基因組提取 16S RNA PCR及連接轉(zhuǎn)化

1、一、實(shí)驗(yàn)材料菌種：某浸礦混合菌。設(shè)備：eppendorf管、移液槍、臺(tái)式高速離心機(jī)、電泳儀、水浴鍋、PCR儀、無菌操作臺(tái)、牙簽、槍頭、酒精燈。試劑：細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、LB液體培養(yǎng)基、LB固體平板培養(yǎng)基、TE緩沖液（pH 8.0）、切膠回收試劑盒、Taq DNA polymerase，10 mM dNTPmix，引物，雙蒸水，瓊脂糖、溴乙錠EB、電泳緩沖液（50×TAE電泳緩沖液：取Tris 24.2g，冰醋酸5.7ml，0.25mol/L EDTA（pH8.0） 20ml，加蒸餾水至100ml）、pGM-T 克隆試劑盒、Hind III、石蠟。二、實(shí)驗(yàn)步驟1 細(xì)菌基因組DN

2、A提取1.1 樣品收集菌種培養(yǎng)至OD600為1-1.5，此時(shí)1 mL 菌液中約含1.0×109細(xì)胞，用滅過菌的1.5mL離心管去菌液1 ml，室溫10,000 rpm離心1 min，收集菌體。1.2 基因組DNA的提取（使用前先在緩沖液GD和漂洗液PW中加入無水乙醇，加入體積參照瓶上的使用說明。）1.向菌體沉淀中加入200 l 緩沖液GA，振蕩至菌體徹底懸??；2.向管中加入20 l 蛋白酶K溶液，混勻；3.加入220 l 緩沖液GB，振蕩15秒，70放置10 min，溶液應(yīng)變清亮，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠；若溶液未變清亮，說明細(xì)胞裂解不徹底，可能導(dǎo)致提取DNA量少和提取出的DNA

3、不純；4.加入無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠；5.將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；6.向吸附柱CB3中加入500 l 緩沖液GD，12,000 rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3 放入收集管中； 7.向吸附柱CB3中加入700 l 漂洗液PW，12,000 rpm 離心30秒，倒掉廢液，吸附柱CB3放入收集管中；8.向吸附柱CB3中加入500 l 漂洗液PW，12,000 rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管

4、中；9.將吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm離心2分鐘，倒掉廢液，將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；10.將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200 l 洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5分鐘，12,000 rpm 離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。為了增加基因組DNA的得率，可將離心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室溫放置2分鐘，12,000 rpm離心2分鐘。洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50 l，體積過小影響回收效率。洗脫液的pH值對(duì)于洗脫效率有很大影響，若用水做洗脫液應(yīng)保證pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)（可以用NaOH將

5、水的pH值調(diào)到此范圍），pH值低于7.0會(huì)降低洗脫效率，且DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20，以防DNA降解。1.3 DNA檢測(cè)配置0.8%的瓊脂糖凝膠，點(diǎn)樣5l ,約80V 電泳20-30分鐘，置于凝膠成像系統(tǒng)或紫外投射檢測(cè)儀上觀察條帶。具體步驟如下：1制膠（80ml）：稱取0.64g瓊脂糖，加入80ml 的1×TAE緩沖液（pH8.0），搖勻；微波爐加熱，至瓊脂糖完全溶解（要防止過熱溢出三角瓶）；將膠板放入制膠槽中，插入適當(dāng)?shù)氖嶙樱瑢⑷芙獾沫傊牵s50）加入5.0 l EB 后，混均勻，倒入其中，直至厚度為4-6mm（如有氣泡要把氣泡趕出），在室溫下冷卻凝固（約30-45min）。將制膠

6、板置于電泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保證點(diǎn)樣孔完好。2 點(diǎn)樣：用微量移液器將5l含藍(lán)色染液的Marker加入點(diǎn)樣孔下部，樣品與Loading Buffer混勻后進(jìn)行點(diǎn)樣。3 電泳：打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至3-5V/cm(約80V)，可見到溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動(dòng)，約20-30min后即可觀察結(jié)果。4 觀察：將電泳好的膠置于紫外投射檢測(cè)儀上，打開紫外燈，可見到橙紅色核酸條帶，根據(jù)條帶粗細(xì)，可粗略估計(jì)該樣品DNA的濃度。2 16s rDNA PCR擴(kuò)增1 在冰盒上操作，按從大體積到小體積的次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌PCR管中。試劑體積/l10×PCR Buffer 2.5dNTPs1引

7、物10.5引物20.5DNA模板2Taq 酶（2U/l1dd H2O 15.5Mgcl2 22 調(diào)整好反應(yīng)程序，將上述混合液混勻，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序如下：94 5 min94 45 s32 cycles55 45 s72 90 s72 5 min反應(yīng)結(jié)束，PCR產(chǎn)物放置于4待電泳檢測(cè)或-20長(zhǎng)期保存。2.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)1 制膠（80ml）：稱取0.8g瓊脂糖，加入80ml 的1×TAE緩沖液（pH8.0），搖勻；微波爐加熱，至瓊脂糖完全溶解（要防止過熱溢出三角瓶）；將膠板放入制膠槽中，插入適當(dāng)?shù)氖嶙?，將溶解的瓊脂糖（約50）加入5.0 l EB 后，混

8、均勻，倒入其中，直至厚度為4-6mm（如有氣泡要把氣泡趕出），在室溫下冷卻凝固（約30-45min）。將制膠板置于電泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保證點(diǎn)樣孔完好。2 點(diǎn)樣：用微量移液器將5l含藍(lán)色染液的Marker加入點(diǎn)樣孔下部，樣品與Loading Buffer混勻后進(jìn)行點(diǎn)樣。3 電泳：打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至3-5V/cm(約100V)，可見到溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動(dòng)，約30-40min后即可觀察結(jié)果。4 觀察：將電泳好的膠置于紫外投射檢測(cè)儀上，打開紫外燈，可見到橙紅色核酸條帶，根據(jù)條帶粗細(xì)，可粗略估計(jì)該樣品DNA的濃度。如同時(shí)有已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA進(jìn)行電泳，則可通過線性DNA條帶的

9、相對(duì)位置初步估計(jì)樣品的分子量。3 連接及轉(zhuǎn)化由于前天未得到PCR產(chǎn)物，故采用實(shí)驗(yàn)室以前擴(kuò)增的樣品。3.1 連接1 將載體在冰上融化（盡可能避免反復(fù)凍融載體，在初次使用時(shí)最好分裝成小份，每次使用時(shí)取出一份），短暫離心裝有載體的離心管，以免液體掛在管壁上。2 按照下表內(nèi)容在無菌的離心管中加入各種成分，載體與片段的摩爾比控制在1:3-1:8，可根據(jù)DNA片段的濃度及載體與片段分子大小來計(jì)算其摩爾比。加入過多的片段反而會(huì)干擾連接反應(yīng)。使用2×Rapid Ligation Buffer連接體系中的成分反應(yīng)體系對(duì)照體系目的PCR片段3 l-對(duì)照片段（700bp，50 ng/l）-1 lpGM-T

10、 載體（約50 ng/l）1 l1 l2×T4 DNA Rapid Ligation Buffer5 l5 lT4 DNA Ligation(3U/l)1 l1 l無菌去離子水補(bǔ)足到10 l補(bǔ)足到10 l3 輕輕彈動(dòng)離心管以混合內(nèi)容物，短暫離心。將混合反應(yīng)液置于22-26反應(yīng)5-10 分鐘（反應(yīng)不要超過15min，否則會(huì)降低連接效率），反應(yīng)結(jié)束后，將離心管置于冰上。3.2 轉(zhuǎn)化1 取部分連接產(chǎn)物加到50-100 l TOP 10感受態(tài)細(xì)胞中（感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)剛從-70冰箱取出放于冰浴上，待剛剛解凍時(shí)加入連接產(chǎn)物，連接產(chǎn)物的加入量不超過感受態(tài)細(xì)胞體積的十分之一），輕彈混勻，冰浴30分鐘（必

11、要時(shí)使用超螺旋質(zhì)粒pUC 19同步轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞作為對(duì)照檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率，將1l pUC 19加入另一只感受態(tài)細(xì)胞管中，其余操作步驟與連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化步驟同步進(jìn)行）。2 將離心管置于42水浴90秒，取出管后立即置于冰浴中放置2-3分鐘，其間不要搖動(dòng)離心管。3 向離心管中加入250-500 l 37預(yù)熱的SOC或LB（不含抗生素）的培養(yǎng)基，150 rpm、37振蕩培養(yǎng)45分鐘。目的是使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達(dá)，使菌體復(fù)蘇。4 將離心管中的菌液混勻，吸取400 l加到含相應(yīng)抗生素的LB固體瓊脂平板培養(yǎng)基上，用無菌的彎頭玻棒輕輕的將細(xì)胞均勻涂開，待平板表面干燥后，倒置平板，37培養(yǎng)12-16小時(shí)。4

12、單酶切1 在一已滅菌的PCR管中依次加入下面體系（目的DNA為實(shí)驗(yàn)室先期提?。麄€(gè)操作在在冰上操作。試劑體積/l10×Buffer1目的DNA片段5Msp0.2ddH2O3.8混勻，短暫離心。2 將其放入37水浴2-3小時(shí)。3 70水浴10分鐘，終止酶切反應(yīng)。4 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析1 細(xì)菌基因組DNA提取由于時(shí)間有限，提取總DNA后，先做16s rDNA PCR，然后做瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。紫外投射檢測(cè)儀上瓊脂糖凝膠上沒有任何條帶，這表明沒有提取出來基因組。此結(jié)果說明下一步的實(shí)驗(yàn)16s rDNA PCR將會(huì)失敗。因此，我們以示意圖1-1表示基因組DNA的凝

13、膠電泳圖。圖1-1 基因組DNA凝膠電泳示意圖經(jīng)查閱資料及討論分析，該實(shí)驗(yàn)的失敗應(yīng)該與實(shí)驗(yàn)操作有關(guān)，現(xiàn)將有關(guān)注意事項(xiàng)列出：1.無菌操作應(yīng)加強(qiáng)，所有器皿、槍頭等都要經(jīng)過滅菌，整個(gè)操作流程要帶一次性手套，否則提出的DNA會(huì)被污染。2.盡量使用新鮮的菌體，大腸桿菌培養(yǎng)時(shí)間不宜過長(zhǎng)，一般在12-16h之間，保證提取的基因組DNA不被降解。3.操作過程中某些環(huán)節(jié)力度應(yīng)適當(dāng)，如.加入GA之后一定要?jiǎng)×业卣袷?，使?xì)胞壁徹底被破壞。但是后續(xù)過程中動(dòng)作過大會(huì)造成DNA片段斷裂成小片段。4.加入無水乙醇后，可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，應(yīng)將離心管內(nèi)的溶液及絮狀沉淀轉(zhuǎn)移到純化柱中，確?；蚪MDNA的得率。5.徹底晾干DNA，

14、防止漂洗液中的乙醇?xì)埩魰?huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)。2 16s rDNA PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)PCR正如之前所料，沒有擴(kuò)增出產(chǎn)物，紫外投射儀下沒有任何條帶。這里用示意圖1-2表示PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖。圖1-2：16s rDNA PCR擴(kuò)增凝膠電泳示意圖經(jīng)查閱資料及討論分析，總結(jié)16s rDNA PCR擴(kuò)增應(yīng)該注意的相關(guān)事項(xiàng)：1.操作流程要在超凈工作臺(tái)下操作，加樣量要足，不能有污染；2.配體體系所用的酶、dNTP、引物不能在常溫下放置過久，否則可能導(dǎo)致降解；3.體系中不能含有抑制酶作用的物質(zhì)，否則導(dǎo)致擴(kuò)增不出產(chǎn)物。4.體系中的循環(huán)溫度應(yīng)該設(shè)置合理，確保每個(gè)過程都能完好的完成。3 連接、轉(zhuǎn)化平板上有藍(lán)白斑出現(xiàn)，但數(shù)量不多，原因可能是稀釋的倍數(shù)過多，轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞濃度不夠大。圖1-3為連接轉(zhuǎn)化后的藍(lán)白斑篩選平板。（手機(jī)像素不高，不是特別清晰。）圖1-3 藍(lán)白斑篩選平板圖（紅色箭頭顯示藍(lán)斑，黑色箭頭顯示白斑）總結(jié)在做細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：1所有操作均應(yīng)在無菌條件和冰上進(jìn)行。2所使用的器皿必須徹底滅菌，痕量的去污劑或其它化學(xué)物質(zhì)的存在可能大大降低細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率。3用于轉(zhuǎn)化的應(yīng)