電化學(xué)發(fā)光測(cè)定原理

1、-作者xxxx-日期xxxx電化學(xué)發(fā)光測(cè)定原理【精品文檔】 電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定 電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)：電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL)是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，實(shí)際上包括了電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個(gè)過程?；瘜W(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)32+(圖1）和電子供體三丙胺（TPA）在陽電極表面同時(shí)各失去一個(gè)電子發(fā)生氧化反應(yīng)（圖2）。二價(jià)的Ru(bpy)32+被氧化成三價(jià)，后者是一種強(qiáng)氧化劑。TPA被氧化成陽離子自由基TPA+*（參見圖2），后者很不穩(wěn)定，自發(fā)地失去一個(gè)質(zhì)子（H+），形成自由基TPA*，這是一種非常強(qiáng)的還原劑。這兩個(gè)

2、高反應(yīng)基團(tuán)在電極表面迅速反應(yīng)，三價(jià)的Ru(bpy)33+被還原形成激發(fā)態(tài)的二價(jià)Ru(bpy)32+*，能量來源于Ru(bpy)33+和TPA*之間存在的高電化學(xué)電位差。TPA*自身被氧化成二丙胺和丙醛。接著激發(fā)態(tài)的 Ru(bpy)32+*衰減成基態(tài)的Ru(bpy)32+，同時(shí)發(fā)射一個(gè)波長620nm的光子。這一過程在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行，產(chǎn)生許多光子，使光信號(hào)得以增強(qiáng)。 圖1 三聯(lián)吡啶釕NHS Ru2* -H+ 光子 TPA* Ru3+ Ru2 TPA+* TPA -e -e 圖2 在電極表面的ECL反應(yīng) Ru2: Ru(bpy)3 2+ 基態(tài) Ru3: Ru(bpy)33+ 氧化態(tài) Ru2*

3、: Ru(bpy)32+* 激發(fā)態(tài) 二、電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定 以三聯(lián)吡啶釕作為標(biāo)記物，標(biāo)記抗原或抗體，通過免疫反應(yīng)及ECL反應(yīng)，即可進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定（ECLIA）。在實(shí)際應(yīng)用中則尚有特定的儀器和試劑。瑞士羅氏公司（ROCHE）的Elecsys ECLIA系統(tǒng)，綜合了各種先進(jìn)技術(shù)，具有獨(dú)特的優(yōu)越性，已在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中取得廣泛應(yīng)用。 Elecsys全自動(dòng)分析儀分成兩個(gè)部分：在試管內(nèi)化學(xué)反應(yīng)部分和在流動(dòng)池內(nèi)的ECL反應(yīng)部分。 （一）試管內(nèi)的化學(xué)反應(yīng) 1、試劑的組成 在Elecsys試劑的制備中，包括電化學(xué)發(fā)光劑的標(biāo)記和抗原或抗體的固相化，應(yīng)用了多種先進(jìn)技術(shù)，簡(jiǎn)述如下： （1）電化學(xué)發(fā)光劑的標(biāo)記 Ru

4、(bpy)32+需經(jīng)化學(xué)修飾形成活化的衍生物后才能與抗體或抗原形成結(jié)合物。有多種活性基團(tuán)可與Ru(bpy)32+分子中的砒啶基反應(yīng)。在Elecsys試劑中采用的是N羥基琥珀酰胺酯（NHS）（圖1）。該衍生物具有水溶性，可與抗體、蛋白質(zhì)抗原、半抗原、激素、核酸等各種分子結(jié)合形成穩(wěn)定的標(biāo)記物。而且Ru(bpy)32NHS分子量很小，與免疫球蛋白結(jié)合的分子比超過20仍不會(huì)影響抗體的可溶性和免疫活性。 （2）固相載體 mm的聚苯乙烯微粒。其特點(diǎn)是表面積極大，吸附效率高；在液體中形成均勻的懸液，參與反應(yīng)時(shí)類似液相，反應(yīng)速度快。由于帶有磁性，在游離標(biāo)記物與結(jié)合標(biāo)記物分離時(shí)，只需用磁鐵吸引，方便迅速。 （3

5、）鏈霉親和素與生物素系統(tǒng)的應(yīng)用 鏈霉親和素（streptoavidin，SA）和生物素（biotin，B）是具有很強(qiáng)的非共價(jià)相互作用的一對(duì)化合物。一分子SA可與4分子B相結(jié)合。在Elecsys的試劑中，SA通過特殊的蛋白結(jié)合物均勻牢固地包被在磁性微粒上，形成通用的能與B結(jié)合的固相載體。另一試劑為與經(jīng)活化的B衍生物化合的抗原或抗體。兩種試劑混合時(shí)，B化合的抗原或抗體即結(jié)合在磁性微粒上。 2、在試管中的反應(yīng) 反應(yīng)分兩個(gè)步驟。以雙抗體夾心法測(cè)抗原為例，試劑含以下組分： a、Ru(bpy)32+標(biāo)記的抗體 b、生物素化合的抗體 c、SA磁性微粒 d、TPA溶液 e、洗滌液 （1）步驟一 在試管中加試劑

6、a、b及待測(cè)標(biāo)本（含抗原），反應(yīng)式如下（圖3）。反應(yīng)在液相中進(jìn)行，37oC下510分鐘內(nèi)完成。 （2）步驟二：在上述反應(yīng)液中加入試劑c，反應(yīng)式如下（圖4）。 反應(yīng)在接近液相的條件中進(jìn)行，37OC下510分鐘內(nèi)完成。下一個(gè)步驟為結(jié)合的標(biāo)記抗體與游離的標(biāo)記抗體相分離，此步驟及以下的電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，在Elecsys的流動(dòng)池中進(jìn)行。 （二）流動(dòng)池中的電化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 1、流動(dòng)池的基本結(jié)構(gòu) 流動(dòng)池是電化學(xué)發(fā)光過程中所有電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)進(jìn)行的場(chǎng)所（圖5）。反應(yīng)液由蠕動(dòng)泵運(yùn)送入流動(dòng)池，反應(yīng)后由流動(dòng)池流出。一個(gè)激發(fā)電極在流動(dòng)池的下方，兩個(gè)測(cè)定電極安裝在激發(fā)電極上方的兩側(cè)，留出一個(gè)清晰的窗口以便使發(fā)射的光子被光電倍

7、增管收集。在流動(dòng)池下裝置可移動(dòng)的用以吸引磁性微粒的磁鐵。 2、電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的步驟 （1）將試管內(nèi)兩步反應(yīng)結(jié)束的反應(yīng)液輸入流動(dòng)池，由于磁鐵吸引，磁性微粒被吸著在電極上，其余反應(yīng)物流出流動(dòng)池，完成游離的和結(jié)合的標(biāo)記抗體的分離。 （2）將TPA溶液送入流動(dòng)池,將殘余的游離標(biāo)記抗體排出流動(dòng)池,在流動(dòng)池中充滿TPA溶液。 （3）撤下磁鐵，電極上通電，三聯(lián)吡啶釕與TPA發(fā)生電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，發(fā)出的光被光電倍增管收集，測(cè)定光強(qiáng)度。 （4）通過換算得出待測(cè)標(biāo)本中的抗原濃度。 （5）在流動(dòng)池中送入清洗液，將反應(yīng)物徹底沖洗，即可測(cè)定下一個(gè)標(biāo)本。一、 主要技術(shù)特點(diǎn)1、 電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)原理 化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕Ru(

8、bpy)32+和電子供體（TPA）在陽極表面可同時(shí)失去一個(gè)電子而發(fā)生氧化反應(yīng)。二價(jià)的Ru(bpy)32+被氧化成三價(jià)，這是一種很強(qiáng)的氧化劑。TPA失去電子后被氧化成陽離子自由基TPA+*，它很不穩(wěn)定，可自發(fā)地失去一個(gè)質(zhì)子（H+），形成自由基TPA*，這是一種很強(qiáng)的還原劑，可將一個(gè)電子遞給三價(jià)的Ru(bpy)33+使其形成激發(fā)態(tài)的Ru(bpy)32+*。激發(fā)態(tài)的三聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)32+*不穩(wěn)定，很快發(fā)射出一個(gè)波長620nm的光子，回復(fù)成基態(tài)的三聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)32+。這一過程可以在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行，產(chǎn)生許多光子，使光信號(hào)增強(qiáng)。2、 電化學(xué)發(fā)光的標(biāo)記物 電化學(xué)發(fā)光的標(biāo)記物-三聯(lián)吡

9、啶釕的分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，分子量小，可以標(biāo)記于任何抗原、抗體及核酸，在一個(gè)抗體等分子上可同時(shí)標(biāo)記>20個(gè)標(biāo)記物分子，不影響抗體的活性，用于核酸標(biāo)記亦不影響探針雜交活性。三聯(lián)吡啶釕是水溶性，高穩(wěn)定的小分子，它可以確保電化學(xué)發(fā)光的高效性和穩(wěn)定性，并無噪音干擾。3、 專利的包被技術(shù)羅氏公司應(yīng)用了專利的鏈霉親和素-生物素包被技術(shù)。鏈霉親和素-生物素是最牢固特異的結(jié)合，因此可以達(dá)到牢固和均一的包被效果。一個(gè)鏈霉素親和素可以和四個(gè)生物素結(jié)合，因此可以成倍增加生物素化抗體（抗原）的包被量，具有信號(hào)放大的作用，提高了檢測(cè)靈敏度。4、 獨(dú)特的載體由聚苯乙烯包被的直徑為2.8微米的磁性微球作為載體，大而均一的表面

10、積能包被最大量的鏈霉親和素，載體懸浮在反應(yīng)體系中，使異相反應(yīng)類似均相反應(yīng)，大大加快反應(yīng)速度。5、 磁性分離技術(shù) 使用磁鐵將結(jié)合標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物的磁性微粒（結(jié)合相）吸附于電極上，而游離相則由緩沖液沖走，電極表面的電化學(xué)發(fā)光的信號(hào)檢測(cè)完成后，磁鐵移走并使用系統(tǒng)清洗液沖走電極表面的結(jié)合標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物的磁性微粒（結(jié)合相），為下一次測(cè)定做準(zhǔn)備，由于測(cè)量池清洗徹底，避免了交叉污染，實(shí)現(xiàn)了結(jié)合相和游離相的全自動(dòng)化分離。6、 超越7個(gè)數(shù)量級(jí)的測(cè)定線性 發(fā)光信號(hào)檢測(cè)的寬線性加上電化學(xué)發(fā)光獨(dú)特的標(biāo)記物本身（發(fā)光底物）循環(huán)發(fā)光和專利的鏈霉親和素-生物素包被技術(shù)的信號(hào)放大做用使電化學(xué)發(fā)光測(cè)定的線性范圍最大超越7個(gè)數(shù)量級(jí)。7、 電化學(xué)發(fā)