真核細(xì)胞rna的分離和鑒定+++

1、真核細(xì)胞rna的分離和鑒定實(shí)驗(yàn)六實(shí)驗(yàn)六 1. 了解細(xì)胞核分離純化的基本原理和方法2. 掌握DNA、RNA定量測(cè)定的原理及方法3. 掌握離心機(jī)的使用一、細(xì)胞核的分離與純化（上午）二、RNA的定量測(cè)定三、DNA的定量測(cè)定 （下午）一、細(xì)胞核的分離與純化 DNA、RNA在細(xì)胞中的分布：DNA胞核內(nèi)(98%)胞質(zhì)內(nèi)(2%)RNA胞核內(nèi)(10%)胞質(zhì)內(nèi)(90%) 核酸的種類：DNA、RNA結(jié)論：DNA主要存在于細(xì)胞核， RNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)。二、核酸的種類及其分布核 酸 核苷酸 磷 酸 堿 基 戊 糖 定糖法（戊糖的差異）三、核酸的鑒定濃HClHCCHCOCHOHC 3H2OHCCHCOCHOHC+O

2、HCH3HO D核糖 糠醛 糠醛 3，5二羥基甲苯 綠色化合物 RNA水解 D核糖 + Pi + A.G.C.UHCCHCOHCCH3OOHCCH3地衣酚法: CHOCCH2OHOHHC OHHC OHH（1）核糖核酸RNA的測(cè)定 DNA水解 D脫氧核糖 + Pi + A.G.C.UCH2CHOHCHOHCH2OHCHO-H2O硫酸 CH2CH2CCH2OHCHOONH脫氧核糖 羥基酮基戊醛藍(lán)色化合物二苯胺法: （2）脫氧核糖核酸DNA的測(cè)定1、0.25mol/L蔗糖檸檬酸（含3.3 mmol/L CaCl2）稱取蔗糖86g及CaCl2363mg，用1.5擰檬酸液溶解并稀釋至1000ml。 2

3、、0.88mol/L蔗糖檸檬酸液（含3.3mmol/LCaCl2）稱取蔗糖301g及CaCl2363mg，用1.5檸檬酸液溶解并稀釋至1000ml。 3、核洗液：即0.05mol/L，TrisHCl（pH7.5）0.15mol/L NaCl液。 在0.2mol/L TrisHCl pH7.5緩沖液250ml中加NaCl8.7g再用蒸餾水稀釋至1000ml。 4、 1.5擰檬酸 5、0.9NaCl 6、0.02N NaOH 7、離心機(jī) 8、水浴箱 9、常規(guī)玻璃儀器試劑與器材試劑與器材 用頸椎脫臼法殺死小白鼠后，迅速剖開腹部取出肝臟，除去結(jié)締組織，盡快置于盛有0.9%NaCl的小燒杯中，反復(fù)洗滌，

4、盡量除去血液。洗完后將肝臟一分為二，每個(gè)小組半個(gè)肝，直接將半個(gè)肝放在小燒杯里剪碎，剪碎的肝臟放入勻漿器中，加入 1.5檸檬酸鈉溶液4.5ml，反復(fù)研磨制成勻漿，從而破碎細(xì)胞。研磨完后，將勻漿液用單層紗布進(jìn)行過濾，以除去未研碎的組織。（1）肝細(xì)胞勻漿的制備（2）分離細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核將過濾好的勻漿液，放入普通離心機(jī)，以3500r/min的轉(zhuǎn)速，離心15min。緩慢倒出上清液（細(xì)胞質(zhì)），移入另一試管中，保留待測(cè)定核酸時(shí)使用。余下的沉淀物為粗制的細(xì)胞核，加入0.25mol/L蔗糖-擰檬酸溶液1ml ，用玻捧攪勻，制成細(xì)胞核懸液。另取離心管一支，先加入0.88mol/L蔗糖-檸檬酸液9ml，用滴管吸取上述

5、核懸液，沿管壁緩緩鋪于0.88mol/L蔗糖-檸檬酸溶液液面上，再以2000r/min轉(zhuǎn)速離心10分鐘，傾去上層液，將管倒立于濾紙上，以吸干余液。沉淀為初步純化的細(xì)胞核。 加入TrisHClNaCl核洗液5ml洗滌沉淀，以2000r/min離心10min，除去上層液。得到的白色沉淀即為純化的肝細(xì)胞核。加5ml 0.02mol/L的NaOH使細(xì)胞核溶解為核液，保留，待測(cè)定核酸。 0.88 mol/L蔗糖-檸檬酸溶液9ml核懸液0.25 mol/L0.88 mol/L初步純化的細(xì)胞核其它的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)半個(gè)肝臟1.5%檸檬酸溶液4.5ml，制成勻漿單層紗布過濾1次濾液離心：3500r/min；15mi

6、n上清液（保留?。┏恋砑尤?.25mol/L 蔗糖檸檬酸溶液1ml 核懸液沿壁緩鋪于9ml 0.88mol/L蔗糖檸檬酸液面上離心：2000r/min；10min上清液（棄去）沉淀核洗液5ml洗滌沉淀上層液（棄去）沉 淀純化的細(xì)胞核 5ml 0.02mol/L NaOH溶解細(xì)胞核待測(cè)樣品鑒定離心：2000r/min，10min細(xì)胞核的分離與純化實(shí)驗(yàn)流程試劑（試劑（ml）12細(xì)胞質(zhì)液細(xì)胞質(zhì)液1.0-細(xì)胞核液細(xì)胞核液-1.01mol/LKOH1.01.02. 顯色與比色：取試管三支，編號(hào)，按下表操作:試劑（試劑（ml）12空白管空白管細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞質(zhì)RNA水解液水解液1.0-細(xì)胞核細(xì)胞核RNA水解液水

7、解液-2.0-5三氯醋酸三氯醋酸1.02.03,5一二羥基甲苯液一二羥基甲苯液3.03.03.01. 水解：取試管二支，編號(hào)，按下表操作：混合各管沸水浴(10min)冷卻加入5%三氯醋酸 (8ml)攪勻后離心 2000r/min；5min上清液 立即混合各管沸水浴(10min)冷卻660nm比色測(cè)定二、RNA的定量測(cè)定試劑（試劑（ml）12細(xì)胞質(zhì)液細(xì)胞質(zhì)液2.0-細(xì)胞核液細(xì)胞核液-2.01mol/L過氯酸過氯酸2.02.0試劑（試劑（ml）12空白空白管管細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞質(zhì)DNA水解液水解液2.0-細(xì)胞核細(xì)胞核DNA水解液水解液-2.0-0.5mol/L過氯酸過氯酸2.0二苯胺試劑二苯胺試劑4.04

8、.04.0混合各管冷卻離心 上清液 立即混合各管冷卻2000r/min;5min三、DNA的定量測(cè)定2. 顯色與比色：取試管三支，編號(hào)，按下表操作:1. 水解：取試管二支，編號(hào)，按下表操作：沸水浴(10min)沸水浴(12min)595nm比色測(cè)定表1. RNA的定量結(jié)果試管編號(hào)試管編號(hào)1（細(xì)胞質(zhì)液）（細(xì)胞質(zhì)液） 2（細(xì)胞核液）（細(xì)胞核液）原始吸光度值原始吸光度值查標(biāo)準(zhǔn)曲線所得數(shù)值查標(biāo)準(zhǔn)曲線所得數(shù)值提取液中提取液中RNA濃度（濃度（ug/ml）RNA占總占總RNA的百分比的百分比提取液中RNA濃度（ug/ml）=顯色反應(yīng)試管中RNA含量稀釋倍數(shù)（細(xì)胞質(zhì)液稀釋倍數(shù)為10倍，細(xì)胞核液的稀釋倍數(shù)為5倍）表2. DNA的定量結(jié)果試管編號(hào)試管編號(hào)1（細(xì)胞質(zhì)液）（細(xì)胞質(zhì)液） 2（細(xì)胞核液）（細(xì)胞核液）原始吸光度值原始吸光度值提取液中提取液中DNA濃度（濃度（ug/ml）DNA占總占總DNA的百分比的百分比1. 酸性溶液，取用要小心。2. 混勻要充分，并且要注意安全，防止液體溢出。3. 沸水浴操作時(shí)，要注意自己和別人的安全。4. 離心完后，一定先將上清液轉(zhuǎn)出到另一試管，再吸取所需量的水解液。3. 除了定糖