最新口腔上皮細(xì)胞的顯微鏡觀察

1、一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)熒光顯微鏡的工作原理及使用方法學(xué)習(xí)熒光顯微鏡的工作原理及使用方法了解熒光探針了解熒光探針rhodamine 123 rhodamine 123 和和hoechst33342 hoechst33342 與細(xì)與細(xì)胞成分的結(jié)合特性和光譜特性胞成分的結(jié)合特性和光譜特性二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理1. 1.熒光顯微鏡熒光顯微鏡 細(xì)胞參量細(xì)胞參量熒光探針熒光探針 吸收吸收/發(fā)射發(fā)射 nm特性特性dna和和rnapropidum iodide(pi) 535/617 紅色熒光紅色熒光 嵌入核酸雙鏈間嵌入核酸雙鏈間,只能標(biāo)記死細(xì)胞只能標(biāo)記死細(xì)胞.用于用于 染色染色體體,細(xì)胞觀察細(xì)胞觀察,分

2、辨死活細(xì)胞和細(xì)胞周期研究分辨死活細(xì)胞和細(xì)胞周期研究ethidium bromide(eb)518/605紅色熒光紅色熒光嵌入核酸雙鏈間嵌入核酸雙鏈間,只能標(biāo)記死細(xì)胞只能標(biāo)記死細(xì)胞.用于電泳用于電泳分析分析,染色體觀察染色體觀察dapi 358/461 藍(lán)色熒光藍(lán)色熒光半通透細(xì)胞半通透細(xì)胞,結(jié)合于結(jié)合于dna的的at堿基對堿基對.用于細(xì)用于細(xì)胞周期的研究胞周期的研究,染色體和細(xì)胞核的觀察染色體和細(xì)胞核的觀察hoechst33342 350/461 藍(lán)色熒藍(lán)色熒光光結(jié)合于結(jié)合于dna的的at堿基對堿基對,可進(jìn)入活細(xì)胞可進(jìn)入活細(xì)胞,用于用于細(xì)胞周期的研究細(xì)胞周期的研究,染色體和細(xì)胞核的觀察染色體和細(xì)

3、胞核的觀察蛋白和抗體的蛋白和抗體的耦聯(lián)探針耦聯(lián)探針fitc 494/518 綠色熒光綠色熒光染死細(xì)胞染死細(xì)胞,對對ph值變化不敏感值變化不敏感texas red 595/615 紅色熒光紅色熒光多參量細(xì)胞標(biāo)記多參量細(xì)胞標(biāo)記溶酶體溶酶體neutral red 541/640 紅色熒光紅色熒光探針微偏堿性探針微偏堿性,可標(biāo)記溶酶體等酸性細(xì)可標(biāo)記溶酶體等酸性細(xì)胞器胞器線粒體線粒體rhodamine 123 507/529 黃綠色熒光黃綠色熒光可進(jìn)入活細(xì)胞可進(jìn)入活細(xì)胞,陽離子性陽離子性,攝入快攝入快,淬滅快淬滅快,無毒性無毒性常用熒光探針介紹常用熒光探針介紹 hoechst33342 hoechst3

4、3342和和rhodamine 123rhodamine 123 ho.33342ho.33342是一種親脂性物質(zhì)，能與是一種親脂性物質(zhì)，能與dnadna特異性特異性結(jié)合的熒光探針，所以被大量用于活細(xì)胞的觀察和結(jié)合的熒光探針，所以被大量用于活細(xì)胞的觀察和定量的研究。熒光激發(fā)和發(fā)射特性分別為定量的研究。熒光激發(fā)和發(fā)射特性分別為350nm350nm和和461nm461nm。 羅丹明羅丹明123123是一種親脂性的陽離子熒光探針。用是一種親脂性的陽離子熒光探針。用它來標(biāo)記線粒體是由于線粒體的基質(zhì)對于膜間隙具它來標(biāo)記線粒體是由于線粒體的基質(zhì)對于膜間隙具有負(fù)電荷，而羅丹明有負(fù)電荷，而羅丹明123123具

5、有正電荷，二者電性相吸。具有正電荷，二者電性相吸。所以能較好地觀察線粒體的形態(tài)變化。熒光激發(fā)和所以能較好地觀察線粒體的形態(tài)變化。熒光激發(fā)和發(fā)射特性為發(fā)射特性為507nm507nm和和529nm529nm。l 儀器儀器 熒光顯微鏡，倒置顯微鏡熒光顯微鏡，倒置顯微鏡材料材料 a549a549、wi-38 pc-3wi-38 pc-3、載玻片，蓋片，滴管，濾紙、載玻片，蓋片，滴管，濾紙試劑試劑pbspbs緩沖液緩沖液ph7.4ph7.4ho.33342ho.33342儲存液儲存液:1mg/ml(:1mg/ml(溶于溶于pbs)pbs)羅丹明羅丹明123123儲存液儲存液: 1mg/ml(: 1mg/

6、ml(溶于甲醇溶于甲醇) )將蓋玻片上的細(xì)胞用將蓋玻片上的細(xì)胞用pbspbs緩沖液輕輕漂洗緩沖液輕輕漂洗2 2次次4.4.在在parafilm parafilm 膜上分別滴加膜上分別滴加ho.33342ho.33342和羅丹明和羅丹明123123工作工作液各液各1010 l l，將蓋玻片上的細(xì)胞倒扣在，將蓋玻片上的細(xì)胞倒扣在parafilm parafilm 膜上室溫膜上室溫暗處孵育暗處孵育10min10min。5.5.在在parafilm parafilm 膜上加膜上加pbspbs緩沖液，待蓋玻片被沖起后，緩沖液，待蓋玻片被沖起后，再輕輕揭下蓋玻片再輕輕揭下蓋玻片, ,用用pbspbs緩沖液

7、輕輕漂洗緩沖液輕輕漂洗2 2次。次。6.6.利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核、線粒體。利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核、線粒體。配制配制ho.33342和羅丹明和羅丹明123 工作液工作液:ho.33342 (10g/ml), 羅丹明羅丹明123(10g/ml)（溶于（溶于pbs緩沖液，緩沖液，ph7.4）將蓋玻片上的細(xì)胞用將蓋玻片上的細(xì)胞用pbspbs緩沖液輕輕漂洗緩沖液輕輕漂洗2 2次，次，分別滴加分別滴加ho.33342ho.33342和羅丹明和羅丹明123123工作液各工作液各1010 l l，室溫暗處孵育室溫暗處孵育10min 用用 pbs緩沖液輕輕漂洗緩沖液輕輕漂洗2次，放在載玻片上制成的次，放在載玻片上制成的小室上小室上利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核、線粒體利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核、線粒體將腫瘤細(xì)胞和正常組織細(xì)胞培養(yǎng)到小蓋玻片上將腫瘤細(xì)胞和正常組織細(xì)胞培養(yǎng)到小蓋玻