分子生物學(xué)電子教案第二章

1、第二章 核酸的結(jié)構(gòu)和功能 1、主要內(nèi)容 v     細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì) v     核酸的化學(xué)組成與共價(jià)結(jié)構(gòu) v     DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu) v     DNA分子的高級(jí)結(jié)構(gòu) v     真核生物的染色體及其組裝 v     RNA的結(jié)構(gòu)與功能 v     核酸的變性、復(fù)性與分子雜交 2、教學(xué)要求 v 

2、    掌握遺傳物質(zhì)的只要特點(diǎn)和種類； v     掌握DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，核酸的變性、復(fù)性和分子雜交原理； v     熟悉核酸的物理化學(xué)性質(zhì) v     熟悉DNA 多種高級(jí)結(jié)構(gòu)  第一節(jié) 細(xì)胞的遺傳物質(zhì)  一、DNA攜帶兩類不同的遺傳信息 1.遺傳物質(zhì)必須具有的特性 a.貯存并表達(dá)遺傳信息 b.能把信息傳遞給子代 c.物理和化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定 d.具有遺傳變化的能力 l    

3、0;  DNA的特征 a) 各異的堿基序列儲(chǔ)存大量的遺傳信息 b)堿基互補(bǔ)是其復(fù)制、轉(zhuǎn)錄表達(dá)遺傳信息的基礎(chǔ) c)  生理狀態(tài)下物理、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定 d)有突變和修復(fù)能力，可穩(wěn)定遺傳是生物進(jìn)化的基礎(chǔ)  ！遺傳物質(zhì)核酸是如何被證明的？  2、DNA攜帶兩種遺傳信息 a、編碼蛋白質(zhì)和RNA的信息(編碼tRNA、rRNA)：64個(gè)三聯(lián)體密碼子：3個(gè)終止密碼子，編碼氨基酸的61個(gè)密碼子具有簡并性、通用性 b、編碼基因選擇性表達(dá)的信息 ¨原核生物的結(jié)構(gòu)基因占Genome的比例很大，x174phage 5386bp，結(jié)構(gòu)基因用去5169bp比例達(dá)96

4、。 ¨真核生物的結(jié)構(gòu)基因占Genome的比例很小，哺乳動(dòng)物中結(jié)構(gòu)基因只占1015 。 ¨其余80以上的DNA起什么作用目前還無法精確解釋，但可以肯定其中大部分DNA序列是編碼基因選擇性表達(dá)的遺傳信息。 ¨表現(xiàn)在：細(xì)胞周期的不同時(shí)相中 個(gè)體發(fā)育不同階段 不同的器官和組織 不同的外界環(huán)境下各種基因的表達(dá)與否以及量的差異 ¨所以又稱調(diào)控序列  二、RNA也可作為遺傳物質(zhì) n   RNA病毒：傳染媒介是病毒顆粒（病毒基因組RNA、蛋白質(zhì)外殼） n   Tobacco Mosaic Virus (TMV)

5、 n   類病毒（viroid）: 使高等植物產(chǎn)生疾病的傳染性因子，只由RNA組成。  三、是否存在核酸以外的遺傳物質(zhì) n   Prion (proteinaccous infections particle) 引起的風(fēng)波 n   朊病毒蛋白質(zhì)樣的感染因子 1)     羊搔癢病 (scripie) 2)     人類庫魯（ kuru） 病  3)     牛海綿狀腦

6、炎(瘋牛病) n   均由傳染性病原蛋白顆粒引起，統(tǒng)稱Prion (朊病毒) 資料：1982年，美國加利福尼亞大學(xué)教授斯坦利?普利西納提出雅克氏病的病原體是一種“蛋白質(zhì)性質(zhì)的感染顆?！保⒂胮rion（普利昂）一詞表示這種因子，國內(nèi)曾譯為朊病毒或鋸蛋白。但這種蛋白質(zhì)粒子缺乏核酸，稱為病毒并不妥當(dāng)，故現(xiàn)在稱為朊毒體。 瘋羊病、瘋牛病及人類所患的新型雅克氏癥等海綿狀腦病，都是由朊毒體發(fā)生變異引起的。包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物體內(nèi)都存在朊毒體，它在正常形態(tài)下呈折疊狀，但變異時(shí)會(huì)張開如同鋸齒狀，在大腦中撐出大量的小洞，引起人或動(dòng)物患上癡呆型的傳染性海綿狀腦病。 朊毒體的致病過程是：首先經(jīng)

7、一定傳播途徑（如進(jìn)食患病動(dòng)物的肉和內(nèi)臟）侵入機(jī)體并進(jìn)入腦組織，其后沉積于不同的神經(jīng)元溶酶體內(nèi)，導(dǎo)致被感染的腦細(xì)胞受損、壞死，釋出的朊毒體又侵犯其它腦細(xì)胞，使病變不斷發(fā)展；病變的神經(jīng)細(xì)胞死亡后，腦組織中留下大量小孔呈海綿狀，并出現(xiàn)相應(yīng)的臨床癥狀，這就是眾所周知的海綿狀腦病。 普利西納學(xué)說公布之初，在學(xué)術(shù)界曾遭到猛烈反對(duì)，多數(shù)人持否定態(tài)度。因?yàn)榉肿由飳W(xué)的中心命題是“生物的遺傳基因以核糖核酸和脫氧核糖核酸為本體”，在此之前，人們普遍認(rèn)為，不存在沒有核酸的病原體，這已成為常識(shí)，但普利西納的學(xué)說卻與這種認(rèn)識(shí)背道而馳。經(jīng)過10多年的研究和爭(zhēng)論，大量事實(shí)確證了朊毒體的存在，普利西納的學(xué)說最終得到了認(rèn)可。鑒

8、于這一發(fā)現(xiàn)的重大科學(xué)價(jià)值，普利西納榮獲1997年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。  第二節(jié) 核酸的化學(xué)組成  一、含氮堿基、核苷、核苷酸 l  DNA is a nucleotide polymer with covalent bonds between the sugar and Phosphate groups. l  A long molecular chain containing a sugar, a phosphate and one of four different nucleotide bases. l  Chemical Compo

9、sition（化學(xué)組成）: Sugar(糖): Deoxyribose (ribose核糖in RNA) Phosphate(磷酸): - phosphodiester Bases(堿基): (G) guanine (C) cytosine (A) adenine (T) thymine ！稀有堿基：假尿苷（）、二氫尿嘧啶（DHU）、2-O-甲基腺苷、N6，N6-二甲基腺苷。  名稱與縮寫(1) ¡   RNA：ribonucleic acid 核糖核酸 ¡   DNA：deoxyribonucleic acid 脫氧核糖核

10、酸 ¡     pyrimidine： cytosine (Cyt) 胞嘧啶 嘧啶 thymine (Thy) 胸腺嘧啶 uracil (Ura) 尿嘧啶 ¡     purine： adenine (Ade) 腺嘌呤 嘌呤 guanine (Gua) 鳥嘌呤  名稱與縮寫(2) ¡     ribonucleoside 核糖核苷 （不帶磷酸） adenosine (Ado) 腺(嘌呤核)苷 guanosine (Guo) 鳥

11、(嘌呤核)苷 cytidine (Cyd) 胞(嘧啶核)苷 thymidine (Thd) 胸(腺嘧啶脫氧核)苷 uridine (Urd) 尿(嘧啶核)苷 ¡     ribonucleotide 核糖核苷酸 （帶磷酸） adenosine 5- mono (di, tri) phosphaste； AMP, ADP, ATP ¡     deoxyribonucleoside 脫氧核糖核苷 deoxyadenosine (dAdo) ¡   

12、  deoxyribonucleotide 脫氧核糖核苷酸 dAMP, dADP, dATPdNTP  二、DNA分子的一級(jí)結(jié)構(gòu) 1. 多聚核苷酸鏈主鏈?zhǔn)呛颂呛土姿幔瑐?cè)鏈為堿基，由3,5磷酸二酯鍵連接 2. 鏈的方向：同一個(gè)磷酸基的5酯鍵到3酯鍵的方向(53) 3、DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn) a. 脫氧核糖是其顯著特點(diǎn)DNA極其穩(wěn)定的根本原因 b、磷酸呈四面體構(gòu)型，脫氧核糖呈折疊的五元環(huán)，堿基是平面的 c、主鏈?zhǔn)怯H水的，側(cè)鏈（堿基）是疏水的 n   主鏈的脫氧核糖的羥基能與水形成氫鍵，而磷酸基團(tuán)在生理?xiàng)l件下離解為負(fù)離子, 這些特點(diǎn)保證了多核苷酸鏈可形成穩(wěn)定的構(gòu)

13、象。 4、一級(jí)結(jié)構(gòu)的概念 n   指DNA分子中的核苷酸排列順序 n   不同生物借此貯存遺傳信息 n   決定DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)  第三節(jié) 核酸二級(jí)結(jié)構(gòu) 一、DNA雙螺旋模型的提出 依據(jù) n    a.1938. W. T. Astbury 首次用X射線分析DNA n    b.1950 Chargaff A + G / T + C = 1 A+T G + C n    c.1952 Alexander Todd 發(fā)現(xiàn)了核苷酸

14、和核苷酸之間由磷酸二酯鍵聯(lián)接 n    d.1952 M.H.F.Wilkins & Rosalind Franklin 得到了高度定向的DNA纖維的X-射線照片 發(fā)現(xiàn)原子長軸存在0.34和3.4nm兩種周期性 n    此外，之前的密度測(cè)定表明螺旋由兩條多核苷酸鏈組成，且直徑恒定（2nm)。 Watson-Crick的DNA雙螺旋 n    兩條相互獨(dú)立的單鏈DNA分子以螺旋方式相互纏繞，形成右手雙螺旋； n    帶有負(fù)電的戊糖-磷酸骨架在分子的外側(cè)； n

15、0;   堿基則平面堆積于螺旋的內(nèi)部； n    由于骨架雙鏈在螺旋軸上的間距不相等，從而在分子表面形成大溝和小溝。大溝和小溝。雙螺旋表面的溝對(duì)DNA和蛋白質(zhì)的相互識(shí)別是很重要的，因?yàn)樵跍蟽?nèi)才能覺察到堿基的順序，而在雙螺旋的表面，是脫氧核糖和磷酸重復(fù)結(jié)構(gòu)，沒有信息可言。（蛋白質(zhì) 核酸，核酸 核酸、鋅指結(jié)構(gòu)） n      雙螺旋模型參數(shù) n   直徑20Å n   螺距為34Å (任一條鏈繞軸一周所升降的距離) n  

16、; 每圈有10個(gè)核苷酸(堿基) n   兩個(gè)堿基之間的垂直距離是3.4Å。螺旋轉(zhuǎn)角是36度。 n   有大溝和小溝，配對(duì)堿基并不充滿雙螺旋空間，且堿基對(duì)占據(jù)的空間不對(duì)稱。  二、影響雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的因素 氫鍵 范德華力（Van de waals force） 疏水作用力 (Hydrophobic interaction) * 不穩(wěn)定因素 n   磷酸基團(tuán)間的靜電斥力  n   堿基內(nèi)能增加(溫度), 使氫鍵因堿基排列有序狀態(tài)的破壞而減弱   三、雙螺旋結(jié)構(gòu)多樣性

17、B-DNA：資料來自相對(duì)濕度為92所得到的DNA鈉鹽纖維。 此外人們還發(fā)現(xiàn)了A、C、D、E等右手雙螺旋和左手雙螺旋Z構(gòu)象等形式。 DNA結(jié)構(gòu)的多態(tài)性：幾種不同的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)以及同一種雙螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)參數(shù)存在差異的現(xiàn)象。  原因：多核苷酸鏈的骨架含有許多可轉(zhuǎn)動(dòng)的單鍵，磷酸二酯鍵的兩個(gè)P-O鍵、糖苷鍵、戊糖環(huán)各個(gè)鍵。  第四節(jié) DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu) 1、反向重復(fù)序列與二級(jí)結(jié)構(gòu) n   反向重復(fù)序列（inverted repeatitive sequence or inverted repeats, IR）,又稱回文序列（廻文）：指兩段同樣的核苷酸序列同時(shí)存在于一

18、個(gè)分子中，但具有相反的方向。有時(shí)也有不完全相同的情況。 ¨RNA和DNA中都可能存在 n   此外還可有directed repeatitive sequence -正向重復(fù)序列 n   較短的回文序列可能是作為一種信號(hào) n   如：限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn) n   一些調(diào)控蛋白的識(shí)別位點(diǎn) n 例如限制性內(nèi)切酶 EcoR的識(shí)別位點(diǎn) 5GAATTC3 3CTTAAG5  2. DNA (Trible Helix DNA, T.S DNA) 的三股螺旋結(jié)構(gòu) （1）發(fā)現(xiàn)和證

19、實(shí) 1953年，Watson & Crick D.S DNA model證明沿大溝存在多余的氫鍵給體與受體  潛在的專一與DNA (蛋白質(zhì)) 結(jié)合的能力   形成T.S DNA 可能性 1957 年Felsenfeld等發(fā)現(xiàn)一股為嘌呤，另一股為嘧啶的核苷酸雙鏈能夠形成三鏈 如： polyA/polyU polydA/polydT polyd (AG)/polyd(CT) 三螺旋DNA的概念提出 1987年Mirkin . S . M證明plasmid DNA在 pH= 4.3的溶液中, 有T.S DNA的存在， 這些發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了三螺旋DNA的研究 （2）組成

20、形式 a、D.S. DNA + D.S.DNAT.S. DNA + S.S. DNA b、 分子組成  PY/PU + PU (偏堿性介質(zhì)中穩(wěn)定) GG 、 AA 、GC PY/PU + PY (偏酸性介質(zhì)中穩(wěn)定) 常見類型 GC AT  3、四股螺旋DNA ( tetraplex DNA, Tetrable Helix DNA 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：基本結(jié)構(gòu)單元鳥嘌呤四聯(lián)體 可能的功能： A、 穩(wěn)定真核生物染色體結(jié)構(gòu) B、 保證DNA末端準(zhǔn)確復(fù)制 C、 與DNA分子的組裝有關(guān) D、 與染色體的 meiosis & mitosis 有關(guān) 4、DNA

21、的超螺旋結(jié)構(gòu) 超螺旋(superhelix OR supercoil)的形成和類型 l形成 松馳態(tài)DNA （relax form） 低能量 常態(tài) 超螺旋（Supercoied） DNA 正超螺旋 負(fù)超螺旋 DNA的超螺旋結(jié)構(gòu) 正超螺旋（positive supercoiled ） 緊纏overwinding (右旋)  負(fù)超螺旋（Negative Supercoiled ） 松纏unwinding (左旋)  原核生物DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)： n   絕大多數(shù)原核生物的DNA都是共價(jià)封閉的環(huán)狀雙螺旋。如果再進(jìn)一步盤繞則形成麻花狀的超螺旋三級(jí)結(jié)構(gòu)。&#

22、160; 超螺旋的定量描述 n   White方程： L=T+W n   連接數(shù)L（Linking nnmber）：指cccDNA中一條鏈繞另一條鏈的總次數(shù)。其特點(diǎn)是 (1) L是整數(shù)； (2) 在cccDNA的任何拓?fù)鋵W(xué)狀態(tài)中其值保持不變； (3) 右手螺旋對(duì)L取正值。  n   T（Twisting number）：盤繞數(shù)，即DNA分子中Watson-Crick螺旋數(shù)，初級(jí)螺旋圈數(shù)。其特點(diǎn)是： (1) 可以是非整數(shù)； (2) 是變量； (3) 右手螺旋時(shí)T為正值。 n   W（Writhing num

23、ber）：超盤繞數(shù)，即超螺旋數(shù)，直觀上為雙螺旋在空間的轉(zhuǎn)動(dòng)數(shù)。其特點(diǎn)是： (1)可以是非整數(shù)； (2)是變量； l       (3)右手螺旋時(shí)，W取負(fù)值。 l       拓?fù)洚悩?gòu)酶解超螺旋的特點(diǎn)。  第五節(jié) 真核生物的染色體及其組裝  一、真核細(xì)胞染色體組成 1、組成：DNA和蛋白質(zhì),以及少量的 RNA. 2、染色體體和染色質(zhì)的概念 v    染色質(zhì)(chromatin)：是指細(xì)胞周期間期細(xì)胞核內(nèi)由DNA、組蛋白、非組蛋白

24、和少量RNA組成的復(fù)合結(jié)構(gòu)，因其易被堿性染料染色而得名。 v    染色體(chromosome)：是指在細(xì)胞分裂期出現(xiàn)的一種能被堿性染料強(qiáng)烈染色，并具有一定形態(tài)、結(jié)構(gòu)特征的物體。 攜帶很多基因的分離單位。只有在細(xì)胞分裂中才可見的形態(tài)單位。 ！分類： v    常染色質(zhì)(euchromatin) （間期纖絲的包裝密度度比分裂期染色體的要小很多） v    異染色質(zhì)(heterochromatin) （間期纖絲染色質(zhì)區(qū)的包裝密度十分致密，可與有絲分裂期染色體相比） 組成型異染色質(zhì) (constit

25、utive heterochromatin) 兼性異染色質(zhì) (facultative heterochromatin) 3、染色體中的蛋白質(zhì) 組蛋白分為H1、H2A、H2B、H3和H4。 其特性： v    進(jìn)化上的極端保守性 不同種生物組蛋白的氨基酸組成是十分相似的，特別是H3和H4。 v    無組織特異性 到目前為止，僅發(fā)現(xiàn)鳥類、魚類及兩棲類紅細(xì)胞不含H1而帶有H5，精細(xì)胞染色體的組蛋白是魚精蛋白兩個(gè)例外。 v    肽鏈上氨基酸分布不對(duì)稱性 堿性氨基酸集中分布在N端的半條鏈上。 v &#

26、160;  組蛋白的修飾作用 包括甲基化、乙?；⒘姿峄癆DP核糖基化等。 v    富含賴氨酸的組蛋白H5 非組蛋白： (1)HMG 蛋白（high mobility group protein）, 這類蛋白可能與DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān)。 (2)DNA結(jié)合蛋白 可能是一些與DNA復(fù)制或轉(zhuǎn)錄有關(guān)的酶或調(diào)節(jié)物質(zhì)。 (3)A24非組蛋白 位于核小體內(nèi)功能不詳。 4、核小體的形成 八聚體在中間，DNA盤繞在外而H1則在核小體的外面，每個(gè)核小體只有一個(gè)H1。所以核小體中組蛋白和DNA的比例是每200bpDNA有H2A，H2B，H3，H4各兩個(gè)，H1各一個(gè)。 5

27、、染色體的高級(jí)包裝 v    核小體的形成是染色體壓縮的第一階段，約1/7； v    螺旋管的每個(gè)螺旋包含6個(gè)核小體，壓縮比為6； v    中期的染色質(zhì)是一個(gè)細(xì)長中空的圓筒，為400nm, 由30nm螺旋管纏繞而成，壓縮比為40; v    這個(gè)超螺旋圓筒進(jìn)一步壓縮1/5便成為染色單體，總壓縮比是7x6x40x5 ，將近10000倍。  第六節(jié) RNA的結(jié)構(gòu)與功能 一、RNA 的功能： l     信息分子 遺傳信息由DN

28、A到蛋白質(zhì)的中間體 的核心作用。 l     功能分子 1.   作為細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)生物合成的主要參與者，參與在蛋白質(zhì)合成中核蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)組成和功能發(fā)揮； 2.   具有生物催化的功能，作用于初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的剪接加工； 3.   與生物機(jī)體的生長發(fā)育密切相關(guān)，參與基因的表達(dá)調(diào)控； 4.   與生物體的進(jìn)化有很大的關(guān)系。 5.   核糖體 6.   信息體 7.   拼接體 8.   編輯體 二、R

29、NA的分類 v    mRNA的結(jié)構(gòu) v    tRNA的結(jié)構(gòu) v    rRNA的結(jié)構(gòu) v    snRNA v    snoRNA v    非編碼mRNA ！每種RNA的基本結(jié)構(gòu)和功能！ 第七節(jié) 核酸的物理化學(xué)性質(zhì) DNA雙股鏈的互補(bǔ)是其結(jié)構(gòu)和功能上的一個(gè)基本特征， 也是DNA研究中一些實(shí)驗(yàn)技術(shù)的基礎(chǔ)。 一、DNA分子的變性 1、條件：加熱，極端pH，有機(jī)溶劑（ 尿素、 

30、酰胺 )，低鹽濃度等  2、變性過程的表現(xiàn) ¤ 是一個(gè)爆發(fā)式的協(xié)同過程，變性作用發(fā)生在一個(gè)很窄的溫度范圍 ¤ 導(dǎo)致一些理化性質(zhì)發(fā)生劇烈變化 3、熔解曲線與Tm值 緩慢而均勻地增加DNA 溶液的溫度（現(xiàn)可做到 0.1 分）可根據(jù)各點(diǎn)的A260值繪制成DNA的熔解曲線 。 Tm= of Ct = C0/2 = OD增加值的中點(diǎn)溫度(一般為85-95) 或DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時(shí)的溫度 這也是一般PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)中把變性溫度定為94 的原因。 4、影響 Tm值的因素  （1） 在 A, T,

31、 C, G 隨機(jī)分布的情況下 ，決定于GC含量  n GC%愈高 Tm值愈大  n GC%愈低 Tm 值愈小  （2）GC%含量相同的情況下 AT形成變性核心，變性加快，Tm 值小。 堿基排列對(duì)Tm值具有明顯影響 生物體內(nèi)僅UAA為最有效的終止密碼子 n   因?yàn)椋篣AA、AUU的Tm值是最低的一個(gè)，即使生理溫度下也不穩(wěn)定。  二、DNA分子的復(fù)性 （anneal or renaturation） n   概念：變性DNA在適當(dāng)條件下，兩條彼此分開的鏈又可以 重新地合成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程（退火）。 根據(jù)復(fù)性動(dòng)力學(xué)