層析工藝設(shè)計(jì)以及優(yōu)化1

1、層析工藝設(shè)計(jì)和優(yōu)化李李 巖巖 email: 中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所生化工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生化工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室第一部分基礎(chǔ)理論分離純化的一般流程分離純化的一般流程破碎細(xì)胞概述破碎細(xì)胞概述珠磨壓榨固體剪切高壓勻漿超聲液體剪切機(jī)械法凍溶法酶溶化學(xué)去垢劑溶胞作用非機(jī)械法細(xì)胞破碎方法壓撞 剪切 滲透 凍脹 破壁破膜超聲破碎超聲破碎(Ultrasonication)l作用機(jī)理：聲頻高于15-20KHz的超聲波在高強(qiáng)度聲能輸入下可以進(jìn)行細(xì)胞破碎，破碎機(jī)理一般認(rèn)為與空化現(xiàn)象(Cavitation)引起的沖擊波和剪切力有關(guān)。l空化現(xiàn)象是在強(qiáng)聲波作用下，氣泡形成、長(zhǎng)大和破碎的現(xiàn)象。l超

2、聲破碎的效率與聲頻、聲能、處理時(shí)間、細(xì)胞濃度及菌種類(lèi)型等因素有關(guān)。 反復(fù)凍融法反復(fù)凍融法l細(xì)胞含有大量水份，快速冷凍時(shí)，胞內(nèi)水結(jié)晶形成大量晶核，體積增大將細(xì)胞脹破達(dá)到破碎細(xì)胞的目的；此外，冷凍過(guò)程促使細(xì)胞膜疏水鍵斷裂增加了細(xì)胞的親水性。l 一般將40-70%的細(xì)胞懸浮液放入低溫冰箱使之快速冷凍，凍結(jié)后，取出在室溫下融化，然后再冷凍，反復(fù)進(jìn)行，通常需三次以上，酶的釋放率才可能達(dá)到滿意。l凍融法十分簡(jiǎn)便，無(wú)需特殊設(shè)備，在實(shí)驗(yàn)室中使用很方便，但耗時(shí)，耗能，大規(guī)模應(yīng)用困難。高壓勻漿法高壓勻漿法高壓勻漿器：由高壓泵和勻漿器組成易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)放大珠磨破碎法珠磨破碎法利用珠磨機(jī)內(nèi)大量的研磨劑(玻璃珠、鋼珠或陶

3、瓷珠)在攪拌槳的作用下通過(guò)碰撞、剪切等作用撕破或磨碎細(xì)胞以達(dá)到胞內(nèi)產(chǎn)物釋放的目的。珠磨機(jī)物料的出口處設(shè)有夾縫或篩孔板用以截留珠體，從而實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作。指標(biāo)指標(biāo)高壓勻漿法高壓勻漿法高速珠磨法高速珠磨法操作參數(shù)操作參數(shù)少，易于確定少，易于確定多，憑經(jīng)驗(yàn)估計(jì)多，憑經(jīng)驗(yàn)估計(jì)操作次數(shù)操作次數(shù)24次次1次次冷卻冷卻用換熱器級(jí)間冷卻用換熱器級(jí)間冷卻采用夾套冷卻，減少采用夾套冷卻，減少產(chǎn)品失活可能產(chǎn)品失活可能應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍絲狀真菌和小革蘭氏陽(yáng)性絲狀真菌和小革蘭氏陽(yáng)性菌菌,及含包涵體細(xì)胞除外及含包涵體細(xì)胞除外幾乎所有微生物幾乎所有微生物制備放大制備放大易易較難較難高壓勻漿法同高速珠磨法的比較高壓勻漿法同高速珠磨

4、法的比較不論高壓勻漿法和高速珠磨法，都不僅以破碎率為基準(zhǔn)，而需考慮產(chǎn)物的收率和兼顧上下游過(guò)程澄清技術(shù)概述澄清技術(shù)概述離心：適用于實(shí)驗(yàn)室過(guò)濾：板框過(guò)濾適用于生產(chǎn)微濾：采用不同的組件適用于實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)規(guī)模分離方法概述分離方法概述沉淀法：經(jīng)典的方法（血液制品生產(chǎn)中仍在沿用）超速離心：分離病毒的經(jīng)典方法超濾：主要用于濃縮和緩沖液置換層析：目前GMP發(fā)展的趨勢(shì)沉淀法沉淀法鹽沉淀有機(jī)溶劑沉淀等電點(diǎn)沉淀酸沉淀非離子多聚物沉淀聚電解質(zhì)沉淀l水化層的破壞l靜電排斥力的降低l疏水性的增加l大分子的介導(dǎo)脫水過(guò)程示意圖冷乙醇沉淀法制備血漿蛋白冷乙醇沉淀法制備血漿蛋白各步所沉淀下來(lái)的蛋白各步所沉淀下來(lái)的蛋白超離心技術(shù)超

5、離心技術(shù)n發(fā)展歷史Svedberg，winner of the 1926 Nobel Prize in chemistry for his work on colloids and his invention of the ultracentrifugen優(yōu)良的學(xué)術(shù)傳承Tiselius1948年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)Bjorn Ingelman發(fā)現(xiàn)了葡聚糖Porath and Flodin于1959年在Nature上發(fā)表了有關(guān)凝膠過(guò)濾層析的第一篇論文書(shū)籍推薦書(shū)籍推薦金綠松，林元喜主編離心分離，化學(xué)工業(yè)出版社出版，2008年單元操作超速離心因子Fr：離心力/重力的比值離心分離Fr=1.11910-5n2

6、rn: 轉(zhuǎn)速，轉(zhuǎn)/分鐘；r: 轉(zhuǎn)鼓半徑， cm衡量離心設(shè)備的離心程度的重要技術(shù)參數(shù)按分離因子Fr分類(lèi) 1)、常速離心機(jī)Fr 1.91.3Cs2SO41.431.451.641.3Metrizamide1.121.141.171.27Nycodenz1.121.161.181.27沉淀系數(shù)的物理意義沉淀系數(shù)指單位離心力場(chǎng)（w2x）作用下的沉降速度（dx/dt），沉降系數(shù)的單位為秒蛋白質(zhì)、脂蛋白、核糖體和病毒等的沉降系數(shù)介于1*10-13200*10-13秒。為方便起見(jiàn)把10-13秒作為1個(gè)單位，成為Svedberg單位區(qū)帶離心和區(qū)帶轉(zhuǎn)子區(qū)帶離心是指把樣品中不同的顆粒分離成不連續(xù)的區(qū)帶區(qū)帶轉(zhuǎn)子是指

7、一類(lèi)結(jié)構(gòu)與操作方式特殊的轉(zhuǎn)子密度梯度離心速度-區(qū)帶密度梯度離心法將樣品置于一密度梯度介質(zhì)頂層，該梯度最大密度低于擬分離混合物的最小密度，離心時(shí)各物質(zhì)按其大小、形狀和密度的不同而沉降速率各異，分別沉降在不同區(qū)帶而達(dá)到分離的方法。等密度梯度離心法等密度離心分離樣品主要是根據(jù)被分離樣品的密度。在這種離心分離方法中，要用介質(zhì)產(chǎn)生一種密度梯度， 這種密度梯度覆蓋了待分離物質(zhì)的密度，這樣，通過(guò)離心使不同密度的顆粒懸浮到相應(yīng)的介質(zhì)密度區(qū)。在這種梯度離心中，顆粒的密度是影響最終位置的唯一因素，因此用這種方法分離顆粒，主要是根據(jù)被分離顆粒的密度差異。只要被分離顆粒間的密度差異大于1% 就可用此法分離。 轉(zhuǎn)子類(lèi)型

8、角轉(zhuǎn)子甩平轉(zhuǎn)子垂直轉(zhuǎn)子規(guī)?；a(chǎn)的超速離心機(jī)OptimaL-100XP100,000rpm;802,400 xgOptimaL-100K100,000rpm;802,400 xgOptimaL-90K90,000rpm;694,000 xgOptimaL-80XP80,000rpm;602,000 xg密度梯度離心病毒顆粒的制備密度梯度離心病毒顆粒的制備密度梯度的加樣量樣品濃度過(guò)大，會(huì)產(chǎn)生液流，并且有可能產(chǎn)生沉淀。過(guò)高的濃度也會(huì)使分離區(qū)帶變寬而喪失分辨率。當(dāng)顆粒沉降系數(shù)或者浮力密度差較小時(shí)，上樣體積不超過(guò)梯度體積的5%。梯度斜度越大，承載的樣品量也越大。比如10-50%梯度的最大上樣量要比5-

9、20%梯度的最大上樣量大。對(duì)于區(qū)帶轉(zhuǎn)子，樣品濃度低于起始梯度濃度的40%。蔗糖密度梯度離心離心時(shí)間的影響（改變顆粒移動(dòng)的時(shí)間）密度梯度的影響（改變介質(zhì)的密度，從而改變顆粒的移動(dòng)速度）離心溫度（改變離心介質(zhì)的粘度，從而改變顆粒移動(dòng)速度）僅通過(guò)蔗糖密度梯度離心很難得到EV71病毒顆粒的純品，在此體系中條件優(yōu)化不能實(shí)現(xiàn)質(zhì)的提高CsCl等密度梯度離心的條件摸索密度梯度和取樣編號(hào)密度g/mL抗原U/mL蛋白濃度mg/mL比活U/mg1(25-30-35-40%)-31.0581.291030.55762.32(25-30-35-40%)-51.104-6.470-3(25-30-35-40%)-61.1

10、23-10.54-4(25-30-35-40%)-71.166-6.573-5(25-30-35-40%)-81.197-3.502-6(25-30-35-40%)-101.2241.431058.51016.87(25-30-35-40%)-111.2861.471040.821117.98(25-30-35-40%)-121.3627.861030.232733.89(20-40-60%)-31.0321.031031.1150.910(20-40-60%)-41.0607.891033.3752.311(20-40-60%)-51.081-12.82-12(20-40-60%)-61.1

11、49-15.69-13(20-40-60%)-71.2682.1510516.1013.414(20-40-60%)-81.3833.721040.914940.615(20-40-60%)-91.4947.371030.054491351 2 M 3 4 5 6 7 89 10 11 M 12 13 14 15等密度離心介質(zhì)的篩選樣品密度g/mL抗原U/mL蛋白濃度mg/mL比活U/mg1NaI第5管1.356104027520.42KI第10管1.322-3474-3KI第11管1.379-511.9-4KI第12管1.418-211.7-5NaBr第8管1.29253875345015.

12、66NaBr第9管1.3333453358.29.67NaBr第10管1.379146328.8350.72 3 4 M 5 6 7注：KBr在4C下結(jié)晶析出，所以沒(méi)有考察采用NaBr代替昂貴的重金屬鹽CsCl，為EV71的純化提供了一個(gè)新的途徑！單元操作超濾單元操作超濾膜分離特點(diǎn)膜分離特點(diǎn)膜分離技術(shù)是用半透膜作為分離層，允許某些組分透過(guò)而保留混合物中其它組分，從而達(dá)到分離目的的技術(shù)。它具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、無(wú)相變、無(wú)化學(xué)變化、處理效率高和節(jié)省能源等優(yōu)點(diǎn)。膜分離的驅(qū)動(dòng)力是膜兩側(cè)溶液狀態(tài)的差別。膜兩側(cè)的壓力（微濾、超濾、反滲透）、濃度（透析、滲透蒸發(fā)）、電位（電滲析）等的差別均可作為分離的驅(qū)動(dòng)

13、力。微濾和超濾微濾和超濾微濾的分離原理為篩分原理，膜的孔徑為0.0510m，采用的壓力為0.050.5MPa。微濾技術(shù)主要用于消毒、澄清、細(xì)胞收集等過(guò)程。超濾的分離主要也是篩分原理，但有些情況下受到粒子荷電性的影響。超濾膜的孔徑為0.0010.05m，它可以分離分子量從3k到1000k Da的可溶性大分子物質(zhì)，采用的壓力為0.11MPa。超濾技術(shù)主要用于濃縮，也可以用于分離過(guò)程，但是分離效率不高。當(dāng)目標(biāo)蛋白質(zhì)與雜質(zhì)的分子量差別達(dá)到一個(gè)數(shù)量級(jí)時(shí)，才可能用超濾技術(shù)實(shí)現(xiàn)有效的分離。 影響分離的因素影響分離的因素n膜的類(lèi)：包括膜的材料，膜孔的大小，膜的內(nèi)部結(jié)構(gòu)以及膜組件的類(lèi)型等。n操作條件：包括膜兩側(cè)

14、壓差、切向流速和溫度等。n溶液環(huán)境：包括蛋白質(zhì)濃度、物料的pH值、鹽的類(lèi)型及其濃度等。濃度極化濃度極化A: 過(guò)濾，被膜阻擋物質(zhì)在膜表面積累，形成濃度梯度B: 切向流動(dòng)使膜表面積累的物質(zhì)在剪切作用下返回液流當(dāng)A速度B速度時(shí)：在膜面附近形成一個(gè)穩(wěn)定的濃度梯度區(qū)，這一區(qū)域稱為濃度極化邊界層，這一現(xiàn)象稱為濃度極化可逆過(guò)程，在過(guò)濾中產(chǎn)生，停止過(guò)濾，極化逐漸消失AB曲線代表被膜阻擋物質(zhì)的濃度變化，在距離膜表面處形成邊界層，濃度呈指數(shù)形式增加膜的污染膜的污染物料中微粒、物料中微粒、膠體粒子或膠體粒子或溶質(zhì)大分子溶質(zhì)大分子膜膜物理化學(xué)或物理化學(xué)或機(jī)械作用機(jī)械作用膜孔徑變小膜孔徑變小或堵塞或堵塞膜透過(guò)流量膜透過(guò)

15、流量分離特性分離特性不可逆改變不可逆改變與初始純水透水率相比，可降10%到80%層析的分類(lèi)層析的分類(lèi)吸附解吸類(lèi)蛋白質(zhì)分子與介質(zhì)有相互作用離子交換層析、反相層析、疏水相互作用層析、親和層析非吸附解吸類(lèi)蛋白質(zhì)分子與介質(zhì)之間沒(méi)有相互作用體積排阻層析：根據(jù)分子大小進(jìn)行分類(lèi)吸附解吸類(lèi)層析吸附解吸類(lèi)層析配基的類(lèi)型決定色譜的模式Affinity(Biorecognition)生物識(shí)別Reversed phase(Hydrophobicity) 疏水相互作用HIC(Hydrophobicity)疏水相互作用Ion exchange(Charge)電荷SOOO層析的影響因素層析的影響因素 溶液pH 溶液溫度 溶

16、液鹽濃度 溶質(zhì)濃度 介質(zhì)粒徑大小 介質(zhì)粒徑分布 孔徑大小 孔徑分布常用的基本概念常用的基本概念 固定相 流動(dòng)相 分配系數(shù)（Cs/Cm） 分辨率（Rs=1每種組分純度為98%； Rs=1.5每種組分純度為99.8% ） 容量因子（D）：固定相與流動(dòng)相中溶質(zhì)量的分布比 分離因子（）： 兩種組分容量因子之比 操作容量：某種組分與固定相反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，介質(zhì)的飽和容量；通常上樣量應(yīng)少于20%的操作容量JB GF 1998-06-0434Resolution RsRs = 4Rs = 0.6Rs = 1RVVWWsrr21122Resolution = Peak separationAv. peak wi

17、dthJB GF 1998-06-0434Resolution RsRs = 4Rs = 0.6Rs = 1RVVWWsrr21122Resolution = Peak separationAv. peak width速率方程各項(xiàng)的意義速率方程各項(xiàng)的意義smmsdeHHHHHHHCuuBAuDdCDdCDdCuDCdHmpsmmpmsfsmdp2222 為塔板高度pedH2eH 為渦流擴(kuò)散相uDCHmdddH 為縱向擴(kuò)散相uDdCHsfss2sH 為固定相傳質(zhì)阻力相uDdCHmpmsm2smH 為滯留流動(dòng)相傳質(zhì)阻力相uDdCHmpmm2mH 為流動(dòng)相傳質(zhì)阻力相液相色譜系統(tǒng)組成液相色譜系統(tǒng)組成動(dòng)

18、力系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)記錄系統(tǒng)凝膠過(guò)濾層析凝膠過(guò)濾層析Gel filtration (Porath, Flodin, 1959)Size exclusion chromatography(Pedersen, 1962)Molecular sieve chromatography (Hjertn, Mosbach, 1962)Gel permeation chromatography(Moore, 1964)JB GF 1998-06-0424Steric exclusion leads to early elutionMolecules elute in order of size.T

19、he largestmolecules come first; the smallestones come last.凝膠過(guò)濾層析的用途凝膠過(guò)濾層析的用途分析柱用途制備柱用途確定分子量大小確定樣品純度研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)脫鹽緩沖液置換在蛋白質(zhì)分離中常作為精制步驟去除DNA，以及小分子等雜質(zhì)在病毒分離中作為第一步去除大部分分子量較小的雜質(zhì)GF基本操作程序基本操作程序平衡上樣洗脫一般來(lái)說(shuō)上樣體積應(yīng)低于5%的柱體積，對(duì)于分析柱，則不超過(guò)1%的柱體積凝膠過(guò)濾層析中的基本概念凝膠過(guò)濾層析中的基本概念JB GF 1998-06-0426Terms and explanationsVoid volumeVoVo

20、lume of the gel matrix VsPore volume ViVo=VoidvolumeVr=ElutionvolumewithintheseparationrangeofthegelVi=Innerporevolume=Vc- Vs-VoVc=Total(geometric)volumeofthecolumn231VoVrVtVc分離度和柱效分離度和柱效JB GF 1998-06-0434Resolution RsRs = 4Rs = 0.6Rs = 1RVVWWsrr21122Resolution = Peak separationAv. peak widthJB GF 1

21、998-06-0446V)N = 5.54 (WhrN = Number of theoretical platesTest: 1% solution of acetone (about 0.5% of column volume), 0.2 AUFS at 280 nm. Alternatively use 2 M NaCland conductivity monitor.EfficiencyWh=PeakwidthathalfpeakheightVrAU2802介質(zhì)的特點(diǎn)介質(zhì)的特點(diǎn)瓊脂糖A good gel for gel filtration contains about95% wate

22、r影響凝膠過(guò)濾層析的因素影響凝膠過(guò)濾層析的因素介質(zhì)種類(lèi)和顆粒大小樣品體積和濃度流速孔徑大小顆粒大小的影響顆粒大小的影響p Superdex Peptide 13-15 mp Superdex 30 prep grade 24-44 m樣品體積對(duì)于分辨率的影響樣品體積對(duì)于分辨率的影響蛋白Tf和IgG的進(jìn)樣體積對(duì)分離精度的影響樣品濃度的影響樣品濃度的影響使用注意事項(xiàng)使用注意事項(xiàng)凝膠過(guò)濾層析最好使用進(jìn)口層析柱裝柱技術(shù)非常關(guān)鍵，有條件盡量使用預(yù)裝柱對(duì)于某些分析柱，調(diào)節(jié)鹽濃度可能會(huì)產(chǎn)生提高分辨率的效果蛋白質(zhì)的吸附解吸類(lèi)層析蛋白質(zhì)的吸附解吸類(lèi)層析蛋白質(zhì)與小分子吸附解吸過(guò)程的最大不同： 蛋白質(zhì)不同的構(gòu)象之間

23、的能量差別較大，小分子則很小或沒(méi)有蛋白質(zhì)吸到介質(zhì)以后，除非改變流動(dòng)相條件，否則不會(huì)解吸下來(lái)，會(huì)越吸牢固蛋白質(zhì)更傾向于吸附機(jī)理，小分子更傾向于分配機(jī)理平衡進(jìn)料淋洗洗脫再生平衡操作程序離子交換層析離子交換層析pH值 緩沖溶液類(lèi)型洗脫鹽的類(lèi)型介質(zhì)粒徑介質(zhì)孔徑配基類(lèi)型配基密度影響因素根據(jù)蛋白質(zhì)與介質(zhì)之間靜電吸附的強(qiáng)弱進(jìn)行分離離子交換層析的用途離子交換層析的用途步驟步驟純度純度 further removal of most proteins further removal of most nucleic acids further removal of endotoxins further remov

24、al of virusesinitial purificationstabilizationclarificationconcentration achieve final purity and safety additional safety measure3.精制精制1.捕獲捕獲2.中間純化中間純化可用于分離純化的各個(gè)階段第一步最常用有時(shí)也可以用于最后一步強(qiáng)和弱的區(qū)別強(qiáng)和弱的區(qū)別WeakanionexchangerWeakcationexchangerStronganionexchangerStrongcationexchanger強(qiáng)弱在于它們的電荷基團(tuán)完全解離的pH范圍，強(qiáng)酸型在較大pH

25、范圍內(nèi)完全解離，弱酸型完全解離的pH范圍較小強(qiáng)酸型離子交換劑對(duì)H+的結(jié)合能力比Na+小，弱酸型則反之強(qiáng)堿型離子交換劑對(duì)OH-的結(jié)合能力比Cl-小，弱酸型則反之常用的類(lèi)型常用的類(lèi)型葡聚糖凝膠型 DEAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-25，CM-Sephadex C-25，SP-Sephadex C-25纖維素系列離子交換劑 DEAE-Sephacel Cellex系列 瓊脂糖系列離子交換劑 GE公司的Sepharose系列 Sepharose CL-6B, Sepharose Fast Flow Bio-Gel A 系列交聯(lián)瓊脂糖離子交換劑Source 系列離子交換

26、劑特點(diǎn)：介質(zhì)均勻、分辨率高、流速快、反壓低陽(yáng)離子交換樹(shù)脂 S系列陰離子交換樹(shù)脂 Q系列MonoBeads 系列離子交換劑（Pharmacia）特點(diǎn)：介質(zhì)為親水性聚醚，具有和Source系列相同的優(yōu)點(diǎn)，但動(dòng)態(tài)載量更大，壽命更長(zhǎng)。同樣分為Q系列和S系列常用的電荷基團(tuán)常用的電荷基團(tuán)陰離子交換劑-Diethylaminoethyl (DEAE)-CH2CH2N+(CH2CH3)2-Quaternary aminoethyl (QAE)-CH2CH2N+(C2H5)2CH2CHOHCH3-Quaternary ammonium (Q)-CH2N+ (CH3)3陽(yáng)離子交換劑-Carboxymethyl (

27、CM)-CH2COO-Sulphopropyl (SP)-CH2CH2CH2SO3-Methylsulphonate (S)-CH2SO3pH值對(duì)蛋白質(zhì)電荷的影響值對(duì)蛋白質(zhì)電荷的影響Overall charge on protein+-NH3RCOOH+NH3RCOO+-RNH2COO-acidisoelectricpointalkalineexcesspositivechargebalancedpositiveandnegativechargeexcessnegativechargepHpH310利用利用pH值提高選擇性值提高選擇性Charge on protein-+pH310Anion

28、exchangerCation exchanger不同緩沖體系的緩沖能力不同緩沖體系的緩沖能力ToensureaproperpHvalue,thesampleshouldbedissolvedinbufferA,(criticalwithlargevolumesamples).Bufferingionconcentrationsof2050mMareusuallysufficient.AUvolumepHvaluegradientvolumeAUpHvaluegradient陰離子交換可選緩沖體系陰離子交換可選緩沖體系pH456789101112N-MethylpiperazinePipera

29、zineL-HistidineBis-TrisBis-Tris-propaneTriethanolamineTrisN-methyldiethaneEthanolamine(hi)Piperazine(hi)1,3-diaminoPiperidineBufferPrepAIEX陽(yáng)離子交換可用緩沖體系陽(yáng)離子交換可用緩沖體系pH0246810MaleicacidMalonicacidCitricacidFormicacidButanedioicaciAceticacidMESMOPSPhosphateHEPESBICINEBufferPrepCIEX使用使用pH值應(yīng)注意的地方值應(yīng)注意的地方蛋白質(zhì)帶

30、電不均一，pH在等電點(diǎn)之下時(shí)，蛋白質(zhì)整體帶正電，但是也存在帶有負(fù)電的基團(tuán)，所以也可能和陰離子交換層析發(fā)生作用；陽(yáng)離子層析也是如此pH值篩選過(guò)程值篩選過(guò)程1. 先考察不同蛋白質(zhì)穩(wěn)定的pH范圍確定可使用的pH值2. 靜態(tài)實(shí)驗(yàn)考察蛋白發(fā)生的吸附的pH值進(jìn)一步縮小pH值范圍1) Put 1 ml ion exchanger into several tubes 2) Add buffers with different pHs3) Add sample, mix4) Analyse the supernatants for the protein of interestHere the target

31、binds completely at pH 7.5 and above.Conclusion: Anion exchanger, initial pH 7.5.pH值篩選過(guò)程值篩選過(guò)程3. 通過(guò)層析選擇最佳的pH值根據(jù)目標(biāo)是分析還是分離，指標(biāo)是純度還是收率進(jìn)行選擇01020304050020406080100120mAUElutionvolume(ml)MNaCl10.50pH5pH6pH7pH8pH9pH scouting for the separation of pancreatinConditions:System:KTAexplorer 100, BufferPrepColumn:

32、RESOURCE Q, 6 mlSample:2 mg crude pancreatin不同的洗脫方式不同的洗脫方式階躍梯度(Step gradient)線性梯度(Linear gradient)綜合pH梯度鹽梯度聯(lián)用pH 和鹽簡(jiǎn)單，易實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)方法，分離精度高省時(shí)、效率高很少用標(biāo)準(zhǔn)方法靈敏，但難控蛋白質(zhì)層析中的線性洗脫和階梯洗脫蛋白質(zhì)層析中的線性洗脫和階梯洗脫進(jìn)行蛋白質(zhì)分離時(shí)，階梯洗脫往往有更好的效果鹽類(lèi)型的影響鹽類(lèi)型的影響不同鹽濃度具有相同洗脫力: Sulphate (SO42-) 150 mM Chloride (Cl-)350 mM Acetate (CH3COO-)700 mM陰離子對(duì)

33、于陽(yáng)離子層析，以及陽(yáng)離子對(duì)陰離子層析也會(huì)有影響hofmeister效應(yīng)離子交換層析小結(jié)離子交換層析小結(jié)原理如何篩選最佳pH值洗脫鹽的影響其它操作細(xì)節(jié)（如平衡柱體積，溫度，蛋白質(zhì)與介質(zhì)表面的接觸時(shí)間等等）疏水相互作用層析疏水相互作用層析pH值 鹽的類(lèi)型鹽的濃度介質(zhì)粒徑介質(zhì)孔徑配基類(lèi)型配基密度影響因素根據(jù)蛋白質(zhì)與介質(zhì)之間疏水相互作用的強(qiáng)弱進(jìn)行分離疏水層析的用途疏水層析的用途步驟步驟純度純度 further removal of most proteins further removal of most nucleic acids further removal of endotoxins furt

34、her removal of virusesinitial purificationstabilizationclarificationconcentration achieve final purity and safety additional safety measure3.精制精制1.捕獲捕獲2.中間純化中間純化用于分離純化的頭兩個(gè)階段最后一步很少用疏水配基類(lèi)型的影響疏水配基類(lèi)型的影響丁基辛基低密度苯基高密度苯基相同配基類(lèi)型，不同配基密度可使蛋白質(zhì)的層析行為有很大的差別鹽濃度的影響鹽濃度的影響鹽濃度過(guò)低蛋白質(zhì)不能夠與介質(zhì)發(fā)生吸附鹽濃度過(guò)高蛋白質(zhì)吸附太強(qiáng)，在柱上變性鹽類(lèi)型的影響鹽類(lèi)型的影

35、響Cl-之前的稱為kosmotropes（water structure maker）Cl-之前的稱為chaotropes（water structure breaker）Franz HofmeisterFranz Hofmeister (18501922) 不同離子對(duì)于蛋白質(zhì)沉淀的影響（1888） 對(duì)于早期的蛋白質(zhì)純化是基礎(chǔ)性和指導(dǎo)性的工作 最早認(rèn)識(shí)到蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的科學(xué)家（1902） 是溶液化學(xué)的基礎(chǔ)和核心問(wèn)題 Hermann Emil Fischer (1952-1919)證明蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的科學(xué)家（1902） 疏水層析最佳條件的選擇疏水層析最佳條件的選擇1 考察不同鹽對(duì)于蛋

36、白質(zhì)在溶液中穩(wěn)定性的影響疏水層析最佳條件的選擇疏水層析最佳條件的選擇2 靜態(tài)吸附篩選能夠?qū)崿F(xiàn)有效吸附的鹽類(lèi)鹽上清中的活性解吸后的活性(NH4)2SO48.03%36.3%Na2SO46.72%43.1%NaCl16.0%28.2%KCl15.4%13.4%NH4Cl17.2%18.5%KNO316.8%5.76%KBr17.3%7.02%A/B7.55%39.7%只有三種鹽的吸附效果比較好，其它的鹽雖然在溶液中對(duì)HBsAg的活性沒(méi)有損失，但是對(duì)HBsAg沒(méi)有明顯的吸附效果疏水層析最佳條件的選擇疏水層析最佳條件的選擇A/B抗原收率純化倍數(shù)1/331.0%2.581/152.0%3.822.6/1

37、63.0%6.457/174.6%5.10介質(zhì)/破碎液抗原收率 純化倍數(shù)1：440.6%12.21：687.2%25.81：861.6%16.21：1038.5%7.78鹽類(lèi)型調(diào)電導(dǎo)收率層析收率總收率(NH4)2SO468.6%60.1%41.2%Na2SO475.6%37.0%27.9%A/B77.4%76.4%59.1%鹽比例濃度的影響 載量的影響鹽類(lèi)型的影響鹽濃度的影響電導(dǎo)率抗原收率純化倍數(shù)65.1mS/cm70.1%7.2374.3mS/cm89.8%1079.9mS/cm103%8.653 動(dòng)態(tài)層析的進(jìn)一步優(yōu)化反相層析簡(jiǎn)介反相層析簡(jiǎn)介反相層析和疏水層析的差別反相層析是目前分辨率最高分

38、析類(lèi)色譜親和層析親和層析親和層析是通過(guò)生物特異性差異分離樣品的液相層析技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：易于分離其它方法難以分離的樣品單步純度往往可達(dá)到95%以上易于從大量雜質(zhì)或類(lèi)似物雜質(zhì)中分離出特定目的蛋白速度快應(yīng)用廣泛?jiǎn)慰?、多抗、融合蛋白、酶、DNA結(jié)合蛋白親和層析的關(guān)鍵在于配基的選擇典型的洗脫圖形典型的洗脫圖形平衡進(jìn)料淋洗洗脫再平衡配基的選擇配基的選擇Mono-specific ligandsSpecific for a single substance: Antigenantibody HormonereceptorGroup-specific ligandsSpecific for a group of s

39、tructurally or functionally similar substances: Lectins glycoproteins Protein G IgG antibodies Dye-stuffs enzymes純化不同物質(zhì)需要不同配基,一般不具有通用性多數(shù)情況下特殊生物活性分子無(wú)現(xiàn)成商品介質(zhì)可供使用選擇合適的配基是關(guān)鍵常用配基類(lèi)型常用配基類(lèi)型LigandSpecificityProtein AFc region of IgGProtein G Fc region of IgGConcanavalin AGlucopyranosyl & Mannopyranosyl gr

40、oupsPeanut LectinTerminal galactose groupCibacron BlueBroad range of enzymes, serum albuminProcion RedNADP+ dependent enzymes LysinePlasminogen, ribosomal RNA基質(zhì)的選擇基質(zhì)的選擇在多孔性、穩(wěn)定性、機(jī)械強(qiáng)度等方面與IEC等介質(zhì)相同必須易于活化但又必須具有一定惰性以防非特異性吸附基質(zhì)物化性質(zhì)不應(yīng)與配基分子鍵合后發(fā)生顯著改變顆粒均一度要求高，以保證配體分子均勻分布影響親和層析的因素 基質(zhì)的選擇（乙肝病毒表面抗原親和層析） 配基的選擇特異性、可逆

41、性、穩(wěn)定性、配基分子大小 化學(xué)間臂的選擇消除空間位阻、長(zhǎng)度、親水性介質(zhì)與配基的鍵合基質(zhì)表面活化-化學(xué)反應(yīng)，如CNBr活化瓊脂糖羥基 介質(zhì)活化基團(tuán)與配基上的氨基、羧基、羥基、巰基或醛基等發(fā)生共價(jià)結(jié)合反應(yīng)鍵合過(guò)程應(yīng)用實(shí)例單克隆抗體Sample: 600 ml mouse monoclonal IgG 2aGel:rProtein A Sepharose Fast FlowElution: 20 mM Sodium Citrate, pH 4.0Result: 83 mg Mab, recovery 95%AU2.01.51.00.50.00200400600Volume(ml)Starting m

42、aterialEluate94KD67KD43KDSDS-PAGE reduced應(yīng)用實(shí)例組氨酸標(biāo)記融合蛋白Sample: 5 ml cytoplasmic extract containing (His)6-tagged GSTColumn: In HisTrap kitElution: Phosphate buffer, 500 mM imidazole, pH 7.4Result: 4 ml eluted GST-(His)6, A280:1.65. Total amount: 4.5 mgStarting materialFlow-throughEluted GST-(His)6GST

43、 standardSDS-PAGE94.067.043.030.020.114.4第二部分應(yīng)用部分分離純化在生物藥品中的作用血液制品分離純化技術(shù)是核心技術(shù)疫苗給正常人群使用，對(duì)其要求非常嚴(yán)格。在某些類(lèi)產(chǎn)品中，分離純化是技術(shù)難題生物制劑分離純化是最關(guān)鍵技術(shù)之一細(xì)胞破碎液離心機(jī)疏水層析凝膠過(guò)濾層析離子交換層析脫鹽濃縮純化流程示意圖關(guān)于純化技術(shù)認(rèn)識(shí)誤區(qū)只要在蛋白上加上一個(gè)標(biāo)簽，就可以用金屬螯合進(jìn)行純化，是否還需要其它技術(shù)？ 重組技術(shù)的局限性：分子量越大的蛋白質(zhì)，重組蛋白與天然蛋白在結(jié)構(gòu)上的差別越大，如重組的VIII因子以及重組疫苗 親和層析技術(shù)的局限性：主要應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室研究，在復(fù)雜體系中仍然會(huì)吸附其

44、它的雜蛋白，存在著配基脫落關(guān)于純度的認(rèn)識(shí)誤區(qū)不僅要看純度，還要看均一性以及結(jié)構(gòu)是否正確。如大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物的N端非均一性，包涵體的復(fù)性等等。純度受分析方法精確度的限制。如說(shuō)純度達(dá)到99.9%，必須說(shuō)明所采用的分析方法以供判斷是否可靠分離純化過(guò)程中純度可用于評(píng)價(jià)分離效果但不一定代表產(chǎn)品質(zhì)量。蛋白質(zhì)純化的核心問(wèn)題蛋白質(zhì)在純化過(guò)程中的結(jié)構(gòu)變化HBsAg的DEAE層析譜圖HBsAg的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化HBsAg的四級(jí)結(jié)構(gòu)變化HBsAg在界面上變化的在線監(jiān)測(cè)HBsAg純品在離子交換層析上會(huì)分裂為兩個(gè)峰，這說(shuō)明其結(jié)構(gòu)在層析中可能會(huì)發(fā)生變化層析技術(shù)的分類(lèi)吸附解吸類(lèi)非吸附解吸類(lèi)離子交換層析；疏水相互作用層析；反相層

45、析；親和層析凝膠過(guò)濾層析（體積排阻效應(yīng)）高速逆流層析（兩相分配） 優(yōu)點(diǎn)：分辨率高 缺點(diǎn)：存在吸附 優(yōu)點(diǎn)：沒(méi)有吸附 缺點(diǎn)：分辨率高蛋白質(zhì)純化與小分子純化的差別蛋白質(zhì)分子不同構(gòu)象之間存在能量差別，吸附到表面后會(huì)朝自由能減少的方向變化。若不改變洗脫條件，被吸附的蛋白質(zhì)永遠(yuǎn)不會(huì)被洗脫下來(lái)。小分子不同構(gòu)象之間的能量差別很小。不改變洗脫條件，小分子也能被洗脫下來(lái)，只是需要的時(shí)間比較長(zhǎng)進(jìn)行蛋白質(zhì)分離時(shí)，階梯洗脫往往有更好的效果溫度的影響 溫度對(duì)體系平衡狀態(tài)有影響 溫度越高對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)變化速率有影響123456.56.66.76.86.97.0273.15K275.65K278.15K280.65K283.15

46、KLinearfitofdatafor273.15KLinearfitofdatafor275.65KLinearfitofdatafor278.15KLinearfitofdatafor280.65KLinearfitofdatafor283.15Kln(proteinamount)Time(min)溫度對(duì)HBsAg在層析介質(zhì)表面解聚速率的影響不同溫度對(duì)于病毒顆粒純化效果的影響停留時(shí)間的影響停留時(shí)間，A：0min；B：30min；C：60min；D：90min02468101214160102030DAbsorbanceat280nm(mAU)Time(min)024681012141601

47、020 C024681012141601020 B024681012141601020P2AP1蛋白質(zhì)與介質(zhì)表面接觸的時(shí)間越長(zhǎng)，發(fā)生結(jié)構(gòu)變化的蛋白所占比例越多，或者發(fā)生的結(jié)構(gòu)變化越明顯鹽的類(lèi)型和濃度的影響Cl-之前的稱為kosmotropes（water structure maker）Cl-之前的稱為chaotropes（water structure breaker）鹽的類(lèi)型對(duì)于層析的影響非常復(fù)雜Hofmeister序列中靠前例子容易使HBsAg在溶液中聚集，但是能夠使其吸附于疏水層析介質(zhì)上；序列中靠后的鹽在溶液中對(duì)HBsAg穩(wěn)定，但是不能夠使其發(fā)生有效吸附?；旌鲜褂脙煞N鹽可以使HBsAg

48、吸附再介質(zhì)表面，又不會(huì)發(fā)生太大的結(jié)構(gòu)變化鹽的類(lèi)型對(duì)于HBsAg的影響載量的影響進(jìn)料量對(duì)于HBsAg收率的影響進(jìn)料量對(duì)于HBsAg結(jié)構(gòu)的影響隨著單位面積上蛋白質(zhì)的吸附量，蛋白質(zhì)分子之間擁擠作用可以減少其結(jié)構(gòu)變化。層析過(guò)程的放大放大過(guò)程受到反應(yīng)和傳質(zhì)兩個(gè)方面的影響吸附誘導(dǎo)的反應(yīng)和蛋白與介質(zhì)的接觸時(shí)間有關(guān)，由體積流速?zèng)Q定傳質(zhì)包括宏觀流動(dòng)和分子擴(kuò)散兩個(gè)方面，由線性流速?zèng)Q定保持柱子高度不變，擴(kuò)大直徑，按照線性流速放大可以保證反應(yīng)和傳質(zhì)都不發(fā)生變化分離純化三步曲步驟步驟純度純度 further removal of most proteins further removal of most nucleic

49、 acids further removal of endotoxins further removal of virusesinitial purificationstabilizationclarificationconcentration achieve final purity and safety additional safety measure3.精制精制1.捕獲捕獲2.中間純化中間純化綜合考慮各種因素n 最小化操作體積最小化操作體積n 最少化操作步驟最少化操作步驟n 組合不同機(jī)理分離技術(shù)組合不同機(jī)理分離技術(shù)分辨率分辨率處理量處理量回收率回收率速度速度重組乙肝病毒表面抗原純化工藝

50、IntermediatePurificationCCSButul-S Sephros 4FFDEAE Sepharose FFSepharose 4FFCapturePolishing最終純品的鑒定多種手段綜合表征表征二級(jí)結(jié)構(gòu)其它性質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)（側(cè)鏈微環(huán)境）四級(jí)結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)紫外圓二色譜紅外光譜拉曼光譜凝膠過(guò)濾高效液相多角度激光散射動(dòng)態(tài)光散射分析離心熒光光譜院子外圓二色譜二硫鍵、糖基化、N末端等等顆粒大小以及分布表面電勢(shì)蛋白在表面上結(jié)構(gòu)的原位表征H-D交換雙偏振極化干涉原子力顯微鏡幾個(gè)常被忽略的注意事項(xiàng)一定要先查閱文獻(xiàn)，再開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。不要馬上對(duì)介質(zhì)和實(shí)驗(yàn)條件展開(kāi)篩選，經(jīng)過(guò)數(shù)十年的積累，很少有蛋白質(zhì)的純化工

51、藝沒(méi)有任何人做過(guò)一定要保證物料的新鮮，尤其細(xì)胞破碎液必須馬上進(jìn)行試驗(yàn)（破碎后一周后物料的層析行為與剛破碎時(shí)的差異非常大），很多實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性不好不是因?yàn)榻橘|(zhì)或者緩沖液不穩(wěn)定，只是物料的時(shí)間放得時(shí)間長(zhǎng)了。緩沖溶液pH值的控制實(shí)際工藝舉例木糖還原酶的純化組分IV的綜合利用漢遜酵母表達(dá)乙肝病毒表面抗原的純化EV71病毒顆粒的純化木糖還原酶的純化方法-1Rizzi M, Erlemann P, Bui-Thanh NA, Dellweg H. Xylose fermentation by yeast 4. purification and kinetic studies of xylose reduce

52、tase from Pichia stipitis. Appl Microbiol Biotechnol. 1988, 29: 148-154. Dellweg研究小組的純化工藝木糖還原酶的純化方法-2Mayr P, Petschacher B, Nidetzky B. Xylose Reductase from the Basidiomycete Fungus Cryptococcus flavus: Purification, Steady-State Kinetic Characterization, and Detailed Analysis of the Substrate Bind

53、ing Pocket Using Structure-Activity Relationships. J. Biochem. 2003, 133: 553-562. Nidetzky研究小組的代表性純化工藝木糖還原酶的純化方法-3其他研究小組的代表性純化工藝Granstrm T, Airaksinen U, Wu XY, Leisola M. Candida guilliermondii grows on rare pentoses-implications for production of pure xylitol. Biotechnology Letters. 2002, 24: 507

54、-510. 工藝路線設(shè)計(jì)親和層析DEAE離子交換層析（生化中心）Phenyl疏水層析（生化中心）凝膠過(guò)濾層析優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)、純化倍數(shù)高缺點(diǎn)：自己制備離子交換層析的優(yōu)化pH值僅在6.5-7.5之間穩(wěn)定鹽濃度載量再生條件最大載量：5ml酵母培養(yǎng)液/ml介質(zhì)1M NaCl，20乙醇1M NaCl，20乙醇，1M NaOH收率由70降到50收率可保持在70疏水相互作用層析的優(yōu)化鹽濃度停留時(shí)間載量首先對(duì)介質(zhì)進(jìn)行篩選Phenyl-1Phenyl-2Phenyl-3工藝整合層析譜圖離子交換層析譜圖疏水相互作用層析譜圖介質(zhì)：DEAE (生化中心)；柱子：13cm5.5cm I.D.；CV300ml流速：15m

55、l/min；進(jìn)料量：1.2-1.3L酵母培養(yǎng)液介質(zhì)：Phenyl（生化中心）；柱子： 9cm4.0cm I.D.；CV113ml流速：15-18ml/min；進(jìn)料量： 1.2-1.3L酵母培養(yǎng)液產(chǎn)品鑒定：HPSEC-UVConditions: TSK G3000 SW (300 mm7.5 mm I.D.) with TSK GPW Guardcolumn (75 mm7.5 mm, I. D.); eluted by PBS (0.1 M PB added with 0.1 M Na2SO4, pH 6.8) at room temperature (20-25 C) with 0.5 ml

56、/min flow rate; 100 ml of injection volume. 離子交換層析主要活性峰疏水層析主要活性峰產(chǎn)品鑒定：SDS-PAGE12341：酵母破碎液上清2：離子交換層析主要活性峰3：疏水相互作用層析主要活性峰4：marker膠濃度：15%染色方法：銀染每個(gè)條帶上樣量為2mg31.0kDa43.0kDa66.2kDa97.4kDa兔肌乳酸脫氫酶的純化Hitrap的高效使用12345678910所建立的工藝最終產(chǎn)品中含有蘋(píng)果酸脫氫酶，如何去除組分IV的綜合利用提取工藝170kDa130kDa 95kDa 72kDa 55kDa 43kDa 34kDa 26kDaa2-巨

57、球蛋白銅藍(lán)蛋白C1酯酶抑制劑轉(zhuǎn)鐵蛋白白蛋白ATIII結(jié)合珠蛋白載脂蛋白A1a1-抗胰蛋白酶，IgG轉(zhuǎn)鐵蛋白IgGHSA結(jié)合珠蛋白a1-抗胰蛋白酶Apo-A1銅藍(lán)蛋白組分IV溶出蛋白在離子交換層析上的行為乙肝病毒表面抗原的純化工作特點(diǎn)：用機(jī)理研究中的發(fā)現(xiàn)指導(dǎo)于實(shí)際生產(chǎn)中調(diào)節(jié)溶劑環(huán)境去除表面活性劑調(diào)節(jié)鹽的類(lèi)型減少HBsAg在疏水層析中的損失調(diào)整整體工藝減少HBsAg在純化過(guò)程中的聚集和解聚EV71病毒顆粒的純化不同工藝制備得到的純品分析1-maker；2-改進(jìn)后工藝；3-改進(jìn)前工藝25C目標(biāo)產(chǎn)物15C目標(biāo)產(chǎn)物5C目標(biāo)產(chǎn)物EV71純化工藝的建立以及純品的獲得使得后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可以開(kāi)展，推動(dòng)其臨床前研

58、究170kDa130kDa95kDa72kDa55kDa43kDa34kDa26kDa123蛋白質(zhì)變性蛋白質(zhì)變性n蛋白質(zhì)變性過(guò)程 n蛋白質(zhì)變性溫度蛋白質(zhì)在一定的溫度下會(huì)變性。在一個(gè)熱變性過(guò)程中，有50%的蛋白質(zhì)分子變性（此時(shí)）時(shí)的溫度被稱為變性溫度（unfolding / melting / denaturation / transition tmeperature）。蛋白的熱變性過(guò)程通常是吸熱的。一些蛋白質(zhì)的變性溫度值列于表1中，大都在40-80 之間。aggregatedAenaturedunfolded/dUnativeN蛋白質(zhì)聚集蛋白質(zhì)聚集最近的研究表明聚合可能發(fā)生于蛋白質(zhì)特定過(guò)渡態(tài)構(gòu)

59、象，而不是非特異性的結(jié)合。聚集過(guò)程大體分為三個(gè)步驟：引發(fā)，傳遞和終止。蛋白質(zhì)的聚合可以有很多的物理因素誘導(dǎo)，比如溫度，離子強(qiáng)度，渦流，表面或界面吸附等等。這些因素可以增加蛋白的疏水表面，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚合。很多試劑都可以用來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)聚合的機(jī)理。SDS，鹽酸胍，脲等變性劑可以用來(lái)驗(yàn)證蛋白質(zhì)是否為共價(jià)鍵聚合。用這種方法證實(shí)的非共價(jià)聚合蛋白包括胰凝乳蛋白酶原，胰島素和白介素1。DTT，巰基乙醇等還原試劑可以用來(lái)確定蛋白質(zhì)的聚合是否涉及二硫鍵。Simplified model of correct folding versus misfolding and aggregation. The corr

60、ect protein folding pathway (1) often competes with misfolding (2) and aggregation (3). Aggregation occurs among intermediates with exposed hydrophobic patches, which are buried in the correctly folded protein (blue lines, hydrophilic solvent-exposed parts of the protein; red lines: hydrophobic patches)