa細(xì)胞中，AP1的主要形式是c-Jun蛋白的同聚雙體。在凝膠遷移實(shí)驗(yàn)中，形成一個特異的復(fù)合物。當(dāng)作凝膠遷移實(shí)驗(yàn)測定AP1的活力時，除了基本的溶液組分外，應(yīng)將0.01mg/mL poly(dI:dC)(dI:dC),100ug BSA, 5mMDTT加入到結(jié)合緩沖液中。如用純化的蛋白，則用1-2ug的蛋白來檢測遷移復(fù)合物。 2AP2：AP2是一個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可分別作為TPA-和cAMP誘導(dǎo)因子（10）。它是一個52 kDa的蛋白，識別的同源序列為5-CCCCAGGC-3或5-GCCNNGGC-3（3）。這個因子對視黃酸特別敏感，可能在形態(tài)

11、發(fā)生中起著重要作用。HeLa細(xì)胞核抽提物和AP2同源DNA探針形成一個特定的復(fù)合物。用純化的蛋白作凝膠遷移實(shí)驗(yàn)時，應(yīng)用20-50ng的蛋白。 3CREB：CREB是一個37 kDa的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，對cAMP應(yīng)答，識別5-T（G/T）ACGTCA-3DNA同源序列（6，11）。它含亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)而形成同聚雙體，相關(guān)的基本結(jié)構(gòu)域和c-JunDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域同源。當(dāng)用HeLa細(xì)胞核抽提物時，能和CREB同源序列形成一個復(fù)合物。 4NF-kB：NF-kB最初被鑒定為在B細(xì)胞中和免疫球蛋白k輕鏈的增強(qiáng)子結(jié)合。但隨后在非B-細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中被發(fā)現(xiàn)，形成NF-kB和IkB的復(fù)合物。最初在DNA結(jié)合蛋白復(fù)合物中

12、分離的NF-kB是由p65(RelA)和p50構(gòu)成的異源雙聚體。其他分離的單體包括p49（也可稱為p52），p75（c-Rel）,p68(RelB)。p65，p68，p75單體起反式激活作用。p50，p49（p52）單體具有DNA結(jié)合活力，但只具有微量的反式激活作用。據(jù)報道p49和NF-kB的單體p65形成具有轉(zhuǎn)錄活力的異源雙體，類似于p50/ p65異源雙體。p49/ p65和p50/ p65異源雙體在細(xì)胞質(zhì)中受一種叫IkBa/MAD-3的抑制劑調(diào)節(jié)。IkB和p65單體結(jié)合，阻制了細(xì)胞核中的定位和DNA的結(jié)合。在體外高濃度的p65能形成同源雙聚體，能和DNA微弱地結(jié)合。Poly(dI:dC)

13、能抑制這一反應(yīng)（14）。p49和p50也能形成同源雙聚體，但在細(xì)胞中的濃度很低。通常，在作NF-kB的凝膠遷移實(shí)驗(yàn)時，在20ul的反應(yīng)體積中，有溶于10 mM HEPES的0.28pmoles 的NF-kB9寡核苷酸（pH7.9), 50mMKCl, 0.2mMEDTA, 2.5mM DTT, 10%甘油, 0.05%NP-40。當(dāng)用純化的蛋白時，250-300ng足以形成凝膠遷移復(fù)合物，而需用10ug的HeLa細(xì)胞核抽提物。凝膠遷移復(fù)合物在室溫中保溫30分鐘，在50mMTris(pH8.3)和38mM甘氨酸的7%聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離凝膠遷移復(fù)合物。含考馬斯蘭和二甲苯藍(lán)色素的加樣溶液只能加

14、入到陰性對照反應(yīng)中，因這兩種色素會加劇NF-kB復(fù)合物的解離。當(dāng)用HeLa細(xì)胞核抽提物作為結(jié)合蛋白來源時，可形成兩種序列特異的凝膠遷移復(fù)合物，即p50/p50同源雙聚體和p50/ p65異源雙聚體。在表達(dá)p49，p50，p65的細(xì)胞中，可檢測到4個序列特異的凝膠遷移復(fù)合物（p49/ p49，p50/ p50，p50/ p65，p49/ p65），如果存在高濃度的p65，可檢測到微量的p65/p65。下列試劑可加強(qiáng)NF-kB在體外的結(jié)合：mM的GTP，ATP，精胺，亞精胺，鋇或鈣離子，ng的Co+3(NH3)6（12）。 5OCT1：OCT1是OCT轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家簇中的一員，顯然在哺乳細(xì)胞中存在

15、比較廣泛（5）。POU結(jié)構(gòu)域包括POU-box和Homeo結(jié)構(gòu)域。當(dāng)用HeLa細(xì)胞核抽提物時，可檢測到一個與OCT1同源探針形成的序列同源凝膠遷移復(fù)合物。 6SP1：SP1是一個O-糖基化的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它識別10個核苷酸長度的同源序列5-GGGGCGGGGC-3（1）。核心識別序列是5-GGGGCGGG-3。同核心序列相似的序列常存在于啟動子中。SV40的早期啟動子就是一個例子，它是第一個可以結(jié)合SP1的啟動子。根據(jù)糖基化的不同，它的分子量在95-105kDa，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的三個鋅指紋決定了序列的特異性。HeLa細(xì)胞核抽提物與SP1同源探針形成特異的凝膠遷移復(fù)合物。 7TFIID/TF

16、IIB：TFIID和TFIIB是基本的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，參與RNA聚合酶II啟動子的基本的轉(zhuǎn)錄（16）。TFIID與真核啟動子的TATA區(qū)域形成特異的DNA結(jié)合。TFIID由幾個蛋白組成，而其中的TATA區(qū)域結(jié)合蛋白（TBP），參與TATA序列的結(jié)合。TFIID的其他的蛋白組分被稱為TBP-相關(guān)因子（TAFs）。用TFIID探針寡核苷酸和HeLa細(xì)胞核抽提物，可得到一個微弱的凝膠遷移帶，但很難確定為是TFIID序列特異凝膠遷移復(fù)合物。純化的重組的TBP很難作凝膠遷移實(shí)驗(yàn)，這部分是由于TBP存在很強(qiáng)的正電荷，導(dǎo)致TBP/DNA復(fù)合物很難進(jìn)入凝膠。純化的TBP形成二聚體后不能結(jié)合DNA（17）。因此形

17、成的二聚體可參與DNA結(jié)合。TFIIB不單獨(dú)與DNA結(jié)合，但與TFIID結(jié)合后增強(qiáng)它與DNA的結(jié)合。 TFIIB與預(yù)啟動復(fù)合物結(jié)合后，致使RNA聚合酶II和TFIIF結(jié)合到轉(zhuǎn)錄啟始區(qū)。故TFIIB在預(yù)啟動復(fù)合物的形成中有重要作用。當(dāng)用純化的TFIID作凝膠遷移實(shí)驗(yàn)時，poly(dI-dC)不用加入結(jié)合反應(yīng)中。結(jié)合緩沖液含10%甘油，20mMTris(pH8.0), 10mMMgCl2, 2mMDTT, 89mMKCl。對TFIID的凝膠結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，可加入poly（dG:dC）?dG:dC。形成的復(fù)合物在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離，凝膠組分是：0.5TBE, 6%聚丙烯酰胺凝膠(19:1丙烯

18、酰胺:雙叉),4mMMgCl2, 0.02%NP-40, 電泳緩沖液組分是：0.5TBE，4mMMgCl2, 0.02%NP-40。當(dāng)研究含TFIID和TFIIB的復(fù)合物時，應(yīng)從結(jié)合緩沖液，凝膠，和電泳緩沖液中去除MgCl2。這些是一般的要求，用不同的細(xì)胞抽提物和TFIID、TFIIB形成復(fù)合物作凝膠遷移實(shí)驗(yàn)時，應(yīng)對多種因素進(jìn)行優(yōu)化以達(dá)到理想的條件。· 在一次凝膠遷移實(shí)驗(yàn)中，用多少量的蛋白質(zhì)或抽提物，和標(biāo)記的DNA探針？對每一個特定的結(jié)合蛋白和探針，所用的純化蛋白，部分純化蛋白，粗制核抽提液需作優(yōu)化，一般所用純化蛋白的量在20-2000ng間，可將蛋白：DNA的等摩爾比調(diào)整為蛋白的摩

19、爾數(shù)是DNA的5倍。用粗制核抽提液，需要1-20ug蛋白形成特異的復(fù)合物。所加入反應(yīng)的探針的量是50，000-200，000cpm32P-標(biāo)記的探針（高特異活性），反應(yīng)體積為1-5ul。這相當(dāng)于10-50fmoles的DNA探針。探針應(yīng)保存在-20oC以防止降解，在合成或標(biāo)記后1-2個星期內(nèi)必需使用。無論探針或是結(jié)合蛋白應(yīng)避免多次凍融。· 能用體外翻譯法制備目的蛋白質(zhì)嗎？一般，用麥胚抽提物作哺乳細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子或DNA結(jié)合蛋白的體外翻譯，兔網(wǎng)織紅細(xì)胞溶裂解液可能含有內(nèi)源哺乳細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子或DNA結(jié)合蛋白。但TNT兔網(wǎng)織細(xì)胞溶解液系統(tǒng)（a,b,c,d）與TranscendTM 生物素標(biāo)記的t

20、RNA(目錄號E3201)一同使用，翻譯了轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子AP1（c-Jun），它使AP1同源寡核苷酸（目錄號E3201）產(chǎn)生的遷移效果和重組的AP1相同（18）。TNT-T7偶聯(lián)的麥胚抽提物（b,c,d,e）在體外翻譯了c-Rel。這一蛋白特異地使免疫球蛋白k輕鏈增強(qiáng)子探針產(chǎn)生遷移。在c-Rel結(jié)合反應(yīng)中加入體外翻譯的MAD-3（IkB家簇中一員）可干擾其相互作用。· poly(dI:dC)(dI:dC)，非特異性競爭DNA，特異性競爭DNA的功能是什么？它由肌苷和胞嘧啶組成。由于其特定的結(jié)構(gòu)，可抑制蛋白對標(biāo)記探針的非特異結(jié)合，避免假復(fù)合物。 在凝膠遷移反應(yīng)中加入poly(dI:dC)

21、(dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中其它DNA結(jié)合蛋白結(jié)合，比如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的非特異結(jié)合。當(dāng)用純化的蛋白作凝膠遷移反應(yīng)時，不必一定加入poly(dI:dC)(dI:dC)，如加入，則普通反應(yīng)中所用終濃度不超過50-100ng。對核抽提液，每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)(dI:dC)。為確定所形成的復(fù)合物的特異性，在含或不含增量的非放射性的特異競爭DNA或非特異的競爭DNA時，作結(jié)合反應(yīng)的競爭實(shí)驗(yàn)。一般，非放射性的特異DNA是非標(biāo)記的DNA探針，非特異的競爭DNA ，長度組成和DNA探針相同，序列不同。用非放射性的特異DNA能競爭掉，而用非特異的競爭DNA不能競爭掉的復(fù)合

22、物，表明目的蛋白和同位素標(biāo)記探針的特異結(jié)合。非特異結(jié)合能用特異DNA和非特異的競爭DNA競爭掉。結(jié)合溶液中的poly(dI:dC)(dI:dC)的量需作優(yōu)化，但一般用0.05mg/ml。非放射性的（特異或非特異）的競爭DNA的用量也需優(yōu)化或滴定，但競爭DNA通常是同位素標(biāo)記的探針的10-1000倍（w/w）。其他類型的競爭DNA如小牛胸腺DNA不能用于凝膠遷移反應(yīng)，它們會帶有目的蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。· 用什么凝膠條件將蛋白質(zhì)/探針復(fù)合物和游離的探針分離開？將結(jié)合蛋白或粗制核抽提液和目的探針結(jié)合，蛋白/探針復(fù)合物和游離探針可在非變性聚丙烯酰胺凝膠中經(jīng)電泳分離。聚丙烯酰胺的濃度一般為6%（3

23、0：1丙烯酰胺：雙叉），在特定條件下可用高或低的濃度。pH, 聚丙烯酰胺的濃度, 丙烯酰胺：雙叉丙烯酰胺的比會影響復(fù)合物在凝膠中的遷移。大多數(shù)蛋白用10-15伏的電壓，解離快的蛋白用短時間和高的電壓（30-35伏的電壓），電泳時所用的TBE和TAE必需是新配制的，無沉淀。低的離子強(qiáng)度和丙烯酰胺基質(zhì)的箱子效果有助于復(fù)合物的穩(wěn)定。也可將TGE緩沖液（12.5mM Tris，pH8.3，95mM 甘氨酸，0.5mM EDTA）用于不穩(wěn)定的蛋白/DNA復(fù)合物?？稍?oC進(jìn)行結(jié)合和電泳實(shí)驗(yàn)以阻止不穩(wěn)定復(fù)合物和探針的解離。 加樣樣品液中的色素會導(dǎo)致不穩(wěn)定復(fù)合物的解離，應(yīng)用不含考馬斯蘭和二甲苯藍(lán)的加樣樣品液。當(dāng)帶型不緊密出現(xiàn)拖尾時，表明復(fù)合物存在解離。凝膠必需完全聚合，以避免帶型拖尾。如復(fù)合物不進(jìn)入凝膠則表明所用的蛋白或探針過量，或鹽的濃度過量不適用于這一反