制備型高效液相色譜

1、在生物制藥中的應用在生物制藥中的應用 基因工程藥物基因工程藥物:白細胞介素、胰島素。白細胞介素、胰島素。 天然產(chǎn)物天然產(chǎn)物: 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì),多肽多肽,多糖。多糖。第一節(jié)第一節(jié) 高效液相色譜法簡介高效液相色譜法簡介液相色譜的發(fā)展史液相色譜的發(fā)展史 19031903年，年，色譜法色譜法問世問世俄國植物學家茨維特俄國植物學家茨維特 1903 1903年年3 3月月2121日，大會報告日，大會報告 “一種新型吸附現(xiàn)象及其在生化分析上的應用一種新型吸附現(xiàn)象及其在生化分析上的應用” ” 19061906年在德國植物學雜志發(fā)表文章，首次命名上年在德國植物學雜志發(fā)表文章，首次命名上述分離后色帶為色譜圖，稱此方

2、法為色譜法述分離后色帶為色譜圖，稱此方法為色譜法 19311931年，庫恩（年，庫恩（KuhnKuhn）分離分離胡蘿卜素胡蘿卜素，19381938年，年，KuhnKuhn和和LedererLederer從維生素從維生素B B中分離出中分離出B B6 6，獲得了獲得了19381938年的諾貝爾化學獎。年的諾貝爾化學獎。 19411941年，馬丁（年，馬丁（MartinMartin）和辛格（和辛格（SyngeSynge）提出提出液液分配色譜法液液分配色譜法，19521952年度的諾貝爾獎。年度的諾貝爾獎。 6060年代末，年代末，7070年代初，年代初，高效液相色譜儀高效液相色譜儀的成功研的成功研

3、制制1.2 基本儀器裝置基本儀器裝置 輸液系統(tǒng)輸液系統(tǒng) 進樣系統(tǒng)進樣系統(tǒng) 分離系統(tǒng)分離系統(tǒng) 檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng) 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)2.1 高效液相色譜高效液相色譜儀儀組成組成1 輸液系統(tǒng)輸液系統(tǒng) (1) 高壓輸液泵高壓輸液泵作用：將流動相以穩(wěn)定的流速或壓力輸送到色譜系統(tǒng)。作用：將流動相以穩(wěn)定的流速或壓力輸送到色譜系統(tǒng)。輸液泵的穩(wěn)定性直接關系到分析結果的重復性和準確性。輸液泵的穩(wěn)定性直接關系到分析結果的重復性和準確性。高壓輸液泵高壓輸液泵在線脫氣裝置在線脫氣裝置 (1) 高壓輸液泵高壓輸液泵(2)在線脫氣裝置在線脫氣裝置作用：作用：脫去流動相中的溶解氣體。流動相先經(jīng)過脫氣脫去流動相中的溶解氣

4、體。流動相先經(jīng)過脫氣 裝置再輸送到色譜柱。裝置再輸送到色譜柱。在線脫氣、超聲脫氣、真空脫氣等在線脫氣、超聲脫氣、真空脫氣等脫氣不好時有氣泡，導致流動相流速不穩(wěn)定，造成脫氣不好時有氣泡，導致流動相流速不穩(wěn)定，造成基線飄移，噪音增加?；€飄移，噪音增加。Pressure Dampers O2, N2, CO2（3）梯度洗脫裝置）梯度洗脫裝置Isocratic elution恒定組成的單一溶劑體系恒定組成的單一溶劑體系Gradient elution以一定速度改變多種溶劑的配比淋洗，以一定速度改變多種溶劑的配比淋洗，目的是分離多組容量因子相差較大的組分目的是分離多組容量因子相差較大的組分High-P

5、ressure Mixing2 進樣系統(tǒng)進樣系統(tǒng)六通閥六通閥3 色譜柱色譜柱Normal column 5- m、4.6- mNarrow bore column 1-3 mMicro column 1 m 色譜柱是實現(xiàn)分離的核心部件。要求柱效高、色譜柱是實現(xiàn)分離的核心部件。要求柱效高、柱容量大和性能穩(wěn)定。柱性能與柱結構、填料特性、柱容量大和性能穩(wěn)定。柱性能與柱結構、填料特性、填充質(zhì)量和使用條件有關。填充質(zhì)量和使用條件有關。 色譜柱填料色譜柱填料spherical and irregular silica particles Macroporous spherical silica parti

6、cle. K.K.Unger, Porous silica, Elsevier, 1979 基質(zhì)：基質(zhì)：載體或擔體。數(shù)載體或擔體。數(shù) m m數(shù)十數(shù)十 m m，球形。，球形。 硅膠或有機高分子聚合物硅膠或有機高分子聚合物Pellicular particlePorous particle30-50m1-2m3-10 m 色譜柱填料色譜柱填料功能層：功能層：物理吸附或化學鍵物理吸附或化學鍵合合三、高效液相色譜法的特點三、高效液相色譜法的特點 采用高效色譜柱、高壓輸液設備和高靈敏度檢采用高效色譜柱、高壓輸液設備和高靈敏度檢測器測器, 從而實現(xiàn)了高效、高速、高靈敏度和定從而實現(xiàn)了高效、高速、高靈敏度和

7、定量準確。量準確。 和經(jīng)典液相相比有以下和經(jīng)典液相相比有以下優(yōu)點優(yōu)點：快速、靈敏度高、：快速、靈敏度高、分辨率高、自動化程度高分辨率高、自動化程度高 等。等。四、制備型高效液相色譜與分析型四、制備型高效液相色譜與分析型高效液相色譜法的區(qū)別高效液相色譜法的區(qū)別 流速不同流速不同 檢測池不同檢測池不同 上樣量不同上樣量不同 色譜柱不同色譜柱不同五、色譜的基本理論及有關參數(shù)五、色譜的基本理論及有關參數(shù) 兩大理論：兩大理論： 塔板理論塔板理論(the plate model):闡明了色譜、蒸餾和萃闡明了色譜、蒸餾和萃取之間的相似性，將色譜柱設想成由許多液液萃取之間的相似性，將色譜柱設想成由許多液液萃取

8、單元或理論塔板組成；相似于精餾過程，色譜取單元或理論塔板組成；相似于精餾過程，色譜分離也是一個分配平衡過程分離也是一個分配平衡過程 . N = 16 (tR / wb)2 N = 5.54 (tR / w1/2)2 速率理論速率理論:研究各種動力學因素對峰展寬的影響。研究各種動力學因素對峰展寬的影響。 H= A+Cu有關參數(shù)有關參數(shù) 分離度：在色譜過程中表示兩組分相互分離的程度分離度：在色譜過程中表示兩組分相互分離的程度, ,一般情況下一般情況下, ,分離度大于分離度大于1.51.5時稱分離完全時稱分離完全. . 只有峰窄而間距大的分離是令人滿意的。只有峰窄而間距大的分離是令人滿意的。 在色譜

9、分析中要求：在色譜分析中要求： 兩組分的保留值差別要足夠大。兩組分的保留值差別要足夠大。 兩色譜峰要足夠窄。兩色譜峰要足夠窄。 待測組分的分離度要足夠大，分離過程要盡可能短待測組分的分離度要足夠大，分離過程要盡可能短. .2121)(2)(211212WWttWWttRrrrr 容量因子容量因子：溶質(zhì)在固定相中的總摩爾數(shù)與：溶質(zhì)在固定相中的總摩爾數(shù)與流動相中總摩爾數(shù)之比。流動相中總摩爾數(shù)之比。 選擇因子選擇因子：兩組分容量因子的比值：兩組分容量因子的比值 容量因子、選擇因子、理論塔板數(shù)對分離容量因子、選擇因子、理論塔板數(shù)對分離度的影響度的影響00tttkR12kk2122)1)(1(41Nkk

10、R六、制備型高效液相色譜的重要參數(shù)六、制備型高效液相色譜的重要參數(shù)CapacityCapacity: :純化過程中，目標物質(zhì)的上樣量。可以純化過程中，目標物質(zhì)的上樣量?？梢允求w積也可以是質(zhì)量。是體積也可以是質(zhì)量。SpeedSpeed: :在除去蛋白酶的過程中此項非常關鍵。在除去蛋白酶的過程中此項非常關鍵。RecoveryRecovery: :產(chǎn)品貴重時此項很重要。流動相的條件、產(chǎn)品貴重時此項很重要。流動相的條件、環(huán)境會影響它。減少步鄹和保持一種對生物樣品環(huán)境會影響它。減少步鄹和保持一種對生物樣品合適的環(huán)境條件。合適的環(huán)境條件。ResolutionResolution: :在純化的最后階段，此項

11、很關鍵，尤在純化的最后階段，此項很關鍵，尤其是雜質(zhì)的結構和目的物結構相似時。其是雜質(zhì)的結構和目的物結構相似時。七、分離機理和色譜類型七、分離機理和色譜類型 分離蛋白質(zhì)類物質(zhì)時的分離依據(jù)分離蛋白質(zhì)類物質(zhì)時的分離依據(jù)：疏水性疏水性分子大小分子大小等電點等電點結構特異性結構特異性色譜介質(zhì)按分離機理分為色譜介質(zhì)按分離機理分為正相色譜正相色譜反相色譜反相色譜：常加入：常加入TFA離子交換色譜離子交換色譜：陰離子交換色譜（：陰離子交換色譜（DEAE二乙基二乙基氨基乙基，氨基乙基，Q季胺鹽）陽離子交換色譜（季胺鹽）陽離子交換色譜（CM羧甲基羧甲基S磺酸基）磺酸基）凝膠過濾色譜凝膠過濾色譜疏水色譜疏水色譜：苯

12、基，辛基等。：苯基，辛基等。金屬螯合色譜金屬螯合色譜：鎳、銅等：鎳、銅等親合色譜親合色譜 第二節(jié)第二節(jié) 分離方案的設計分離方案的設計 What is the intended use of the product? What kind of starting material is available and how should it be handled? What are the purity issues in relation to the source material and intended use of the final product? What has to be re

13、moved? What must be removed completely? What will be the final scale of puridication? What are the economical constraints and what resources and equipment are available?一、分離方法之間的組合一、分離方法之間的組合 四步純化法：四步純化法：Preparation:Capture:(Isolate,concentrate and stabilize)Intermediate purification:(Remove bulk im

14、purities)Polishing:(Achieve final high level purity) 色譜之間的色譜之間的組合方案組合方案 AC、GF、IEX、HIC二、分離條件的優(yōu)化二、分離條件的優(yōu)化 合適的溶劑強度合適的溶劑強度: :容量因子容量因子k 足夠的足夠的柱效柱效N: 良好的良好的分離選擇性分離選擇性: :當當柱過載柱過載時：時：1 N1 N和和k都隨樣品負荷的增加而迅速地減小都隨樣品負荷的增加而迅速地減小2 2 流速對于塔板數(shù)流速對于塔板數(shù)N的影響大大地降低的影響大大地降低 3 通過增加柱長來有效地提高柱效，不宜通過增加柱長來有效地提高柱效，不宜通過降低柱壓（或流速）來達此

15、目的通過降低柱壓（或流速）來達此目的 制備分離的制備分離的兩種途徑兩種途徑： 第一種，基本上同于分析型，進樣量第一種，基本上同于分析型，進樣量不過載不過載，利用大內(nèi)徑的柱，通過調(diào)整分離方程中的有關利用大內(nèi)徑的柱，通過調(diào)整分離方程中的有關參數(shù)來達到分離的最佳化。在該法中往往利用參數(shù)來達到分離的最佳化。在該法中往往利用小顆粒的填料（約小顆粒的填料（約10m）來制取少量價值高來制取少量價值高而難分離的物質(zhì)。而難分離的物質(zhì)。 第二種，使用大粒度填料（第二種，使用大粒度填料（50m）的大內(nèi)的大內(nèi)徑柱，在徑柱，在過載過載情況下制備相對大量的純物質(zhì)。情況下制備相對大量的純物質(zhì)。當當值相當大時（例如值相當大時

16、（例如1.2），提高洗脫液的），提高洗脫液的流速并不至于嚴重降低分離度，從而大大縮短流速并不至于嚴重降低分離度，從而大大縮短分離時間。分離時間。 三、制備型高效液相色譜常見問題及三、制備型高效液相色譜常見問題及解決辦法解決辦法 待分離成分呈單一主峰待分離成分呈單一主峰 不易分開的兩組分不易分開的兩組分 目的組分含量少目的組分含量少 待分離成分呈單一主峰待分離成分呈單一主峰 不易分開的兩組分不易分開的兩組分 目的組分含量少目的組分含量少第三節(jié)第三節(jié) 實驗條件的選擇實驗條件的選擇 色譜柱的選擇與填裝色譜柱的選擇與填裝 柱填料柱填料 流動相選擇流動相選擇 檢測器的選擇檢測器的選擇 儀器設備儀器設備一

17、、柱的選擇和裝填 柱：柱： 不銹鋼柱不銹鋼柱： 200kg ，生物適應性差生物適應性差 玻璃柱：玻璃柱：1015kg 聚合物柱：聚合物柱： 裝填：裝填： 當粒度小于當粒度小于20m，用較大的勻漿罐濕法填裝。，用較大的勻漿罐濕法填裝。粒度大于粒度大于30m時；利用輕敲柱外壁的干填法時；利用輕敲柱外壁的干填法二、柱填料 硅膠：硅膠： 葡聚糖和瓊脂糖：葡聚糖和瓊脂糖： 高分子聚合物：高分子聚合物： 顆粒大小 在在很小很小的分離制備中，要求較高的的分離制備中，要求較高的N N值，宜值，宜用小粒度的填裝柱。用小粒度的填裝柱。 當當很大很大時，用大顆粒填裝柱，對過載進樣是時，用大顆粒填裝柱，對過載進樣是有

18、好處。有好處。 三、洗脫劑 可可利用相同填料的分析柱利用相同填料的分析柱，選擇最適合于分離，選擇最適合于分離目的和要求的流動相的組成（如溶劑的配比，目的和要求的流動相的組成（如溶劑的配比，離子強度，離子強度，pHpH等），將其直接或略加修改后用等），將其直接或略加修改后用于制備分離于制備分離 一般一般不采用梯度洗脫不采用梯度洗脫 選擇合適的溶劑選擇合適的溶劑溶解樣品溶解樣品 采用色譜純的試劑采用色譜純的試劑四、儀器設備 對泵的精密度和準確度要求不高（對泵的精密度和準確度要求不高（ 0.010.01100100mL/minmL/min ） 對檢測器的高靈敏要求不高對檢測器的高靈敏要求不高 流路系

19、統(tǒng)流路系統(tǒng)盡可能用盡可能用惰性聚合材料惰性聚合材料 柱外效應柱外效應試驗結果試驗結果影響較小影響較小 第四節(jié)第四節(jié) 操作變量的確定操作變量的確定 一、樣品的進樣量一、樣品的進樣量 宜注射宜注射低濃度大體積低濃度大體積的樣品，不宜注射高濃度的樣品，不宜注射高濃度小體積的樣品。小體積的樣品。 樣品進樣的體積與柱的內(nèi)徑、柱長、流動相和樣品進樣的體積與柱的內(nèi)徑、柱長、流動相和固定相的類型、樣品的溶解性以及分離目的有固定相的類型、樣品的溶解性以及分離目的有關。關。二、制備產(chǎn)率 產(chǎn)率隨分離度的提高而增加。產(chǎn)率隨分離度的提高而增加。 不過載的柱子，不過載的柱子，k k值較小時，產(chǎn)率較高。值較小時，產(chǎn)率較高。

20、 用全孔填料時產(chǎn)率高于用薄殼型的。用全孔填料時產(chǎn)率高于用薄殼型的。 對于對于值小的分離，宜利用小粒度（值小的分離，宜利用小粒度（5 51010mm）填料的柱子；在填料的柱子；在較大時，使用較大顆粒、大內(nèi)徑較大時，使用較大顆粒、大內(nèi)徑的柱，將獲得較高的產(chǎn)率，且價格便宜。的柱，將獲得較高的產(chǎn)率，且價格便宜。 柱的樣品容量和產(chǎn)率隨柱橫截面積的增加而增大。柱的樣品容量和產(chǎn)率隨柱橫截面積的增加而增大。 產(chǎn)率隨柱長、流動相的流速的增加而增加。產(chǎn)率隨柱長、流動相的流速的增加而增加。 三、回收率計算和純度鑒定 除去組分中的溶劑：熱的氮氣流吹，真空旋轉(zhuǎn)除去組分中的溶劑：熱的氮氣流吹，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥。蒸發(fā)

21、，冷凍干燥。 純度：純度：HPLCHPLC，TCLTCL。 回收率：重量，活性?；厥章剩褐亓?，活性。蛇毒中溶栓組分的分離蛇毒中溶栓組分的分離制備型高效液相色譜的應用制備型高效液相色譜的應用 肽的分離肽的分離 蛋白質(zhì)的分離蛋白質(zhì)的分離 多糖的分離多糖的分離 核酸的分離核酸的分離 肽的分離：肽的分離： 常用方法為反相色譜和離子交換色譜常用方法為反相色譜和離子交換色譜 肽的保留時間可用氨基酸的保留常數(shù)之和預測。肽的保留時間可用氨基酸的保留常數(shù)之和預測。 反相色譜分為：緩沖液反相色譜，離子對反相反相色譜分為：緩沖液反相色譜，離子對反相色譜。色譜。 肽的檢測：肽的檢測：UV200UV200230nm23

22、0nm，熒光檢測。熒光檢測。蛋白質(zhì)的分離蛋白質(zhì)的分離1 1填料填料：孔徑孔徑3003005005002 2流動相流動相（1 1）pH pH 低低pHpH使蛋白質(zhì)羧基解離受到抑制，使蛋白質(zhì)羧基解離受到抑制，極性降低，與反相鍵合相的作用強。對大極性降低，與反相鍵合相的作用強。對大多蛋白質(zhì)而言，使用多蛋白質(zhì)而言，使用pH2.5pH2.53.53.5的流動相的流動相可以得到最好的分離。可以得到最好的分離。（2 2）離子強度和離子對試劑離子強度和離子對試劑 增加離子強度增加了蛋白質(zhì)與鍵合相的疏水作增加離子強度增加了蛋白質(zhì)與鍵合相的疏水作用，較高的離子強度（用，較高的離子強度（0.20.2）可使蛋白質(zhì)有較好）可使蛋白質(zhì)有較好的分辨率和回收率。的分辨率和回收率。 緩沖液中的鹽還能通過形成離子對改變蛋白緩沖液中的鹽還能通過形成離子對改變蛋白質(zhì)分子表面極性。反離子是疏水的（如三氟乙酸質(zhì)分子表面極性。反離子是疏水的（如三氟乙酸根、七氟丁酸根），復合離子對保留時間增長。根、七氟丁酸根），復合離子對保留時間增長。如果反離子是親水的（如磷酸根、甲酸根），則如果反離子是親水的（如磷酸根、甲酸根），則復合離子對保留時間減少。復合離子對保留時間減少。 （3 3）有機溶劑有機溶劑 有機溶劑的選擇是改變蛋白質(zhì)保留性的重要手有機溶劑的選擇是改變蛋白質(zhì)保留性的重要手段之