動物細(xì)胞工程制藥的研究進(jìn)展

1、動物細(xì)胞工程制藥的研究進(jìn)展1161001413167 劉星星摘 要：動物細(xì)胞工程制藥是動物細(xì)胞技術(shù)在生物制藥工業(yè)方面的應(yīng)用。本文介紹了動物細(xì)胞工程制藥所涉及的主要技術(shù)及其進(jìn)展，包括動物細(xì)胞融合技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)和細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)等，在此基礎(chǔ)上探討了動物細(xì)胞工程制藥的發(fā)展趨勢。關(guān)鍵詞：動物細(xì)胞工程；生物制藥；細(xì)胞融合；轉(zhuǎn)基因動物；細(xì)胞培養(yǎng)目錄一、引言3二、動物細(xì)胞工程簡介3（一）生產(chǎn)用動物細(xì)胞31.原代細(xì)胞32.傳代細(xì)胞系(continuous cell lines,ccl)43.工程細(xì)胞系44.轉(zhuǎn)化細(xì)胞系4（二） 動物細(xì)胞工程制藥技術(shù)51.細(xì)胞融合52.轉(zhuǎn)基因動物53.細(xì)胞核移植技術(shù)64.

2、動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)7三、發(fā)展前景8四、結(jié)論8參考文獻(xiàn)9一、引言動物細(xì)胞工程制藥是動物細(xì)胞技術(shù)在生物制藥工業(yè)方面的應(yīng)用。本文介紹了動物細(xì)胞工程制藥所涉及的主要技術(shù)及其進(jìn)展，包括動物細(xì)胞融合技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)和細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)等，在此基礎(chǔ)上探討了動物細(xì)胞工程制藥的發(fā)展趨勢。二、動物細(xì)胞工程簡介所謂動物細(xì)胞工程，是根據(jù)細(xì)胞生物學(xué)及工程學(xué)原理，定向改變動物細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)從而獲得新型生物或特種細(xì)胞產(chǎn)品的一門技術(shù)。這一技術(shù)在生物制藥的研究和應(yīng)用中起關(guān)鍵作用，目前全世界生物技術(shù)藥物中使用動物細(xì)胞工程生產(chǎn)的已超過80% ，例如蛋白質(zhì)、單克隆抗體、疫苗等。當(dāng)前動物細(xì)胞工程制藥所涉及的主要技術(shù)領(lǐng)域包括細(xì)胞融

3、合技術(shù)、細(xì)胞核移植技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)和細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)等方面。本文就動物細(xì)胞工程制藥所采用的細(xì)胞種類及相關(guān)技術(shù)等進(jìn)行綜述。 （一）生產(chǎn)用動物細(xì)胞 目前用于生物制藥的動物細(xì)胞有4類，即原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞系、融合的或重組的工程細(xì)胞系和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。 1.原代細(xì)胞原代細(xì)胞是直接取自動物組織器官,經(jīng)過粉碎消化而獲得的細(xì)胞懸液。動物細(xì)胞生產(chǎn)生物藥品的早期，一般用原代培養(yǎng)的細(xì)胞來生產(chǎn)疫苗，如雞胚細(xì)胞、原代兔腎細(xì)胞、鼠腎細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，ender 最先用原代培養(yǎng)的猴腎組織細(xì)胞來生產(chǎn)脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗。原代細(xì)胞增殖能力有限，需要大量動物才能增加產(chǎn)量，費(fèi)錢費(fèi)力，限制了它的應(yīng)用。2.傳代細(xì)胞系(contin

4、uous cell lines,ccl)原代細(xì)胞經(jīng)過傳代篩選克隆，從多種細(xì)胞成分中挑選并純化出某種具有一定特征的細(xì)胞株稱為 ccl。許多 ccl 建立于 50年代，用它們來生產(chǎn)疫苗不僅可以降低實(shí)驗(yàn)動物的量，并且因?yàn)樗玫募?xì)胞性質(zhì)均一，通過體外大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的疫苗可以保證質(zhì)量，避免了動物個體差異產(chǎn)生的疫苗質(zhì)量不穩(wěn)定問題。但 c c l 在生物學(xué)特性上與腫瘤細(xì)胞有許多相似之處, 有時是從腫瘤細(xì)胞衍生而來, 由于缺乏有效的科學(xué)手段來排除其潛在的致瘤性, 因而數(shù)十年間未允許 c c l 用于生產(chǎn)。7 0 年代以后，大量研究工作證實(shí)了二倍體細(xì)胞的安全性, wi-38 是第一個生產(chǎn)脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗的

5、二倍體細(xì)胞系。二倍體細(xì)胞系一般從動物胚胎組織中獲取，有明顯的貼壁和接觸抑制特性，有正常細(xì)胞的核型，一般可傳代培養(yǎng) 5 0 代，且無致瘤性，現(xiàn)在c c l 已被廣泛用于人用治療性藥物的生產(chǎn)，但仍不是理想的生產(chǎn)細(xì)胞系。表 1 列出了一些常用的生產(chǎn)用動物細(xì)胞系。3.工程細(xì)胞系 工程細(xì)胞系是指采用基因工程技術(shù)或細(xì)胞融合技術(shù)對宿主細(xì)胞的遺傳物質(zhì)進(jìn)行修飾改造或重組，獲得具有穩(wěn)定遺傳的獨(dú)特性狀的細(xì)胞系。用于構(gòu)建工程細(xì)胞的動物細(xì)胞有 bhk-21、cho-dhfr、namalwa、vero、sp2/0、sf-9 等細(xì)胞系1-2。sp2/0 - a g 1 4 工程細(xì)胞系是通過融合的方法，從抗羊紅細(xì)胞活性的 b

6、 a l b / c 的小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞系 p 3 x 6 3 a g 8 融合雜交瘤sp2/nl-ag 亞克隆中分離獲得，可用于生產(chǎn)單克隆抗體2。目前用重組 d n a 技術(shù)改造的 c h o 細(xì)胞生產(chǎn)干擾素、白介素、e p o 、單克隆抗體、診斷試劑以及其它各種蛋白質(zhì)類藥品已成為國際醫(yī)藥市場上的熱銷產(chǎn)品，但這些產(chǎn)品的生產(chǎn)規(guī)模普遍較小(大多為 550 升的小型培養(yǎng)罐)5。4.轉(zhuǎn)化細(xì)胞系 通過某個轉(zhuǎn)化過程形成的，常由于染色體斷裂變成異倍體，失去正常細(xì)胞特點(diǎn)，而獲得無限增殖能力。轉(zhuǎn)化細(xì)胞系具有長期培養(yǎng)，倍增時間短，對培養(yǎng)條件和生長因子等要求較低的特點(diǎn)，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。在生物制藥中，可

7、通過改造宿主細(xì)胞特性，如延長細(xì)胞周期提高工程細(xì)胞原始表達(dá)水平等來提高藥物的產(chǎn)量。李紅艷等研究空間環(huán)境對 cho(dhfr )細(xì)胞生長特性的影響，結(jié)果表明空間誘變致生長減慢的細(xì)胞株有利于提高目的蛋白的產(chǎn)量，為篩選優(yōu)化的生物工程制藥細(xì)胞提供可能3。目前 cho(dhfr )作為重要的基因表達(dá)受體細(xì)胞，已成功應(yīng)用于表達(dá)促紅細(xì)胞生成素(epo) 、重組乙型肝炎疫苗等生物制藥領(lǐng)域4-5。 （二） 動物細(xì)胞工程制藥技術(shù)1.細(xì)胞融合 細(xì)胞融合指在誘導(dǎo)劑或促融劑作用下，兩個或兩個以上的異源細(xì)胞或原生質(zhì)體相互接觸，進(jìn)而發(fā)融合并形成雜種細(xì)胞的現(xiàn)象。細(xì)胞融合技術(shù)作為細(xì)胞工程的核心基礎(chǔ)技術(shù)之一，不僅在農(nóng)業(yè)、工業(yè)的應(yīng)用

8、領(lǐng)域不斷擴(kuò)大，而且在醫(yī)藥領(lǐng)域也取得了開創(chuàng)性的研究成果，如單克隆抗體、疫苗等生物制品的生產(chǎn)。在動物體細(xì)胞融合技術(shù)的基礎(chǔ)上 kohler g和 milstein c將能產(chǎn)生特異性抗體的原代 b 淋巴細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，創(chuàng)立了單克隆抗體制備的方法5。國內(nèi)外已培育出了許多具有很高實(shí)用價值的雜交瘤細(xì)胞株系，它們能分泌用于疾病診斷和治療的單克隆抗體，如甲肝病毒、抗人 i g m 、抗人肝癌和肺癌、抗m-csfr（macrophage colony-stimulat-ing factor receptor，巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體）胞外區(qū)的單克隆抗體等7-9。目前單克隆抗體技術(shù)已趨成熟，許多產(chǎn)品已經(jīng)進(jìn)入

9、產(chǎn)業(yè)化的生產(chǎn)階段。此外利用細(xì)胞融合技術(shù)可以生產(chǎn)各種免疫疫苗，腫瘤細(xì)胞 / 樹突狀細(xì)胞融合疫苗是近年來國內(nèi)外惡性腫瘤免疫治療研究的熱點(diǎn), 在各種動物模型及病人身上觀察到腫瘤的消退9-11。avigan 等將乳腺癌或腎癌病人的自體癌細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞在含有人粒 - 巨噬細(xì)胞集落刺激因子、白介素 - 4 的自體血清中培養(yǎng)，加入聚乙二醇使兩種細(xì)胞產(chǎn)生融合, 融合細(xì)胞疫苗能使腫瘤消退10，顯示其在腫瘤治療方面具有良好的應(yīng)用前景。2.轉(zhuǎn)基因動物 利用轉(zhuǎn)基因動物乳腺反應(yīng)器生產(chǎn)藥用或食品蛋白是生物制藥領(lǐng)域近年來研究的熱點(diǎn)之一。因?yàn)槿橄偈且粋€外分泌器官，乳汁不進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)，不會影響到轉(zhuǎn)基因動物本身的生理反應(yīng)，從轉(zhuǎn)

10、基因動物的乳汁中獲取的目的基因產(chǎn)物，不但產(chǎn)量高、易提純，而且表達(dá)的蛋白經(jīng)過了充分的修飾加工，具有穩(wěn)定的生物活性，因此又被稱為動物乳腺生物反應(yīng)器，所以用乳腺表達(dá)人類所需蛋白基因的羊、牛等產(chǎn)量高的動物就相當(dāng)于一座藥物工廠。20 世紀(jì) 80 年代中期，英國科學(xué)家克拉克首先在鼠的乳腺組織高效表達(dá)了人抗胰蛋白酶因子基因，開創(chuàng)了研制動物乳房生物反應(yīng)器的先河13-14。 據(jù)美國遺傳學(xué)會預(yù)測，到2010年，所有基因工程藥物中利用動物乳房生物反應(yīng)器生產(chǎn)的份額將高達(dá)95。國外現(xiàn)已有數(shù)十家以動物乳腺反應(yīng)器為核心技術(shù)的公司，可生產(chǎn) 1 抗胰蛋白酶、人紅細(xì)胞生成素、乳鐵蛋白、人血清白蛋白、人血紅蛋白及人凝血因子、和抗凝

11、血酶、血纖維蛋白原、t p a 等十余種稀有藥品，但只有為數(shù)極少的幾種藥用蛋白上市。2006 年 6 月，由美國 genzyme 轉(zhuǎn)基因公司研制成功的世界上第一個利用轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的基因工程蛋白藥 物 棗 重 組 人 抗 凝 血 酶 （ 商 品 名 ：atryn 牋）已經(jīng)獲準(zhǔn)上市12。 我國自 1998 年在國家“863 ”計(jì)劃中將“轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器”作為重大研究項(xiàng)目以來，也取得了一些較好的成績。1996 年研制成功的能在乳腺中表達(dá)人凝血因子、epo 的轉(zhuǎn)基因羊；1 998 年曾溢滔等獲得了能表達(dá)人血清白蛋白的轉(zhuǎn)基因奶牛; 2 0 0 0 年中國農(nóng)業(yè)大學(xué)與北京興綠原生物技

12、術(shù)中心合作，成功獲得了我國首例轉(zhuǎn)有人 a l 一抗胰蛋白酶基因的轉(zhuǎn)基因羊1131；2005 年中國農(nóng)業(yè)大學(xué)和北京濟(jì)普霖生物技術(shù)有限公司聯(lián)合研制的人乳鐵蛋白和人乳清白蛋白轉(zhuǎn)基因奶牛均獲得高效表達(dá)，含量分別達(dá)到3.4 克 / 升和 1.5 克 / 升，標(biāo)志了我國首次獲得可商業(yè)化生產(chǎn)的動物乳腺生物反應(yīng)器重組人類蛋白15-16。目前科學(xué)家們正在加緊開展重組蛋白純化、臨床前試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)等研究，力爭早日實(shí)現(xiàn)我國動物乳腺生物反應(yīng)器制藥技術(shù)產(chǎn)業(yè)化。3.細(xì)胞核移植技術(shù) 細(xì)胞核移植技術(shù)，是指將一個動物細(xì)胞的細(xì)胞核移植至去核的卵母細(xì)胞中，產(chǎn)生與供細(xì)胞核動物的遺傳成份一樣的動物的技術(shù)。科學(xué)家們已經(jīng)先后在綿羊、小鼠、

13、牛、豬、山羊等動物上獲得胚胎細(xì)胞核移植后代，目前，體細(xì)胞克隆也在牛、山羊、小鼠等物種上均獲得了成功。若將轉(zhuǎn)基因與細(xì)胞核移植技術(shù)獲得的克隆動物工廠相結(jié)合，在生物制藥方面具有巨大的潛在應(yīng)用價值。1998 年，rohl 等用非靜息期胎兒或纖維細(xì)胞成功克隆出 3只健康、同類的攜帶外源標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因克隆17。schnieke 等18用此法成功克隆出 3 只攜帶有人凝血因子 x 基因轉(zhuǎn)染綿羊早期胎兒成纖維細(xì)胞，以該細(xì)胞系為供體移植到去核卵母細(xì)胞中，經(jīng)過電和化學(xué)刺激后，將卵母細(xì)胞植入假孕母綿羊體內(nèi)發(fā)育，獲得這 3 只綿羊，這 3 只綿羊能高水平地表達(dá)人凝血因子 x （125 g/ml ）。cibelli等

14、19同樣也獲得3頭轉(zhuǎn)基因牛。這些研究展示了轉(zhuǎn)基因克隆動物技術(shù)的可能性，為細(xì)胞工程制藥帶來了光明前景。4.動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)動物細(xì)胞的大規(guī)模高效培養(yǎng)技術(shù)是生物制藥的關(guān)鍵技術(shù)，通過動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)生物產(chǎn)品已成為全球生物工業(yè)的主要支柱。目前動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)較多的生物制劑是蛋白和抗體，通常采用中國倉鼠的卵巢細(xì)胞，事先將能產(chǎn)生某種蛋白質(zhì)藥品的基因片段與倉鼠卵巢細(xì)胞的 d n a 融合再在培養(yǎng)液中大量培養(yǎng)它們、最后得到所需藥品。與微生物發(fā)酵法比，雖然產(chǎn)量相對較低。但設(shè)備費(fèi)用節(jié)省得多，如屬于小品種、小產(chǎn)品類生物工程產(chǎn)品，可采用此法。目前用于動物細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物反應(yīng)器有機(jī)械攪拌式、氣升式、中空纖維式、回轉(zhuǎn)生

15、物反應(yīng)器等。國外占主流優(yōu)勢的是攪拌式生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)，為提高細(xì)胞的產(chǎn)率，可采用流加或灌注培養(yǎng)及微載體培養(yǎng)等相關(guān)技術(shù)20-21。美國 genentech 公司使用 cho 細(xì)胞以 12,000l 攪拌式生物反應(yīng)器培養(yǎng)槽生產(chǎn) t - p a 重組蛋白以及治療癌癥的生物藥物。美國 g i b c o 公司建立的流加懸浮培養(yǎng) rcho 表達(dá) r gal 系統(tǒng)，采用化學(xué)修飾的無蛋白 c h o 細(xì)胞培養(yǎng)基并增加 t c a 循環(huán)，生物反應(yīng)器中活細(xì)胞密度最高可達(dá) 107cell/ml。國內(nèi)第四軍醫(yī)大學(xué)采用5l celligen 反應(yīng)器連續(xù)灌注培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，培養(yǎng)第 9 天細(xì)胞密度達(dá)到8 × 1

16、06cells/ml 以上22。目前國內(nèi)未見有萬升級的生物反應(yīng)器用于生產(chǎn)的報道，同時我國有關(guān)商品化大規(guī)模動物細(xì)胞反應(yīng)器產(chǎn)品還處于空白，有待于進(jìn)一步改進(jìn)現(xiàn)有生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)或設(shè)計(jì)新型的生物反應(yīng)器。三、發(fā)展前景根據(jù)我國動物細(xì)胞工程制藥的現(xiàn)狀，今后應(yīng)該將重點(diǎn)放在以下方面：1.建立動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的技術(shù)平臺。該技術(shù)是轉(zhuǎn)基因工程藥物、單克隆抗體及疫苗等產(chǎn)品的關(guān)鍵技術(shù)，主要由以下幾個要素構(gòu)成： 2.高效的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。中國倉鼠卵巢細(xì)胞( c h o ) 作為宿主細(xì)胞表達(dá)的外源蛋白最接近其天然構(gòu)象，是生物制藥最為理想的表達(dá)系統(tǒng)，但也存在一些問題，如表達(dá)量低、大規(guī)模培養(yǎng)困難、生產(chǎn)成本高昂。我們應(yīng)從工程細(xì)胞

17、本身著手，對細(xì)胞本身的生理特征進(jìn)行改造，除了要求目的蛋白的表達(dá)量高外，必須適應(yīng)無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，具有即抗細(xì)胞衰老凋亡能力； 3.性能優(yōu)越的、個性化的細(xì)胞培養(yǎng)基，包括低血清培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)基； 4.先進(jìn)的生物反應(yīng)設(shè)備；5.減少污染風(fēng)險、提高產(chǎn)品質(zhì)量和安全性；6.實(shí)行“動物藥廠”計(jì)劃，盡快實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器的產(chǎn)業(yè)化；7.發(fā)展下游工程，主要是轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物及產(chǎn)品的分離純化，在提高產(chǎn)品的純度和產(chǎn)量同時，降低成本。四、結(jié)論總之，我國動物細(xì)胞工程制藥目前仍處于起步階段，與歐美國家相比還有很大差距，雖然目前可生產(chǎn)多種有重要價值的蛋白質(zhì)生物制品，如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體等，但大部分還處于實(shí)驗(yàn)

18、和臨床階段。隨著生命科學(xué)的發(fā)展和細(xì)胞工程技術(shù)研究的深入，將會有更多的細(xì)胞工程藥物出現(xiàn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。 參考文獻(xiàn)：1姜倩倩,劉京貞,蘇瑞強(qiáng).單克隆抗體藥物進(jìn)展.藥物生物技術(shù),2005,12(4):270-274.2李志勇細(xì)胞工程m.北京科學(xué)出版社,2003:3-21.3李紅艷,徐梅,向青,等.空間誘變致生長減慢 cho(dhfr 一)細(xì)胞株的特性.中國康復(fù)理論與實(shí)踐.2004,10(11):647-648.4趙瑋,戴長柏,孫茂盛.紅細(xì)胞生成素（e p o ）在中國倉鼠卵巢細(xì)胞（c h o ）中穩(wěn)定表達(dá).云南大學(xué)學(xué)報.1999,21(3):175-178.5孟宗達(dá),韓秀蘭,林惠芳,.我國研制

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