BD流式全面介紹

1、流式細(xì)胞術(shù)簡(jiǎn)介流式細(xì)胞術(shù)簡(jiǎn)介For FCM Training 2流式細(xì)胞術(shù)=流式細(xì)胞術(shù)（流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry, 簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱FCM）是一種可）是一種可以快速、準(zhǔn)確、客觀，并且同時(shí)檢測(cè)單個(gè)微粒（通常以快速、準(zhǔn)確、客觀，并且同時(shí)檢測(cè)單個(gè)微粒（通常是細(xì)胞）的多項(xiàng)特性的技術(shù)，同時(shí)可以對(duì)特定群體加是細(xì)胞）的多項(xiàng)特性的技術(shù)，同時(shí)可以對(duì)特定群體加以分選以分選=研究對(duì)象為生物顆粒，如各種細(xì)胞、染色體、微生物、研究對(duì)象為生物顆粒，如各種細(xì)胞、染色體、微生物、及人工合成微球等及人工合成微球等=研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征，并加以研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征，并加以定量定量 3流

2、式細(xì)胞儀系統(tǒng)簡(jiǎn)介簡(jiǎn)介通過流式細(xì)胞儀我們可以得到以下信息通過流式細(xì)胞儀我們可以得到以下信息 -相對(duì)細(xì)胞大小相對(duì)細(xì)胞大小 - 相對(duì)細(xì)胞顆粒密度和內(nèi)部復(fù)雜度相對(duì)細(xì)胞顆粒密度和內(nèi)部復(fù)雜度 - 染色過細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度染色過細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度 4Injector TipSheath fluid 5流式細(xì)胞儀的光信號(hào)散射光信號(hào)熒光信號(hào) 61. 散射光信號(hào)散射光信號(hào)前向角散射光（前向角散射光（FSC,Forward ScatterFSC,Forward Scatter） 入射激光的同向散射光信號(hào)入射激光的同向散射光信號(hào) 細(xì)胞相細(xì)胞相 對(duì)大小及其表面積。對(duì)大小及其表面積。 側(cè)向角散射（側(cè)向角散射（SSC, S

3、ide ScatterSSC, Side Scatter） 入射激光入射激光9090 角的角的散射光信號(hào)散射光信號(hào) 細(xì)胞粒度及細(xì)胞內(nèi)相對(duì)復(fù)雜性。細(xì)胞粒度及細(xì)胞內(nèi)相對(duì)復(fù)雜性。 7前向角散射光 FSCFALS SensorLaser 8側(cè)向角散射光SSCFALS Sensor90LS SensorLaser 9散射光散射光能被用來區(qū)分不同細(xì)胞群體的基本形態(tài)散射光能被用來區(qū)分不同細(xì)胞群體的基本形態(tài)上的差異上的差異 -通常使用通常使用“散點(diǎn)圖散點(diǎn)圖”來看散射光信號(hào)來看散射光信號(hào) -散點(diǎn)圖上的一個(gè)點(diǎn)就代表一個(gè)細(xì)胞顆粒的散點(diǎn)圖上的一個(gè)點(diǎn)就代表一個(gè)細(xì)胞顆粒的數(shù)據(jù)數(shù)據(jù) 10散點(diǎn)圖Dot Plotlysed w

4、hole blood 11Review QuestionDead cells are known to be smaller and to exhibit more internal complexity than live cells. Which of the populations on this plot would you expect to be dead? 122. 熒光信號(hào)熒光信號(hào)=熒光素吸收激光能量熒光素吸收激光能量=熒光素將吸收能量釋放，轉(zhuǎn)換為熒光素將吸收能量釋放，轉(zhuǎn)換為 振動(dòng)能和熱能振動(dòng)能和熱能 釋放較入射光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光量子釋放較入射光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光量子=熒光素與特異抗體結(jié)

5、合熒光素與特異抗體結(jié)合=熒光抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合越多，產(chǎn)生的熒光信熒光抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合越多，產(chǎn)生的熒光信號(hào)越強(qiáng)號(hào)越強(qiáng) 13熒光檢測(cè)器FreqFluorescenceFALS SensorFluorescence detector(PMT3, PMT4 etc.) 14Two-Color Cell AnalysisWhich of the three populations has the most Ab A binding sites?Ab AAb B 15現(xiàn)代流式細(xì)胞儀包括液流系統(tǒng)液流系統(tǒng) 聚焦細(xì)胞以供檢測(cè)光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng) 激發(fā)和收集光信號(hào) 電子系統(tǒng)電子系統(tǒng) 將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，并使其數(shù)字

6、化以供計(jì)算機(jī)分析 16液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)將樣本懸液聚焦在光源的中心處 17Sample Flow in Optical CuvetteSampleLaminarFlowLow Sample Flow Rate12 mL/minSheathSheathSampleLaminarFlowSheathSheathOptical CuvetteHigh Sample Flow Rate60 mL/min 18Review QuestionWhich of the following would cause disturbance in the laminar flow of the optical cu

7、vette? bubblescellular concentrationA. sample flow rate 19Optics Excitation optics consist of:- Lasers- Lenses and mirrors that route the laser light to the fluidic stream Collection optics consist of:Filters that direct the signals to the appropriate optical detectors 20Optical Filters460 500 54046

8、0 500 540460 500 540LongpassShortpassBandpass 21FACSCalibur光路圖 22OpticsLaserLaserFluorochromesFluorochromesDetector Detector ParameterParameterFilterFilter 23ElectronicsConverts analog signals to proportional digital signals Computes Height for each pulseCalculates width and area Interfaces with the

9、 computer for data transfer 24Creation of a Voltage Pulse - Analog SignalTimeVoltageTimeVoltageTimeVoltage 25Quantification of a Voltage PulseTimeVoltsPulse AreaPulse HeightPulse Width0Height is a measurement for all parameters.Width = Area/Height 26Effect of the Instrument Controls on the Data 27Re

10、view FL2FL1SSCFSCFL4FL3 28Review QuestionsWhich of the following fluorochromes cannot be used with the FACSCalibur?DAPI (ex. 345 nm, emits 455 nm)Propidium Iodide (ex. 536 nm, emits 617 nm)Alexa Fluor 647 (ex. 650 nm, emits 668 nm)What are the three measurements of a particle that can be determined

11、by FACSCalibur?Briefly describe the functions of the fluidics, optics, and electronics systems. 29Review QuestionsWhat would happen to the population below if you increased the Red parameter value in the Instrument controls? 30Review QuestionsWhich instrument components ensure that the fluorescence

12、signal of a specific fluorochrome is only measured by a designated detector? For example, APC is only measured by the FL4 detector. 31樣本處理 32細(xì)胞懸液的制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞懸液： 分離分離PBMC、PRP等：操作復(fù)雜，分離、離心步驟導(dǎo)致細(xì)胞等：操作復(fù)雜，分離、離心步驟導(dǎo)致細(xì)胞特定群體丟失，并可能引入某些誤差特定群體丟失，并可能引入某些誤差 直接使用外周血、骨髓：最接近生理狀況，操作簡(jiǎn)便，樣本直接使用外周血、骨髓：最接近生理狀況，操作簡(jiǎn)便，樣本用血量小用血量小

13、 灌洗液、體腔積液灌洗液、體腔積液 培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞系培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞系實(shí)體組織：實(shí)體組織： 病理組織：新鮮樣本病理組織：新鮮樣本/石蠟包埋樣本石蠟包埋樣本 針吸組織：新鮮樣本針吸組織：新鮮樣本鞘液、洗液等：清潔無顆粒雜質(zhì)鞘液、洗液等：清潔無顆粒雜質(zhì) 33步驟一： 選擇合適的熒光染料必須能夠被流式細(xì)胞儀上所配備的激光器所激發(fā)激發(fā)的光譜必須在儀器上濾光片能夠接受的合適范圍內(nèi)熒光素光譜的重疊應(yīng)當(dāng)盡量減少 34熒光產(chǎn)生過程 35Propidium Iodide400 nm500 nm600 nm700 nmR el at i ve I nt ensi t yPIExcitationEmisson300

14、nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm 36Fluorescein (FITC)400 nm500 nm600 nm700 nmR el at i ve I nt ensi t yWavelength300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm 37300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nmPhycoerytherin (PE)Protein 38Allophycocyanin (APC)300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm 39FITC和和PE熒光熒光光譜光譜 40補(bǔ)償調(diào)節(jié)前后對(duì)比補(bǔ)償調(diào)節(jié)

15、前后對(duì)比FL1FL2 41步驟二： 染色體積溫度孵育時(shí)間對(duì)照 42直接染色 Fluorescent probe attached to antibody Specific signal: weak Nonspecific binding: low 43間接染色 Fluorescent probe attached to a 2nd antibody Specific signal: strong, 5-6 2nd Ab/each 1st Ab; Nonspecific binding: high 44Avidin-Biotin method Ibiotinylated primary Abbi

16、otinavidinbiotinylated dye 45步驟三： 數(shù)據(jù)收集和分析畫圖尋找目標(biāo)細(xì)胞調(diào)整儀器設(shè)置到合適的狀態(tài)我們可以得到怎樣的結(jié)果？它們意味著什么？ 46儀器設(shè)置調(diào)節(jié)儀器設(shè)置調(diào)節(jié)1. 用未染色細(xì)胞調(diào)整儀器用未染色細(xì)胞調(diào)整儀器PMT電壓電壓2. 用單染色的細(xì)胞調(diào)節(jié)儀器補(bǔ)償用單染色的細(xì)胞調(diào)節(jié)儀器補(bǔ)償 47關(guān)于同型對(duì)照例：一個(gè)雙色染色的實(shí)驗(yàn) 抗體A FITC，抗體B PE 對(duì)應(yīng)的同型對(duì)照是IgG1 FITC,IgG1 PE那么需要準(zhǔn)備的是陰性對(duì)照：細(xì)胞加上IgG1 FITC,IgG1 PE單陽(yáng)性對(duì)照： FITC: 細(xì)胞加上Ab A FITC, IgG1 PE PE: 細(xì)胞加上Ab B

17、PE, IgG1 FITC 48數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析設(shè)門設(shè)定陰性與陽(yáng)性群體的界限確定陽(yáng)性與陰性細(xì)胞群體統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性或陰性細(xì)胞群體的百分率，平均熒光值，絕對(duì)數(shù)或抗體結(jié)合數(shù) 49如何設(shè)定陰性與陽(yáng)性的界限如何設(shè)定陰性與陽(yáng)性的界限 50 51 52細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞結(jié)構(gòu)=細(xì)胞大小細(xì)胞大小=細(xì)胞粒度細(xì)胞粒度=細(xì)胞表面面積細(xì)胞表面面積=核漿比例核漿比例=DNA含量與細(xì)胞周期含量與細(xì)胞周期=RNA含量含量=蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量=染色體分析染色體分析 細(xì)胞功能細(xì)胞功能=細(xì)胞表面細(xì)胞表面/胞漿胞漿/核的特異核的特異性抗原性抗原=細(xì)胞活性細(xì)胞活性=細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子=酶活性酶活性=激素結(jié)合位點(diǎn)激素結(jié)合位點(diǎn)=細(xì)胞受體細(xì)

18、胞受體=細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡在上述信號(hào)基礎(chǔ)上的細(xì)胞分選在上述信號(hào)基礎(chǔ)上的細(xì)胞分選流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞學(xué)應(yīng)用 53流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用=HIV免疫分型，免疫分型，CD4絕對(duì)計(jì)數(shù)絕對(duì)計(jì)數(shù)=白血病和淋巴瘤的免疫分型白血病和淋巴瘤的免疫分型=腫瘤的細(xì)胞周期和倍體分析腫瘤的細(xì)胞周期和倍體分析=網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)=細(xì)胞移植的交叉配型和免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)細(xì)胞移植的交叉配型和免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)=干細(xì)胞計(jì)數(shù)干細(xì)胞計(jì)數(shù)=殘量白血病細(xì)胞檢查殘量白血病細(xì)胞檢查=HLA-B27檢查檢查=血小板功能及相關(guān)疾病血小板功能及相關(guān)疾病 54流式細(xì)胞儀的科研應(yīng)用=免疫功能研究免疫功能研究=癌癥病人的多藥耐藥性癌癥病人的多藥耐藥性=細(xì)胞動(dòng)力

19、學(xué)功能研究細(xì)胞動(dòng)力學(xué)功能研究=動(dòng)物性別篩選動(dòng)物性別篩選=海洋與環(huán)境微生物分析海洋與環(huán)境微生物分析=染色體分選染色體分選 55流式細(xì)胞儀的遺傳學(xué)應(yīng)用細(xì)胞細(xì)胞DNA, RNA 含量的測(cè)定含量的測(cè)定染色體倍體分析染色體倍體分析染色體分離染色體分離基因表達(dá)產(chǎn)物的生物活性研究基因表達(dá)產(chǎn)物的生物活性研究基因轉(zhuǎn)染表達(dá)的生物效應(yīng)基因轉(zhuǎn)染表達(dá)的生物效應(yīng)基因表達(dá)調(diào)控研究基因表達(dá)調(diào)控研究細(xì)胞內(nèi)基因定位細(xì)胞內(nèi)基因定位酵母轉(zhuǎn)基因株的篩選酵母轉(zhuǎn)基因株的篩選報(bào)告基因的定性定量檢測(cè)報(bào)告基因的定性定量檢測(cè)植物遺傳學(xué)研究植物遺傳學(xué)研究 56What can Flow Cytometer tell us about a cell?

20、Cell Lineage/Subset PhenotypeCytokine/ChemokineProduction RepertoireCytokine/ChemokineReceptor RepertoireMigration/Homing PhenotypreCell cycle status 57細(xì)胞增殖（細(xì)胞周期）細(xì)胞增殖（細(xì)胞周期）細(xì)胞內(nèi)DNA含量增殖相關(guān)基因的表達(dá)BrdU的結(jié)合示蹤染料 58DNA 探針探針DNA探針最主要的特點(diǎn)是，它們與DNA含量是成化學(xué)正比化學(xué)正比關(guān)系的這樣，帶有的探針熒光分子的數(shù)目就和DNA分子的含量相當(dāng)，從而檢測(cè)DNA含量 59 Nucleic acid P

21、robes菲啶基Propidium IodideEthidium Bromide苯甲亞胺Hoechst 33342抗生素Mithramycin, Chromamycin A3Acridine Orange - AOPyronyn Y 600 200 400 600 8001000DNA contentCountNormal Cell Cycle 61A typical DNA HistogramG0-G1SG2-MFluorescence Intensity# of Events 62紅色為正常二倍體細(xì)胞；黃色為異倍體細(xì)胞 63 增殖相關(guān)基因增殖相關(guān)基因PCNA(Proliferating c

22、ell nuclear antigen) 一種蛋白質(zhì)，在DNA復(fù)制和核苷酸的切除修復(fù)中起到作用Ki-67 - proliferation related antigenKi-S1 - proliferation related antigenPhospho-histoneCyclin D1, E, A, B1 64 BrdUrd IncorporationBromodeoxyuridine (BrdU) 是一個(gè)胸腺核苷的類似物 能夠在細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期狀態(tài)分析中起作用BrdU能與正在復(fù)制周期內(nèi)的細(xì)胞相結(jié)合使用BrdU抗體能夠檢測(cè)到BrdU 65 BrdUrd Incorporation 66

23、細(xì)胞分裂的分析 哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)需要有大量的增殖，能夠確保抗原特異性的T細(xì)胞和B細(xì)胞具有足夠的增殖速度，能夠?qū)Ω吨尾∩镌斐傻母腥綜FSE是一種示蹤染料，能夠均等地在兩個(gè)子代細(xì)胞中分布，其結(jié)果可以區(qū)分出8-10代的子細(xì)胞。 67Tracing Dye(CFSE) Apoptotic Cell Death - a genetically encoded cell death program, which is morphologically, biochemically and molecularly distinct from necrosis 69Flow cytometry of apo

24、ptotic cell death細(xì)胞散射光 在細(xì)胞調(diào)亡中，細(xì)胞收縮，從而FSC下降，SSC上升或是沒有明顯變化 70 71Flow cytometry of apoptotic cell death熒光吸收 細(xì)胞的胞膜對(duì)于DNA染料的通透性和細(xì)胞的活性、死亡和凋亡相關(guān)，像PI、EB、Hoechst-33342等，可以用來區(qū)分活細(xì)胞、死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞 72Flow cytometry of apoptotic cell deathFCM of Caspases 通過抗體和活化的caspase-3片斷相結(jié)合來檢測(cè) 使用特異性的caspase-3熒光底物 新的抗原決定基CK18 73 74Flow

25、 cytometry of apoptotic cell death TMP會(huì)在調(diào)亡中產(chǎn)生，可以通過一些標(biāo)記用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。使用有膜穿透性的親脂性陽(yáng)離子熒光染料，如Rh123, DiOC6, JC-1,CMXRos等，可作為流式檢測(cè)的探針。 當(dāng)細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡時(shí)，一個(gè)線粒體膜表面蛋白7A6抗原會(huì)出現(xiàn) Bcl-2/bax family of proteins. 75 76 77Flow cytometry of apoptotic cell death 胞漿內(nèi)Ca2+ 水平的上升和由于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境酸化造成的選擇性的pH值的調(diào)節(jié)降低是伴隨著細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的后果之一。 使用Ca2+ 選擇性熒光探針，如 Q

26、uin-2, Fluo-3, Indo-1 通過流式檢測(cè)是測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的最佳方案 酸化的檢測(cè)同樣可以用對(duì)pH敏感的熒光探針，如 DCH, BCECF, BCECF-AM, SNAFLs, SNARFs等進(jìn)行檢測(cè) 78Flow cytometry of apoptotic cell death 79 80Flow cytometry of apoptotic cell deathDNA 鏈的斷裂鏈的斷裂 細(xì)胞凋亡晚期中，核酸內(nèi)切酶（某些Caspase的底物）在核小體之間剪切核DNA，產(chǎn)生大量長(zhǎng)度在180-200 bp 的DNA片段。 斷裂的末端可以通過末端轉(zhuǎn)脫氧核苷酰酶(TdT)連接上

27、dUTP。 81 82 83 84Flow cytometry of apoptotic cell death細(xì)胞DNA含量 在凋亡細(xì)胞中，用PI染色，通過流式檢測(cè)DNA含量，可以發(fā)現(xiàn)一種亞群的細(xì)胞，其染色熒光強(qiáng)度下降。這是由于隨著調(diào)亡的進(jìn)行，核酸內(nèi)切酶活化，隨后一部分DNA泄漏出去，造成細(xì)胞內(nèi)DNA含量下降造成的。 85Flow Cytometry of Apoptotic CellsPI - Fluorescence# EventsApoptotic cellsNormal G0/G1 cells An Integrated Approach to Cell Immunology 87Im

28、mune Function assay 免疫細(xì)胞亞群檢測(cè)免疫細(xì)胞亞群檢測(cè) Antigen-peptide specific T cells 檢測(cè)檢測(cè) T-cells 活化活化 Treg Cells 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子/趨化因子檢測(cè)趨化因子檢測(cè) 磷酸化磷酸化 88淋巴細(xì)胞亞群分析淋巴細(xì)胞亞群分析根據(jù)功能，淋巴細(xì)胞主要分為B淋巴細(xì)胞（CD19+），與體液免疫有關(guān)T淋巴細(xì)胞（CD3+），與細(xì)胞免疫有關(guān) 總T和總B可以用來判斷某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 NK細(xì)胞（CD3-CD16+56+），行使免疫監(jiān)控功能， 能夠介導(dǎo)對(duì)某些腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。 89淋巴細(xì)胞亞群分析淋巴細(xì)

29、胞亞群分析根據(jù)CD4、CD8表達(dá)，T淋巴細(xì)胞又分為T輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞（CD3+CD4+）T抑制/細(xì)胞毒性細(xì)胞（CD3+CD8+）Th/Ts 評(píng)價(jià)那些自身免疫失調(diào)或被懷疑是免疫失調(diào)或已知患有免疫缺陷的病人的免疫狀態(tài)，此外，這一比值還可用來監(jiān)測(cè)骨髓移植病人以免受到急性GVHD的攻擊 Th/Ts升高：自身免疫性疾病（類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、SLE） Th/Ts降低：病毒感染、惡性腫瘤、再生障礙性貧血 90Absolute Counts - Cells per m mLPositive CellAbsolute Count BeadsNegative CellCD4 PECD4 PE 91抗原特異性抗原特異性T

30、細(xì)胞細(xì)胞 提供檢測(cè)者一個(gè)強(qiáng)有力的工具用于研究對(duì)病毒抗原的免疫應(yīng)答和疫苗的開發(fā) 92MHC: Class I and Class II Gene ProductsT cell受體不直接和可溶性抗原相連受體不直接和可溶性抗原相連 抗原必須通過MHC由抗原呈遞細(xì)胞傳遞給T細(xì)胞 (Macrophages, Dendritic cells, B cells)MHC Class I Gene Products 呈遞抗原給 CD8+ T cells 誘導(dǎo)細(xì)胞毒應(yīng)答MHC Class II Gene Products 呈遞抗原給 CD4+ T cells 誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生，免疫球蛋白的分泌 93MHC/TCR

31、 Signaling 94二聚體可溶性MHC類似物與四聚體的比較 95Quantitation of antigen-specific T lymphocytes in peripheral blood HAMControlHIVCD8Tax-A2/IgGag-A2/Ig 96Treg細(xì)胞的檢測(cè)Treg細(xì)胞與自身免疫耐受相關(guān)，通常的檢測(cè)方法用CD4陽(yáng)性細(xì)胞中CD25高表達(dá)，同時(shí)結(jié)合胞內(nèi)FoxP3含量來判斷最新發(fā)現(xiàn)人的Treg細(xì)胞低表達(dá)CD127。CD127的表達(dá)模式與Foxp3很接近，說明低表達(dá)CD127，高/中表達(dá)CD25的CD4陽(yáng)性的T淋巴細(xì)胞就是Treg細(xì)胞（調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）。該方法比胞內(nèi)

32、檢測(cè)Foxp3的優(yōu)點(diǎn)在于，檢測(cè)后的細(xì)胞可用于后續(xù)的培養(yǎng)及其他的體外試驗(yàn)。另外的優(yōu)點(diǎn)是用這種檢測(cè)方案分選的Treg細(xì)胞得率更高。 97 98Immune Function Assays - A Powerful Research Tool for Answering Basic Biological Questions in.AIDS或癌癥機(jī)理的研究或癌癥機(jī)理的研究T cell亞群對(duì)于病毒和細(xì)菌抗原的反應(yīng)亞群對(duì)于病毒和細(xì)菌抗原的反應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)機(jī)會(huì)感染的免疫反應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)機(jī)會(huì)感染的免疫反應(yīng)藥物藥物/疫苗的效果評(píng)價(jià)疫苗的效果評(píng)價(jià) 免疫調(diào)節(jié)免疫調(diào)節(jié)移植監(jiān)控移植監(jiān)控毒理研究毒理研究 99 100 1

33、01 102Traditional Cytokine Flow CytometryIL-2 PhycoerythrinCD4 FITC 103細(xì)胞因子檢測(cè)細(xì)胞因子檢測(cè)細(xì)胞因子是可溶性蛋白，在淋巴細(xì)胞免疫功能調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用。細(xì)胞因子可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和功能，調(diào)節(jié)正常與病理狀態(tài)下的免疫應(yīng)答，研究生理或病理免疫調(diào)節(jié)因素所致細(xì)胞因子合成的應(yīng)答與改變是研究疾病病因與免疫狀態(tài)的重要工具。 104T細(xì)胞的細(xì)胞因子分型細(xì)胞的細(xì)胞因子分型=型細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)=引起遲發(fā)過敏反應(yīng)、巨噬細(xì)胞活化、2型反應(yīng)下調(diào)=刺激來源：病毒、某些細(xì)菌=型體液介導(dǎo)免疫反應(yīng)=引起B(yǎng)細(xì)胞增殖、分泌多克隆免疫球蛋白、1型反應(yīng)

34、下調(diào)=刺激來源：多細(xì)胞寄生蟲、過敏源 105細(xì)胞因子細(xì)胞因子 106Biological Variation Among CMV-seropositive Donors in Response to CMV 107CFC & Proliferation使用溫和的方法進(jìn)行細(xì)胞破膜和固定，在中性pH值條件下，使細(xì)胞和BrdU結(jié)合，可以同時(shí)檢測(cè)到： S期 細(xì)胞周期 表型 活化狀態(tài) 核型決定基 胞漿內(nèi)決定基 細(xì)胞因子/趨化因子 其他. 108CFC & ProliferationAllows the correlation of: Phenotype Cytokine expressi

35、onCell CycleProliferation 109BD Phosflow磷酸化檢測(cè)系統(tǒng)更好的特異性的抗體建立在單個(gè)細(xì)胞基礎(chǔ)上的檢測(cè)可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)參數(shù)快速、靈敏、樣本量更少 110YYYY非磷酸化特異性抗體檢測(cè)全部的相關(guān)蛋白 unphosphorylated + phosphorylated亞型 抗原：重組的蛋白質(zhì)片斷磷酸化特異性抗體 僅僅檢測(cè)磷酸化亞型 抗原：合成的 4-10mer磷酸化肽段Y磷酸化特異性和非磷酸化特異性抗體的差異 111BD PhosFLOW和和Western blot 的比較的比較A theoretical experiment comparing Western

36、 blot and flow cytometry with three samples and a protein of interest at 1, 10, or 50 copies per cell. Sample 2 and 3 look the same via Western blot, but when stained with fluorescently labeled antibodies, the differences between the samples become more relevant. (Source: P.O. Krutzik et al. / Clini

37、cal Immunology 110 (2004) 206221) 112BD PhosFlowGenomics & Proteomics - Single Cells Have Big Proteomics Story to Tell. BD PhosFlow not only tells you activation of a single cell for one particular phospho protein and pathway, but allows you to study multiple phosphorylation events and pathways

38、simultaniously. 113100101102103104100101102103104PBMC050100150200250FSC-H050100150200250SSC-HCD20 PerCP-Cy5.5CD3 PE Zap70 (Y319)/Syk (Y352) Alexa 647 100101102103104020406080100100101102103104020406080100100101102103104020406080100100101102103104100101102103104CD3 PE 10010110210310402040608010010010

39、1102103104020406080100100101102103104020406080100CD3-/CD20+ CD3+/CD20- CD3-/CD20-CD20 PerCP-Cy5.5Whole Blood CD3 CrossLink 050100150200250FSC-H050100150200250SSC-H21.8Multi-Color PhosFlow in CD3/CD28 or CD3 crosslinked human PBMCs or Whole BloodCD3/CD28 CrosslinkUntreated cells (unshaded) vs treated

40、 cells (shaded) 114BD CBA 一種一種“三明治三明治”免疫測(cè)定法免疫測(cè)定法 使用結(jié)合有高親和性抗體的小球，用來特異性地捕獲可溶性的抗原. 用熒光檢測(cè)抗體來檢測(cè)被捕獲的抗原 使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析 115 116Multiplexed BeadsShades of a colorAntibody coupled beads, emitting at distinct FL3 intensitiesVarious analytesAntibody coupled PE label, emitting at FL2 intensity proportional to ana

41、lyte conc. 117Multiplexed Beads0 pg/mL80 pg/mL1250 pg/mL5000 pg/mLFL3 Beads FL2 (PE) 118使用 BD Cytometric Bead Array(CBA) 系統(tǒng)你可以: 從單一小體積樣本中得到多項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果 對(duì)所有的檢測(cè)項(xiàng)目，只需要制備一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)混合物來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 避免人為造成的酶聯(lián)放大的假陽(yáng)性信號(hào)產(chǎn)生 用更少的時(shí)間和精力，卻得到大量的結(jié)果 如果是用488nm和635nm兩根激光器來實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)條件更容易建立 使用配有HTS選件的BD流式細(xì)胞儀可以做到自動(dòng)平板上樣和高通量檢測(cè) 119目前CBA主要提供的檢測(cè)內(nèi)容可

42、溶性細(xì)胞因子細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白磷酸化蛋白 120BD CBA Flex SetABCDEFGHI1 2 3 4 5 6 7 8 9FL4-H or Red-AFL3-H or NIR-AOld Format BD CBA BeadsBD CBA Flex Set Beads 121更為靈活強(qiáng)大的CBA Flex Set最多可同時(shí)檢測(cè)72個(gè)項(xiàng)目可自由選擇搭配檢測(cè)項(xiàng)目檢測(cè)項(xiàng)目范圍更廣泛需要488nm和635nm兩種波長(zhǎng)的激光器ABCDEFGHI1 2 3 4 5 6 7 8 9FL4-H or Red-AFL3-H or NIR-A 1229 9個(gè)指標(biāo)同時(shí)檢測(cè)活化個(gè)指標(biāo)同時(shí)檢測(cè)活化T T細(xì)胞細(xì)胞12

43、34567891. Itk (Y511)2. ERK (T202/Y204)3. JNK (T183/Y185)4. P38 (T180/Y182)5. PLCg g (Y783)6. ZAP70 (Y319)7. LAT (Y171)8. c-Jun (S63)9. RSK (S380) 123Kinetics of Jurkat Cell Activation With Kinetics of Jurkat Cell Activation With Anti-CD3/CD28Anti-CD3/CD28110100FOLD INCREASE IN UNITS/ML05101520TIME (

44、MINUTES)RSK (S380)Jun (S63)LAT (Y171)Itk (Y511)ZAP-70 (Y319)PLCg g (Y783)P38 (T180/Y182)JNK (T183/Y185)ERK (T202/Y204)P-Specific Antibodies 124Monitoring the T Cell Activation Pathway Monitoring the T Cell Activation Pathway by CBA (Control)by CBA (Control)LckZAP-70PItkPPMAPKKKPIKKPNF-kBRasGrb2SOSRa

45、cPPPLCPPDAGPKCPVAVSLP-76PLATPPPPPP PPPPPPRasMEKERKJNKp38MKK4,7MKK3,6MEKK1-4ElkJunATF2MEKK4LATPPRSKSpecificitySpecificity UnstimulatedUnstimulatedAnti-CD3Anti-CD3Change Change % of Control% of ControlZAP-70108763655100Itk3711477100LAT42212170100PLCg609881272100ERK10430502946100JNK131272141100p3852729

46、252398100c-Jun209351142100RSK55440385100Cells were activated with anti-CD3/CD28 for 2 minutes. SDS was added to a final concentration of 1% and the material was placed in a boiling water bath for 5 minutes. 125Monitoring the T Cell Activation Pathway Monitoring the T Cell Activation Pathway by CBA (PD-98059)by CBA (PD-98059)LckZAP-70PItkPPMAPKKKPIKKPNF-kBRasGrb2SOSRacPPPLCPPDAGPKCPVAVSLP-76PLATPPPP PPPPPPRasMEKERKJNKp38MKK4,7MKK3,6MEKK1-4ElkJunATF2MEKK4LATPRSKSpecificitySpecificity Unstimul