Wesern Blot共聚焦

1、嚴(yán)嚴(yán) 明明 2013-8-26口腔頜面腫瘤實驗室 實驗技術(shù)培訓(xùn)第六章 免疫印跡實驗技術(shù) 激光共聚焦技術(shù)實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康膐 檢測細(xì)胞或組織蛋白中目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)檢測細(xì)胞或組織蛋白中目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)o 表達(dá)定位：組織（細(xì)胞）免疫熒光表達(dá)定位：組織（細(xì)胞）免疫熒光 -激光共聚焦激光共聚焦o 表達(dá)定量：表達(dá)定量：western blotwestern blot技術(shù)技術(shù)原理原理免疫印跡（免疫印跡（western blotting ）應(yīng)用蛋白質(zhì)特異的單克隆抗體或多克隆抗體應(yīng)用蛋白質(zhì)特異的單克隆抗體或多克隆抗體檢測特異性的目的蛋白檢測特異性的目的蛋白 未知蛋白進(jìn)行未知蛋白進(jìn)行sds-聚丙烯酰胺凝膠單向電聚丙

2、烯酰胺凝膠單向電泳（泳（sds-page） 轉(zhuǎn)移到固相支持物轉(zhuǎn)移到固相支持物 特異性的抗體檢測目的蛋白特異性的抗體檢測目的蛋白原理原理 sds-page多肽多肽sds-多肽多肽多肽多肽dtt斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵，破壞蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)sds：陰離子表面活性劑（去污劑），斷開分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)遷移率只與多肽的分子量大小有關(guān)遷移率只與多肽的分子量大小有關(guān)原理原理適用范圍和條件適用范圍和條件o 檢測細(xì)胞或組織內(nèi)目的蛋白質(zhì)的表達(dá)檢測細(xì)胞或組織內(nèi)目的蛋白質(zhì)的表達(dá)o 檢測細(xì)菌、真菌、血清等目的蛋白的表達(dá)檢測細(xì)菌、真菌、血清等目的蛋白的表達(dá)o 非原位檢測，不能對

3、目的蛋白做細(xì)胞定位非原位檢測，不能對目的蛋白做細(xì)胞定位o 必須有目的蛋白質(zhì)的特異性抗體才能完成檢測必須有目的蛋白質(zhì)的特異性抗體才能完成檢測o 屬于半定量檢測，需以內(nèi)參蛋白，如屬于半定量檢測，需以內(nèi)參蛋白，如-肌動蛋肌動蛋白（白（ actin），）， gapdh等作為對照等作為對照操作流程操作流程總蛋白質(zhì)抽提總蛋白質(zhì)抽提蛋白質(zhì)濃度測定蛋白質(zhì)濃度測定sds-page考馬斯亮藍(lán)染色（不可逆）考馬斯亮藍(lán)染色（不可逆）檢測電泳成功與否？檢測電泳成功與否？電轉(zhuǎn)移電轉(zhuǎn)移麗春紅染色（可逆）麗春紅染色（可逆）檢測電轉(zhuǎn)成功與否？檢測電轉(zhuǎn)成功與否？抗體抗體western印記印記抗體孵育抗體孵育發(fā)色發(fā)色/光底物顯跡光

4、底物顯跡提取提取分離分離固定固定顯色顯色總蛋白抽提總蛋白抽提 完全性 防降解 ?；钚?溫度溫度: 4 方法方法: 機(jī)械法 /非機(jī)械法 蛋白本身特性蛋白本身特性: 表面蛋白,膜蛋白,磷酸化蛋白 蛋白的保存蛋白的保存: -80,蛋白酶抑制劑蛋白濃度測定蛋白濃度測定o bradford比色法o 測定考馬斯亮蘭與待測蛋白的結(jié)合量o 用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（如牛血清白蛋白bsa)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線sds聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 一維分離一維分離 分子量不同分子量不同,與電荷無關(guān)與電荷無關(guān)凝膠制備凝膠制備 分離膠分離膠-積層膠積層膠蛋白前處理蛋白前處理 蛋白變性蛋白變性垂直電泳垂直電泳sds聚丙烯酰

5、胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 -凝膠制備凝膠制備o 根據(jù)目的蛋白的分子量及根據(jù)目的蛋白的分子量及sds-聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍選擇合適的丙烯酰胺分凝膠的有效分離范圍選擇合適的丙烯酰胺分離膠濃度離膠濃度丙烯酰胺濃度（）丙烯酰胺濃度（）15107.55.0線性分離范圍線性分離范圍12431668369457212sds聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 -凝膠制備凝膠制備分離膠分離膠積層膠積層膠1 cmsds聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 -凝膠制備凝膠制備分離膠灌制后,蒸餾水壓平界面,且可以隔絕空氣分離膠完全聚合后（約30分鐘），盡可能排出凝膠上的液體配制積層膠(約1cm

6、),保證高度高度,快速梳子潤濕后再放置,防氣泡氣泡等待凝膠完全聚合完全聚合(40分鐘)沖洗梳孔,去除未完全聚合的丙稀酰胺sds聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 -蛋白的預(yù)處理蛋白的預(yù)處理 蛋白測濃度,根據(jù)濃度計算上樣量，盡量保證每孔上樣量相同。 加入sds凝膠加樣緩沖液，在100加熱3分鐘使蛋白變性 上樣緩沖液中的dtt易失效，使用前由貯存液中現(xiàn)加加樣應(yīng)柔和，一般小型的bio-rad垂直電泳儀每孔加樣最好不要超過20 l ，上樣盡量快不加樣的孔用上樣緩沖液補(bǔ)齊o 電泳裝置與電源相連 ,注意正負(fù)電極o 電壓設(shè)置: 積層膠 80v 分離膠 120150vo 目的蛋白電泳至分離膠中下2/3的位置

7、 sds聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 垂直電垂直電泳泳 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)sds聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)o 用途：電泳中判斷蛋白位置，顯色后排除非特異性條帶o 電泳過程中預(yù)染markero 顯色后生物素marker，熒光marker電轉(zhuǎn)移電轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)從sds聚聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至固相支持物 固相支持物：硝酸纖維素膜和pvdf膜 電轉(zhuǎn)方法：干轉(zhuǎn)，半干轉(zhuǎn)，濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移裝置的安裝麗春紅染色驗證電轉(zhuǎn)移電轉(zhuǎn)移 -固相支持物靈敏度和靈敏度和分辨率分辨率背景背景結(jié)合能力結(jié)合能力材料質(zhì)地材料質(zhì)地溶劑耐受溶劑耐受性性操作順序操作順序檢測方式檢測方式使用范圍使

8、用范圍nc膜膜高低80100 g/ cm2干的nc膜很脆無緩沖液潤濕，避免氣泡常規(guī)染色，可用放射和非放射性檢測0.45m 一般蛋白0.2 m 分子量小于20kd蛋白0.1 m 分子量小于7kd的蛋白尼龍膜尼龍膜高低400 g/ cm2軟而結(jié)實無緩存液潤濕不能用陰離子染料低濃度小分子蛋白，酸性蛋白、糖蛋白、和蛋白多糖（主要用在核酸檢測中）pvdf膜膜高低125200g/ cm2（適合于sds存在下與蛋白質(zhì)的結(jié)合）機(jī)械強(qiáng)度高有使用前100甲醇潤濕常規(guī)染色，與nc膜比較，可用考馬斯亮藍(lán)染色，可用ecl檢測，快速免疫檢測一般蛋白，糖蛋白檢測和蛋白測序電轉(zhuǎn)移電轉(zhuǎn)移-電轉(zhuǎn)移方法電轉(zhuǎn)移方法o 濕轉(zhuǎn)法o 條件

9、：300 ma轉(zhuǎn)膜23小時 （室溫） 60 ma 轉(zhuǎn)膜過夜 （4）防過熱，防氣泡！電轉(zhuǎn)移電轉(zhuǎn)移 轉(zhuǎn)移裝置轉(zhuǎn)移裝置凝膠濾膜whatman 3mm濾紙whatman 3mm濾紙多孔性墊片多孔性墊片陽 極陰 極每層別忘趕走氣泡!電轉(zhuǎn)移電轉(zhuǎn)移 注意事項o 拿取凝膠、濾紙和濾膜時必須戴手套，因為皮膚上的油脂和分泌物中組織蛋白質(zhì)從凝膠向濾膜轉(zhuǎn)移。o 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，凝膠可用考馬斯亮藍(lán)染色，以便于檢查蛋白轉(zhuǎn)移是否完全。尤其是發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)膜失敗時，轉(zhuǎn)膜后凝膠的考馬斯亮藍(lán)染色幫助尋找失敗原因。蛋白印跡蛋白印跡抗體 成功的關(guān)鍵封閉 盡量去除非特異條帶干擾 pbst 洗膜 壓片顯色蛋白印跡蛋白印跡 封閉封閉價廉物美 脫脂奶粉

10、封閉法 10%脫脂奶粉4過夜 夏天 室溫不宜過長 冬天 適當(dāng)延長孵育時間蛋白印跡蛋白印跡 抗體抗體 一抗 關(guān)鍵關(guān)鍵! 兔抗 多克隆抗體 特異性低 容易出條帶 鼠抗 單克隆抗體 雜帶少稀釋: 1:5002000 (根據(jù)產(chǎn)品說明書,推薦1:1000) 脫脂奶粉封閉液或pbst稀釋孵育條件: 室溫2小時 或 4過夜 二抗 1:500010000稀釋 pbst 稀釋孵育條件: 室溫1小時一抗 -二抗 pbst 洗膜時間 15min x 3次 不能偷懶蛋白印跡蛋白印跡 顯色e 化學(xué)發(fā)光法e 熒光發(fā)光法 取決于樣品、靶蛋白的量、抗體質(zhì)量，發(fā)光檢測靈敏度等許多因素 有一定的粹滅時間,注意避光激光掃描共聚焦顯

11、微鏡激光掃描共聚焦顯微鏡confocal laser scan microscope激光共聚焦激光共聚焦o 人眼分辨率：人眼分辨率：0.2mmo 光學(xué)顯微鏡分辨率：光學(xué)顯微鏡分辨率：0.25mmo 電子顯微鏡分辨率：電子顯微鏡分辨率：0.2nmo 共焦顯微鏡分辨率：共焦顯微鏡分辨率：0.18mmo分辨力：指分辨物體最小間隔的能力分辨力：指分辨物體最小間隔的能力o 分辨力分辨力高高o 用激光作掃描光源，用激光作掃描光源，逐點、逐行、逐面快速逐點、逐行、逐面快速掃描成像掃描成像o 系統(tǒng)經(jīng)一次調(diào)焦，掃描限制在樣品的一個平系統(tǒng)經(jīng)一次調(diào)焦，掃描限制在樣品的一個平面內(nèi)。調(diào)焦深度不一樣時，可獲得樣品不同面內(nèi)

12、。調(diào)焦深度不一樣時，可獲得樣品不同深度層次的圖像深度層次的圖像?！凹?xì)胞細(xì)胞ct”激光共聚焦激光共聚焦o 共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別o 更高的分辨率，可獲取連續(xù)光學(xué)切片更高的分辨率，可獲取連續(xù)光學(xué)切片激光共聚焦激光共聚焦confocalconventional激光共聚焦激光共聚焦培養(yǎng)細(xì)胞的免疫熒光染色方法培養(yǎng)細(xì)胞的免疫熒光染色方法l l 培養(yǎng)細(xì)胞用培養(yǎng)細(xì)胞用pbs分三次取代六孔板中的培養(yǎng)液分三次取代六孔板中的培養(yǎng)液l l 在預(yù)冷的在預(yù)冷的4%多聚甲醛中多聚甲醛中4固定固定30分鐘分鐘l l 在室溫下，在室溫下，pbs洗去固定液，洗去固定液，5分鐘分鐘3次次l l 0.1%triton 處理處理10分鐘分鐘l l 在室溫下，在室溫下，pbs洗洗5分鐘分鐘 l l 在封閉液中室溫封閉在封閉液中室溫封閉30分鐘到分鐘到1小時小時l l 加入稀釋過的兩種一抗，置于濕盒中，加入稀釋過的兩種一抗，置于濕盒中，4冰箱中反應(yīng)過夜冰箱中反應(yīng)過夜