分子生物學綜合性大實驗

1、題目：分子生物學綜合性大實驗姓名： 張珂彬 學號： 1300602043 班級： 2013高原生物學菁英班 指導老師： 段瑞君 目錄前言21材料與方法21.1實驗材料21.2實驗試劑及儀器21.2.1DNA提取31.2.2PCR擴增DNA31.2.3PCR產(chǎn)物回收31.2.4重組質(zhì)粒的連接31.2.5 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及藍白斑篩選41.2.6質(zhì)粒DNA抽提41.2.7DNA酶切41.2.8菌液PCR41.3研究方法與實驗步驟51.3.1DNA提?。–TAB法）51.3.2瓊脂糖凝膠電泳51.3.3PCR擴增DNA61.3.4 PCR產(chǎn)物回收71.3.5重組質(zhì)粒的連接、轉(zhuǎn)化與藍白斑篩選71.3.6

2、質(zhì)粒DNA抽提91.3.7DNA酶切91.3.8菌液PCR92.結(jié)果與分析102.1植物基因組DNA的提?。–TAB法）102.2PCR基因擴增DNA102.3 PCR產(chǎn)物的回收112.4重組質(zhì)粒的連接、轉(zhuǎn)化與藍白斑篩選112.5質(zhì)粒抽提與酶切122.6菌液PCR123結(jié)論12前言青稞actin基因的克隆摘要：分子克隆是在體外對DNA分子按照既定的目的和方案進行人工重組，將重組分子導入到合適的受體細胞中，使其在細胞中擴增和繁殖，以獲得DNA分子大量復制，并是受體細胞獲得新的遺傳特征的過程。其基本原理是將編碼某一多肽或蛋白質(zhì)的基因（外源基因）組裝到細菌質(zhì)粒（質(zhì)粒是細菌染色體外的雙鏈環(huán)狀DNA分子

3、）中，再將這種質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌體內(nèi)，這樣重組質(zhì)粒就隨大腸桿菌的增值而復制，從而表達出外源基因編碼相應多肽或蛋白質(zhì)。關鍵詞:DNA提取、PCR基因擴增、連接、轉(zhuǎn)化篩選、酶切Abstract: Molecular cloning of DNA molecules in vitro in accordance with established objectives and programs of artificial recombination, the recombinant molecule into an appropriate recipient cell to amplify and mu

4、ltiply in the cells in order to obtain a large number of replication DNA molecule, andIt is the process of receptor cells to acquire new genetic characteristics. The basic principle is the gene encoding a polypeptide or protein (foreign gene) is assembled to the bacterial plasmid (double-stranded ci

5、rcular DNA plasmid molecule outside the bacterial chromosome) in this plasmid was then transformed into Escherichia coli in vivo, thus the recombinant plasmid to replicate with the value of the E. coli, go out to express the corresponding gene encodes a polypeptide or protein.Keywords: DNA extractio

6、n, PCR gene amplification, ligation, transformation filtering, digestion1材料與方法1.1實驗材料青稞actin基因1.2實驗試劑及儀器1.2.1DNA提取儀器試劑移液器及吸頭1.5ml離心管陶瓷研缽水浴鍋臺式高速離心機。2% CTAB 抽提緩沖溶液氯仿異戊醇（24：1）異丙醇3 M的醋酸鈉（pH5.2）無水乙醇、75%乙醇TE（10mmol/L Tris·Cl，1mmol/L EDTA，pH8.0）緩沖液凝膠電泳上樣緩沖液（0.4%溴酚藍、50%蔗糖指示劑溶液）溴化乙錠溶液（劇毒）（10mg/ml溶液）1

7、15;TAE凝膠電泳緩沖液1.2.2PCR擴增DNA儀器試劑PCR熱循環(huán)儀瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)吸頭離心管1.0上游引物primerU 1.0M下游引物permerL DNA 模板 dd H2O Maxter Mix1.2.3PCR產(chǎn)物回收儀器試劑瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)紫外觀察分析儀（波長302 nm）離心機（Eppendoff）單面刀片TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.050×TAEDdH2O1.2.4重組質(zhì)粒的連接儀器試劑恒溫烘箱恒溫水浴箱10×T4 DNA 連接酶 Buffer ddH2O1.2.5 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及藍

8、白斑篩選儀器試劑恒溫烘箱恒溫水浴箱10×T4 DNA 連接酶 Buffer ddH2O1.2.6質(zhì)粒DNA抽提儀器試劑eppendorf管微量取液器(20l,200l,1000l)臺式高速離心機渦旋振蕩器LB液體培養(yǎng)基溶液溶液溶液 RNA酶A 飽和酚:氯仿 1:1 溶液：50mM 葡萄糖；25mM Tris·HCl（pH8.0）；10mM EDTA溶液：（新鮮配制）0.2N NaOH；1% SDS溶液：5M KAC 10ml；冰醋酸 11.5ml；水 28.5ml1.2.7DNA酶切儀器試劑微量移液器離心機恒溫水浴箱Pst-IddH2O1.2.8菌液PCR儀器試劑PCR熱循

9、環(huán)儀瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)吸頭離心管1.0上游引物primerU 1.0M下游引物permerL DNA 模板 dd H2O Maxter Mix1.3研究方法與實驗步驟1.3.1DNA提?。–TAB法）（1）原理通常采用機械研磨的方法破碎植物的組織和細胞，由于植物細胞勻漿含有多種酶類(尤其是氧化酶類)對DNA 的抽提產(chǎn)生不利的影響，在抽提緩沖液中需加入抗氧化劑或強還原劑(如巰基乙醇)以降低這些酶類的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并減少研磨過程中各種酶類的作用。十二烷基肌酸鈉(sarkosyl) 、十六烷基三甲基溴化銨(hexadyltrimethyl ammomum bromide，簡稱為C

10、TAB)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，簡稱SDS)等離子型表面活性劑，能溶解細胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使DNA 得以游離出來。再加入苯酚和氯仿等有機溶劑，能使蛋白質(zhì)變性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很強，經(jīng)離心后即可從抽提液中除去細胞碎片和大部分蛋白質(zhì)。上清液中加入無水乙醇使DNA 沉淀，沉淀DNA溶于TE 溶液中，即得植物總DNA 溶液。（2）步驟首先將植物組織洗凈，2%CTAB抽提緩沖液在65水浴中預熱。取少量葉片（約0.1-1g）置于滅過菌的研缽中，磨至粉狀，葉片磨得越細越好。加入700µL的2%CTAB抽提緩沖液，

11、輕輕攪動；將磨碎液吸入1.5mL的滅菌離心管中，磨碎液的高度約占管的三分之二，混合使之充分搖勻于65，60min (時間長,DNA 產(chǎn)量高)，不時混勻（每5min反轉(zhuǎn)搖勻一次）；冷卻2 min后，加入等體積的氯仿-異戊醇（24：1）至滿管，劇烈振蕩23 min，使兩者混合均勻；放入離心機中10 000 rpm離心15min，與此同時，將600µL的異丙醇加入另一新的滅菌離心管中。移液器輕輕地吸取上清液，轉(zhuǎn)入含有異丙醇的離心管內(nèi)，將離心管慢慢上下?lián)u動30 s，使異丙醇與水層充分混合至能見到DNA絮狀物,-20放置30 min；10000 rpm離心5 min后，立即倒掉液體，注意勿將白

12、色DNA沉淀倒出，將離心管倒立于鋪開的濾紙上,60 s后，直立離心管，加入720µL的75%乙醇及80µL5 M的醋酸鈉，輕轉(zhuǎn)動，用手指彈管尖，使沉淀與管底的DNA塊狀物浮游于液體中；放置15 min，使DNA塊狀物的不純物溶解；10000 rpm離心1 min后，倒掉液體，再加入800 µL 75%的乙醇，將DNA再洗 15 min； 10000 rpm離心30 s后，立即倒掉液體，將離心管倒立于鋪開的紙巾上；數(shù)分鐘后，直加入50µL0.5 × TE(含RNase)緩沖液（超純水代替），使DNA溶解，置于37恒溫箱約30min，使RNA消解；

13、 將提取的DNA溶液使用核酸檢測儀檢測濃度，再使用1的瓊脂糖電泳鑒定。 1.3.2瓊脂糖凝膠電泳1g 瓊脂糖加入100mL 1×TAE電泳緩沖液中,搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解.(冷卻到60,加入2µL的10mg/mL EB,并搖勻)。將凝膠板放入凝膠槽中,插入梳子,將溶解的瓊脂糖(約50)倒入凝膠槽中,室溫冷卻凝固，小心垂直向上拔出梳子。充分凝固后，將凝膠置入電泳槽中,加1×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm,用移液打開電源開關,調(diào)節(jié)電壓至120V,可見到溴酚藍條帶由負極向正極移動,電泳約1530min紫外燈下觀察。其余DNA樣品保存在-20

14、76;C備用。這次電泳主要是檢測所提取的DNA的質(zhì)量和濃度。1.3.3PCR擴增DNA（1）原理聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)是一種選擇性體外擴增DNA的方法，其基本原理類似于DNA的天然復制過程。 它包括: 變性(Denature) 、 退火(Anneal)和延伸(Extension)三個基本步驟。這三個基本步驟組成一輪循環(huán)，理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴增一倍，這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA又可作為下一輪循環(huán)的模板，所以經(jīng)2535輪循環(huán)就可使DNA擴增達106 倍。PCR反應包括三個基本步驟變性、退火和延伸Step1. 變性：加熱使模板DNA在高溫

15、下（94）變性，雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈，即變性階段。Step2. 退火：溶液溫度降至5060，模板DNA與引物按堿基配對原則互補結(jié)合，即退火階段。Step3. 延伸：溶液反應溫度升至72，耐熱DNA聚合酶以單鏈為模板，利用引物的3-OH，以反應混合物中的4種脫氧核苷三磷酸（dNTP）為底物，按53方向復制出互補DNA，即引物的延伸階段。 典型的PCR反應體系由如下組分組成：DNA模板、反應緩沖液、dNTP、MgCl2、兩個DNA引物、耐熱Taq聚合酶 PCR反應體系：PCR擴增反應總量25L1.0上游引物primerU1L1.0M下游引物permerL1LDNA 模板1Ldd H2O

16、9.5LPCR Maxter Mix12.5L按下述程序進行PCR擴增: 95 預變性 3 min； 95 變性 45s； 60 退火 45s； 72 延伸 1 min； 重復步驟24, 30次； 72 延伸 10 min； End 1.3.4 PCR產(chǎn)物回收 將單一的目的DNA條帶切下，放入干凈離心管中，稱重； 加入三倍體積溶膠液（0.1g:300l），50-55水浴放置10min,不斷溫和翻轉(zhuǎn) ，使膠塊充分溶解；注：溶膠時，若溶液變?yōu)榧t色（正常為黃色），可加入10-30l3M醋酸鈉（PH=5.2）使之變?yōu)榈S色；將溶液加入吸附柱中，12000rpm離心30-60s，倒掉廢液；注：溶液冷卻后

17、再過柱再加入600l潭洗液（加無水乙醇），12000rpm離心1min,棄廢液；再次加入600l潭洗液，12000rpm離心1min,棄廢液；空管離心12000rpm2min，除去潭洗液，放置數(shù)分鐘；將吸附柱放入一個干凈的離心管中，滴加適量65水浴預熱的洗脫液，室溫放置2min,12000rpm離心1min；注：可將離心管洗脫液重新加入吸附柱，再次離心；洗脫液體積不應少于30l，PH保持在7.0-8.5；DNA產(chǎn)物-20保存。1.3.5重組質(zhì)粒的連接、轉(zhuǎn)化與藍白斑篩選（1）連接使用PUCm-T試劑盒進行連接，并使用生工商品化大腸桿菌感受態(tài)細胞進行轉(zhuǎn)化實驗。連接體系：總體積10L目的片段6LPU

18、Cm-T Vector1L10Ligation Buffer1L50PEG40001LT4DNA Ligase1L（2）轉(zhuǎn)化（3）篩選 將上述菌液以3000 rpm離心20秒，棄大部分上清，用剩余的100l上清重懸菌體，涂布于含Amp的篩選平板上（已涂布IPTG 7µl和X-Gal 40 µl），正面向上放置半小時,待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37培養(yǎng)16-24小時。同時做兩個對照: 對照組1: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應沒有菌落出現(xiàn)。對照組2: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,但涂板時只取5l

19、 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應產(chǎn)生大量菌落。1.3.6質(zhì)粒DNA抽提取1.5ml培養(yǎng)液倒入1.5ml eppendorf管中,4下12000g離心30秒。 棄上清,將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘,使液體流盡。 菌體沉淀重懸浮于100l溶液中(需劇烈振蕩),室溫下放置5-10分鐘。 加入新配制的溶液200l, 蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數(shù)次,以混勻內(nèi)容物(千萬不要振蕩),冰浴5分鐘。 加入150l預冷的溶液,蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩10秒,使沉淀混勻,冰浴上清液移入干凈eppendorf管中,加入等體積的酚/氯仿(1:1),振蕩混勻,4下12000g離心5

20、分鐘。 將水相移入干凈eppendorf管中,加入2倍體積的無水乙醇,振蕩混勻后置于-20冰箱中20分鐘，然后4下12000g離心10分鐘。 棄上清,將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出,加入1ml 70乙醇洗沉淀一次,4下12000g離心5-10分鐘。 吸除上清液,將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡,真空干燥10分鐘或室溫干燥。 將沉淀溶于20l TE緩沖液(pH8.0，含20g /ml RNaseA)中，儲于-20冰箱中。 1.3.7DNA酶切在一個潔凈的1.5 ml離心管中混勻下列反應物：總體積20lEcoR1l10×Buffer2l質(zhì)粒DNA10lHind1lddH2O6l將反應物置于37水浴，溫浴13小時。 加入5 µl加樣緩沖液，混勻后即可加樣進行電泳