蔬菜農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)方法原理及檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)

1、蔬菜農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)方法原理及檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)1、目前農(nóng)藥在蔬菜中殘留的問題1.1、農(nóng)藥是把“雙刃劍”，對(duì)促進(jìn)農(nóng)業(yè)增產(chǎn)有極其重要的作用。但由于農(nóng)藥本身固有的化學(xué)屬性和對(duì)其使 用不當(dāng)，導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留嚴(yán)重超標(biāo)，嚴(yán)重危害到廣大人民群眾的健康。1.2、 在我國(guó)農(nóng)藥中，70%為有機(jī)磷農(nóng)藥，而在我國(guó)生產(chǎn)使用的有機(jī)磷農(nóng)藥中，70%為劇毒、高毒類，而且較 多是禁止在蔬菜作物上使用的。2、農(nóng)藥中毒事件常有報(bào)道，究其原因2.1、農(nóng)產(chǎn)品不按規(guī)定的用藥量、次數(shù)、方法或安全間隔期施藥，或施用不允許在蔬菜上使用劇毒、高毒類 農(nóng)藥；2.2、現(xiàn)在標(biāo)準(zhǔn)施行的農(nóng)藥殘留測(cè)定需要通過有機(jī)溶劑提取、凈化和用大型分析儀器進(jìn)行，無法對(duì)廉價(jià)的

2、蔬 菜進(jìn)行隨時(shí)隨地或快速檢測(cè)而形成的監(jiān)管不到位。3、農(nóng)藥分類：3.1、礦物源農(nóng)藥3.2、生物源農(nóng)藥3.3、按作用方式分類4、目前所使用的農(nóng)藥按其化學(xué)結(jié)構(gòu)大致可以分為以下幾類：有機(jī)氯類、有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類、雜環(huán)類化合物、其他（苯氧羧酸類、脲類化合物） 等。A、有機(jī)磷類敵敵畏、甲拌磷、樂果、對(duì)氧磷、對(duì)硫磷、喹硫磷、優(yōu)殺硫磷、敵百蟲、氧化樂果、磷胺、甲基嘧啶磷、 馬拉硫磷、辛硫磷、亞胺硫磷、甲胺磷、地亞農(nóng)、甲基毒死蜱、毒死蜱、倍硫酸、殺撲磷、乙酰甲胺磷、 巴胺磷、甲基對(duì)硫磷、殺螟硫磷、異柳磷、異柳磷等。B、有機(jī)氯類a -666、3 -666、y -666、S -666、op -DD

3、E、pp -DDE、op -DDD、pp -DDT、op -DDT、異菌月尿、 五氯硝基苯、林丹、乙烯菌核利、三氯殺螨醇、功夫、氯硝胺、百菌清、粉銹寧、甲氯菊酯、氯菊酯、氰 戊菊酯、溴氰菊酯等。C、氨基甲酸酯類涕滅威砜、涕滅威亞砜、滅多威、3-羥基呋喃丹、涕滅威、呋喃丹、甲萘威、葉蟬散、仲丁威、速滅威等。d、擬除蟲菌酯類聯(lián)苯菊酯、二氧苯醚菊酯、功夫菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氰菊酯、氟氯氰菊酯，戊菊酯、甲氰菊酯、 氯氟氰菊酯、呋喃菊酯、芐呋菊酯、右旋丙烯菊等。5、最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)最大殘留限量（Maximum Residue Limit , MRL ）在農(nóng)畜產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的法定最高允許濃度，又稱

4、最高殘留限量，以每千克農(nóng)畜產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的毫克數(shù) （毫克/千克）表示。目的：控制食品中過量農(nóng)藥殘留以保障食用者安全，對(duì)超標(biāo)的產(chǎn)品采取措施，即禁止食用。執(zhí)行和指導(dǎo)合 理用藥，農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)測(cè)超標(biāo)時(shí)，表明未按規(guī)定用藥。減少國(guó)際貿(mào)易糾紛，各國(guó)均制訂本國(guó)的MRL。食品中農(nóng)藥最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)A、GB2763-2014，規(guī)定了 387種農(nóng)藥最高殘留限量。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)作為一項(xiàng)加強(qiáng)農(nóng)藥管理的措施。B、其中，針對(duì)蔬菜、水果、茶葉等鮮食農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留超標(biāo)多發(fā)、易發(fā)問題，新標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)增了蔬菜、水果等鮮食農(nóng)產(chǎn)品的限量標(biāo)準(zhǔn)。水果農(nóng)藥殘留限量增加473 項(xiàng)，蔬菜（包括食用菌）農(nóng)藥最大殘留限量增加 431項(xiàng)。6、高毒農(nóng)藥禁限用管理措施

5、6.1 、農(nóng)業(yè)部、工業(yè)和信息化部、環(huán)境保護(hù)部、國(guó)家工商行政管理總局和國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局與2011年 6 月 15 日發(fā)布第 1586 號(hào)公告，決定對(duì)高毒農(nóng)藥采取進(jìn)一步禁限用管理措施。6.2 、停止受理苯線磷、地蟲硫磷、甲基硫環(huán)磷、磷化鈣、磷化鎂、磷化鋅、硫線磷、蠅毒磷、治螟磷、特 丁硫磷、殺撲磷、甲拌磷、甲基異柳磷、克百威、滅多威、滅線磷、涕滅威、磷化鋁、氧樂果、水胺硫磷、 溴甲烷、硫丹等 22 種農(nóng)藥新增田間試驗(yàn)申請(qǐng)、登記申請(qǐng)及生產(chǎn)許可證申請(qǐng)；停止批準(zhǔn)含有上述農(nóng)藥的新增 登記證和農(nóng)藥生產(chǎn)許可證（生產(chǎn)批準(zhǔn)文件）。6.3、撤銷氧樂果、水胺硫磷早柑橘樹，滅多威在柑橘樹、蘋果樹、茶樹、十字花科

6、蔬菜，硫線磷在柑橘樹、 黃瓜，硫丹在蘋果樹、茶樹，溴甲烷在草莓、黃瓜上的登記。6.4、本公告發(fā)布前已生產(chǎn)產(chǎn)品的標(biāo)簽可以不再更改，但不得繼續(xù)在已撤銷登記的作物上使用。6.5 、自 2011 年 10 月 31 日起，撤銷（撤回）苯線磷、地蟲硫磷、甲基硫環(huán)磷、磷化鈣、磷化鎂、磷化鋅、 硫線磷、蠅毒磷、治螟磷、特丁硫磷等 10 種農(nóng)藥的登記證、生產(chǎn)許可證（生產(chǎn)批準(zhǔn)文件），停止生產(chǎn)。 6.6、自 2013 年 10 月 31 日起，停止銷售和使用。根據(jù)以上情況，制定出有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的快速檢測(cè)方法，加強(qiáng)對(duì)農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)一成為十 分必要的監(jiān)管措施。7、農(nóng)藥殘留主要檢測(cè)方法有兩種：7.1、色譜

7、檢測(cè)法： 色譜檢測(cè)法用作農(nóng)殘定量分析，可為農(nóng)藥殘留執(zhí)法提供依據(jù)。 色譜法（包括氣相色譜、液相色譜、氣質(zhì)聯(lián)用等）。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高、準(zhǔn)確、定性定量； 缺點(diǎn)：成本高、操作復(fù)雜、時(shí)間較長(zhǎng)。7.2、速測(cè)儀法： 速測(cè)儀法只能作為農(nóng)殘定性分析，易于在基層推廣等特點(diǎn)，是目前我國(guó)控制高毒農(nóng)藥殘留的一種有效方法， 也是目前國(guó)內(nèi)和我省應(yīng)用最廣泛的農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)方法。A、速測(cè)儀法的主要優(yōu)點(diǎn)：1、該方法具有快速方便、 前處理簡(jiǎn)便、 成本較低等優(yōu)點(diǎn)， 適用于現(xiàn)場(chǎng)定性測(cè)定， 特別適合在蔬菜生產(chǎn)基地、 批發(fā)市場(chǎng)及農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)部門開展快速檢測(cè)工作。2、該方法可對(duì)有農(nóng)藥殘留的蔬菜進(jìn)行粗篩，將一部分農(nóng)藥殘留含量較高的蔬菜控制在市場(chǎng)

8、之外，避免因農(nóng) 藥殘留發(fā)生中毒事件。B、速測(cè)儀法的主要缺點(diǎn)：1、酶試劑易失活， 導(dǎo)致反應(yīng)不穩(wěn)定， 檢測(cè)結(jié)果誤差較大， 重復(fù)性不好， 實(shí)際應(yīng)用中的確認(rèn)率大約為 60%70% 左右；2、存在檢測(cè)盲區(qū)，只能檢測(cè)有機(jī)磷和氨基甲酸酯兩類農(nóng)藥，不能檢測(cè)有機(jī)氯類、菊酯和其它類別的劇毒農(nóng) 藥；3、 不適合檢測(cè)蔥蒜類、香菜、韭菜、番茄、胡蘿卜、茭白、蘑菇、花椒等14 種容易出現(xiàn)假陽性的農(nóng)產(chǎn)品。8、速測(cè)儀的檢測(cè)方法有兩種：1、速測(cè)卡法（紙片法）2、酶抑制率法（分光光度法）9、兩種快速檢測(cè)方法的技術(shù)原理 9.1、根據(jù)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥能抑制昆蟲中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中乙酰膽堿酶的活性造成神經(jīng)傳導(dǎo)介 質(zhì)乙酰膽堿的積

9、累，影響正常傳導(dǎo)，導(dǎo)致昆蟲中毒致死的原理而設(shè)計(jì)。9.2、如果蔬菜中不含有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥，乙酰膽堿酶水解后，水解產(chǎn)物可與顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生顏色。9.3、如果蔬菜中含有可以抑制乙酰膽堿的活性的有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥，這種酶就不能被水解，從而 無顯色反應(yīng)。9.4、在溶液中加入乙酰膽堿酶和顯色劑，用此判斷有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留是否存在。10、速測(cè)卡法（紙片法）1、試劑1.1、固有膽堿酯酶和靛酚乙酸酯試劑的紙片（速測(cè)卡）。1.2、 pH7.5 緩沖液溶液：分別取 15.0g 磷酸氫二鈉與 1.59g 無水磷酸二氫鉀用 500mL 蒸餾水溶解。2、儀器2.1、 常量天平有條件配備37 C

10、77; 2C恒溫裝置。3 、分析步驟3.1 、整體測(cè)定法3.2、表面測(cè)定法（粗篩法）結(jié)果判定：1 、結(jié)果以酶被有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥抑制（為陽性）、未抑制（為陰性）表示。2、與空白對(duì)照卡比較，白色藥片不變色或略淺藍(lán)色均為陽性結(jié)果。白色藥片變?yōu)樘焖{(lán)色或與空白對(duì)照卡相 同，為陰性結(jié)果。3、對(duì)陽性結(jié)果的樣品，可用其他分析方法進(jìn)一步確定具體農(nóng)藥品種和含量。速測(cè)卡法（紙片法）注意事項(xiàng)1 、有些蔬菜如生姜、蔥、蒜、辣椒和番茄等汁液中含有破壞酶活性或者使藍(lán)色產(chǎn)物褪色的物質(zhì)，處理這類 蔬菜時(shí)，不要讓其汁液太多釋放出來，不要剪得太碎，浸提時(shí)間不易過長(zhǎng)，必要時(shí)可采用整枝蔬菜浸提或 采用表面測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。對(duì)一些

11、含葉綠素較高的蔬菜，也可以采取整株（體）蔬菜浸提的方法，減少色 素的干擾。2、試紙上的提取液不可太多而溢出試紙，亦不可太少而使反應(yīng)不完全。3 、最好將每一批樣品處理好后一起加樣，一面時(shí)間過長(zhǎng)蒸干。4、 當(dāng)溫度條件低于37C,酶反應(yīng)的速度隨之放慢， 藥片加液后放置反應(yīng)的時(shí)間相對(duì)延長(zhǎng)，延長(zhǎng)時(shí)間的確定, 應(yīng)以空白對(duì)照卡用（體溫）手指捏 3 分鐘時(shí)可以變藍(lán)，即可往下操作。注意樣品放置的時(shí)間應(yīng)與空白對(duì)照 卡放置的時(shí)間一致才有可比性。5、空白對(duì)照卡不變色的原因：一是藥片表面緩沖溶液加的少，預(yù)反應(yīng)后的藥片表面不夠濕潤(rùn)，二是溫度太 低。6、如有條件，將農(nóng)藥速測(cè)卡放在 10C以下保存效果會(huì)更好，每小包產(chǎn)品開封后

12、最好在三天內(nèi)用完，如用不 完，可放入將有變色硅膠吸潮劑的瓶中密封保存，如發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥測(cè)速卡的紅色藥片由鮮紅橙色變?yōu)榘档暮?紅色，說明紙片已吸潮失效。PR-3 便攜式農(nóng)藥殘毒快速檢測(cè)儀操作步驟：1 、接通電源，右側(cè)開關(guān)撥至“開”，打開上蓋按“ START ”鍵預(yù)熱；2、當(dāng)預(yù)熱達(dá)到設(shè)置反應(yīng)溫度 TEMP 時(shí)，聽到“嘩”一聲，屏幕顯示“ TEMP1 ”，預(yù)熱結(jié)束，等待倒計(jì)時(shí)；3、 去試紙外模，插入試紙（白片在下端），在白片上分別加1-2 滴提取液；4、再次按 '“START ”鍵，單片電腦開始“ TEMP1 ”倒計(jì)時(shí)；5、 當(dāng)聽到連續(xù)“嘩、嘩、嘩”聲，屏幕顯示“CLOS ” ，提示合上前蓋，進(jìn)

13、入“ TEMP2 ”倒計(jì)時(shí)；6、當(dāng)聽到六聲“嘩。嘩、嘩”音，本次操作結(jié)束，打開上蓋觀察試紙顏色變化；7、試紙顯示藍(lán)色為陰性，淺藍(lán)色為弱陽性，白色為陽性；8、測(cè)試完畢，向上取下試紙進(jìn)行下一次的檢測(cè)。酶抑制率法（分光光度法）1、試劑1.1、 pH8.0緩沖溶液：分別取 11.9g無水磷酸氫二鉀與 3.2g磷酸二氫鉀，用1000mL蒸餾水溶解。1.2、顯色劑：分別取160mg二硫代二硝基苯甲酸（DTNB ）和15.6mg碳酸氫鈉，用20m 了緩沖溶液溶解， 4 C冰箱中保存。1.3、底物：取25.0mg硫代乙酰膽堿，加 3.0mL蒸餾水溶解，搖勻后置 4 C冰箱中保存?zhèn)溆?。保存期不超過 兩周。1.4

14、乙酰膽堿酯酶：根據(jù)酶的活性情況，用緩沖溶液溶解，3min的吸光度變化 Ao值應(yīng)控制在0.3以上。搖勻后置4C冰箱中保存?zhèn)溆?，保存期不超過四天。1.5、可選用由以上試劑制備的試劑盒。乙酰膽堿酯酶的 Ao值應(yīng)控制在0.3以上。2、儀器2.1 、分光光度計(jì)或相應(yīng)測(cè)定儀及常量天平。3 、分析步驟3.1、 樣品處理：選取有代表性的蔬菜樣品，沖洗掉表面泥土，剪成1cm左右見方碎片，取樣品 1g,放入燒 杯或提取液瓶中，加入 5mL緩沖溶液，振蕩1-2min，倒出提取液，靜置 35min,待用。3.2、 對(duì)照溶液測(cè)試：先于試管中加入 2。5mL緩沖溶液，再加入 0.1mL酶液、0.1mL顯色劑，搖勻后于 3

15、7C 放置15min以上（每批樣品的控制時(shí)間應(yīng)一致）。加入0.1mL底物搖勻，此時(shí)檢液開始顯色反應(yīng)，應(yīng)立即 放入儀器比色池中，記錄反應(yīng) 3min的吸光度變化值 Ao。3.3 、樣品溶液測(cè)試：先于試管中加入 2.5mL 樣品提取液,其他操作與對(duì)照溶液測(cè)試相同,記錄反應(yīng) 3min 的吸光度變化值 At。結(jié)果的表述計(jì)算1 、檢測(cè)結(jié)果按公式計(jì)算：2、抑制率（% = （ Ao- At） / Ao X1003、式中： Ao對(duì)照溶液反應(yīng) 3min吸光度的變化值：4、 At樣品溶液反應(yīng) 3min吸光度的變化值：結(jié)果判定1、結(jié)果以酶被抑制的程度（抑制率）表示。當(dāng)蔬菜樣品提取液對(duì)酶的抑制率為0%時(shí)，表示蔬菜中有高

16、劑量有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥存在,樣品為陽性結(jié)果。陰性結(jié)果的樣品需要重復(fù)檢驗(yàn)2 次以上。對(duì)陽性結(jié)果的樣品,可用其他方法進(jìn)一步確定具體農(nóng)藥品種和含量。酶抑制率法注意事項(xiàng)1、蔥、蒜、蘿卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中,含有對(duì)酶有影響的植物次生物質(zhì),容易 產(chǎn)生假陽性。處理這類樣品時(shí),可采取整株（體）蔬菜浸提。對(duì)一些含葉綠素較高的蔬菜,也可采取整株（體）蔬菜浸提方法,減少色素的干擾。2、當(dāng)溫度條件低于 37 C,酶反應(yīng)的速度隨之放慢，加入酶液和顯色劑后放置反應(yīng)的時(shí)間應(yīng)相對(duì)延長(zhǎng)，延長(zhǎng)時(shí)間的確定，應(yīng)以膽堿酯酶空白對(duì)照測(cè)試3min的吸光度變化 Ao值在0.3以上，即可往下操作。注意樣品放置時(shí)間應(yīng)與空白對(duì)照溶液放置時(shí)間一致才有可比性。膽堿酯酶空白對(duì)照溶液3min的吸光度變化 Ao值<0.3 的原因：一是酶的活性不夠,二是溫度太低。3、當(dāng)吸光度大到無法