單克隆抗體技術(shù)的應(yīng)用

1、第三節(jié)單克隆抗體技術(shù)的應(yīng)用幾十年以來，人們一直嘗試?yán)萌嗣庖呦到y(tǒng)產(chǎn)生人源性單抗來制備特異性強(qiáng)的人 源抗體藥物，從而治療月中瘤、感染性疾病及自身免疫性疾病等。根據(jù)用途的不同， 單抗大體上可分為三類，即診斷用單抗、治療用單抗、“生物導(dǎo)彈”用單抗。單抗為人類疾病的防治和診斷、月中瘤體內(nèi)定位、靶向藥物的制備、防止移植物的排 異反應(yīng)、新型疫苗的研制提供了較為理想的手段。3.1 用于疾病的診斷1、檢測淋巴細(xì)胞表面分子，用于鑒別淋巴細(xì)胞。它用于區(qū)分細(xì)胞亞群和細(xì)胞的分化階段的淋巴細(xì)胞。例如檢測CD系列標(biāo)志，有利于了解細(xì)胞的分化和T細(xì)胞亞群的數(shù)量和質(zhì)量變化，這對多種疾病診斷具有參 考意義。細(xì)胞表面抗原的檢測，將

2、對白血病患者的疾病分期、治療效果、預(yù)后判 斷等方面有指導(dǎo)作用。組織相容性抗原檢測是移植免疫學(xué)的重要內(nèi)容，應(yīng)用單抗 對其進(jìn)行位點(diǎn)檢測可得到更可信的結(jié)果。人體內(nèi)的淋巴細(xì)胞分為T細(xì)胞、B細(xì)胞和包括NKM胞為代表的第三群細(xì)胞，下 分若干亞群，各有其特異的表面標(biāo)志和功能，據(jù)此建立許多相應(yīng)的檢測方法。臨 床上各種類型的免疫缺陷癥、自身免疫病以及月中瘤等均可出現(xiàn)不同群淋巴細(xì)胞數(shù) 量和功能的變化。因此計(jì)數(shù)外周血和組織內(nèi)淋巴細(xì)胞及其亞群的數(shù)目或比例，以及它們所顯示的功能強(qiáng)弱，可藉此判斷機(jī)體的細(xì)胞免疫水平，對臨床認(rèn)識疾病， 探討其發(fā)病機(jī)制、觀察病情、判斷預(yù)后、考核療效以及防治疾病等方面可提供極 為有用的信息。檢測

3、人T細(xì)胞的特異性抗原，曾采用抗人腦、抗人胸腺細(xì)胞和抗人T細(xì)胞等抗血 清，通過細(xì)胞毒試驗(yàn)或免疫熒光染色加以鑒定。 自抗白細(xì)胞分化抗原的單克隆抗 體問世以來，上述諸多方法均被新方法取而代之。 常用以鑒定和檢測計(jì)數(shù)T細(xì)胞 的表面分化抗原如下表所示。C噸源特異性CD2E受體、全部僚胞和部分N期胞CD3成熱儂胞CD4T輔助修導(dǎo)窈胞、麗、HI帽體CD8T錄傷堀制細(xì)胞、N儂胞的亞型CD25京優(yōu)T郵胞、IL-2受體表T胞表面主要CD抗原及其特異性用單克隆抗體檢測T細(xì)胞表面抗原的方法有兩大類，一類是用標(biāo)記抗體著染，如 免疫熒光法、酶免疫法、生物素-親和素（或鏈霉親和素）系統(tǒng)的ABCt以及免疫金銀染色法；另一類是

4、用抗體致敏的紅細(xì)胞作花環(huán)試驗(yàn)。 兩類方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。 以下敘述有代表性的方法。（一）間接免疫熒光法本法是將分離獲得的外周血單個(gè)核細(xì)胞分別與抗相應(yīng) CD的單克隆抗體（如CD2 CD4 CD8結(jié)合后，洗去游離的抗體，繼加熒光素標(biāo)記的抗小鼠IgG抗血清，經(jīng)溫育結(jié)合后，洗去多余的標(biāo)記抗體，取樣制片，用熒光顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)約200個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，以熒光陽性細(xì)胞與計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)之比，求得相應(yīng)CD抗原陽性的T百分率。如有條件，細(xì)胞經(jīng)熒光標(biāo)記抗體著染后，用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)，快速而 準(zhǔn)確，但需要較多的投資，難以普及應(yīng)用。（二）免疫細(xì)胞化學(xué)法通常用酶免疫檢測法，如APAA酶免疫橋聯(lián)法。為減少非特異性著染，可選用生 物素

5、-鏈霉親和素系統(tǒng)試劑作 ABCt染色。該類方法可用普通顯微鏡觀察，凡呈 棕黃色的細(xì)胞為相應(yīng)CD抗原陽性細(xì)胞，計(jì)其占總淋巴細(xì)胞的百分率。本法簡便 易行，不需特殊儀器，一般試驗(yàn)室均可采用。（三）抗體致敏細(xì)胞花環(huán)法用相應(yīng)的CD單克隆抗體致敏醛化的紅細(xì)胞作為指示物， 它與受檢的細(xì)胞混勻后， 置室溫片刻，繼經(jīng)低速離心，移放室溫作短期溫育或 4c過夜后，重懸取樣涂片 染色鏡檢。凡受檢細(xì)胞周圍粘附有3個(gè)或更多紅細(xì)胞的判為花環(huán)形成細(xì)胞如下圖 所示，共計(jì)數(shù)100200個(gè)細(xì)胞，以花環(huán)形成數(shù)與計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)之比為相應(yīng) CD 抗原陽性細(xì)胞的百分率。本法需有相應(yīng)的致敏紅細(xì)胞試劑，受影響的因素較前兩法多圖顯微鏡下的花環(huán)2、

6、鑒定病原體，準(zhǔn)確診斷感染性疾病。分泌，再同骨髓瘤細(xì)胞雜交建立相應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞株，將病原體的抗原分離單克隆抗體，可以同病原體發(fā)生特異性的抗原-抗體反應(yīng)，通過免疫熒光試驗(yàn)或ELISA試驗(yàn)對疾病進(jìn)行診斷。例如轉(zhuǎn)鐵蛋白、腎素、甲狀腺素 （T4）、三碘甲狀腺 素（T3）、干擾素、補(bǔ)體成分C3 cAMP cGMP生長素、絨毛膜促性腺激素（HCG> 促性腺激素（FSH）、胰島素、IgG、IgE、地高辛、氨茶堿、苯巴比妥、氨基糖花 類抗生素、維生素B12等單抗均可作為體內(nèi)激素或藥物等微量成分的測定。如用于診斷乙肝病毒、丙肝病毒、皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、EB病毒和各種微生物、寄生蟲感染的試劑等。單抗所具有的

7、靈敏度高、特異性好的特點(diǎn)，使其在鑒 別菌種的型及亞型、病毒變異株，以及寄生蟲不同生活周期的抗原性等方面更具 獨(dú)特優(yōu)勢。3、月中瘤的診斷和分型。某些單抗具有在月中瘤部位蓄積的特性， 可用于月中瘤的診斷。目前已批準(zhǔn)使用的診 斷劑有：用于結(jié)腸癌的votomab和arcilumonab,用于探測感染部位的sulemab, 用于卵巢癌的igovomab,用于黑色素瘤的tecnemab K-1。劉例如：瑞振等成功 地制備了抗人DcR3 McAb未來對于肺癌、胃腸道月中瘤、腦惡性膠質(zhì)瘤和胰腺癌 的診斷具有很大的幫助。目前，對月中瘤相關(guān)抗原（如甲胎蛋白、月中瘤堿性蛋白和癌胚抗原）的單抗早就用于 臨床檢驗(yàn)。隨著

8、淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)的應(yīng)用，許多抗人月中瘤標(biāo)記物的雜交瘤細(xì)胞 株已經(jīng)建立，這為月中瘤的早期診斷及其闡明月中瘤的發(fā)生、發(fā)展，了解月中瘤細(xì)胞的生物學(xué)活性及其定量研究奠定了基礎(chǔ)。用抗月中瘤單抗檢查病理標(biāo)本，可協(xié)助確定 轉(zhuǎn)移月中瘤的原發(fā)部位。以放射性核素標(biāo)記單抗可用于體內(nèi)診斷，再結(jié)合X-線斷層掃描技術(shù)，可對月中瘤的大小及其轉(zhuǎn)移灶作出定量診斷。4、機(jī)體微量成分的測定。應(yīng)用單抗結(jié)合其它技術(shù)，可對機(jī)體的多種微量成分進(jìn)行測定。如放射免疫分析， 即是利用了同位素的靈敏性和抗原-抗體反應(yīng)的特異性而建立起來的方法，它可 以測至10-910-12g,使原來難以測定的激素能夠進(jìn)行定量分析。這種激素類 單抗可用于測定體內(nèi)激

9、素水平，判斷內(nèi)分泌的功能狀態(tài)。除了激素，還可檢測諸 多酶類、維生素、藥物和其它生化物質(zhì)。這對受檢者健康狀態(tài)判斷、疾病檢出、 指導(dǎo)診斷和臨床治療均具有實(shí)際意義。3.2 用于疾病的治療1、抗月中瘤單抗，可用于月中瘤的導(dǎo)向治療?？乖轮辛鰡慰估孜魡慰梗╮ituximab ）（美羅華）是第一個(gè)被批準(zhǔn)用于臨床治療 的單抗；它是一種針對CD20抗原的人鼠嵌合型單克隆抗體，進(jìn)入人體后可與 CD2時(shí)異性結(jié)合導(dǎo)致B細(xì)胞溶解，從而抑制B細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)成熟B細(xì)胞凋亡, 但不影響原始B細(xì)胞。隨后上市的適用于乳腺癌治療的曲妥珠單抗為一種針對 HER22/neu的重組人源化IgG單克隆抗體，能特異性識Her22調(diào)控的細(xì)胞

10、表面 蛋白HER22使其通過內(nèi)吞噬作用離開胞膜進(jìn)入核體內(nèi)，抑制其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn) 從 而起到治療月中瘤的作用。，導(dǎo)， 表抗體類藥物及其靶分子而阿倫珠單抗（Alemtuzumab）是人源化、非結(jié)合型單抗，作用靶點(diǎn)為正常與異常 B淋巴細(xì)胞的CD52抗原，對源于B和T細(xì)胞的各種惡性月中瘤具有很好的治療 作用。西妥昔單抗（Cetuximab）和貝伐單抗（如下表所示其獨(dú)特的作用機(jī)理） 是針對大腸癌的治療。曲妥珠單抗在乳腺癌的治療中起著重要的作用；西妥昔單 抗已被證實(shí)它對頭頸部癌，非小細(xì)胞肺癌和結(jié)腸癌等多種月中瘤有效。最新發(fā)表的 EXTREME愛必妥）一線治療復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移性頭頸部癌的研究表明，采用西妥昔單 抗聯(lián)

11、合順鋁或卡柏+ 氟尿喀呢作為一線治療方案，患者的總生存期（OS及無進(jìn) 展生存期（PFS均顯著延長如下圖所示。美國Genentech和Biogen Idec公司宣布2011年1月28日美國食品和藥品監(jiān)督 管理局（FDA）批準(zhǔn)美羅華（Rituxan , rituximab ,利妥昔單抗）作為對初始治療用 美羅華加化療（誘導(dǎo)治療）有療效的晚期濾泡淋巴瘤一種維持治療如下圖所示。美羅華（Rituxan , rituximab ）,利妥昔單抗抗體類衢物靶分子利及濘單抗CD20阿倫庫平抗CH52OfaiumuniHiCD20LumilixlnuibCD23TRU-O61CD37GA-101CD20圖EXTR

12、EMES究單純化療組和化療+西妥昔單抗組的OS圖EXTREMES究單純化療組和化療+西妥昔單抗組的PFS貝伐單抗獨(dú)特的作用機(jī)制可抑制同種免疫反應(yīng)，、抗細(xì)胞表面分子單抗2.主要用于移植排斥反應(yīng)的防治。抗人T淋巴細(xì)月fi單抗（McAb）作為一種新型免疫抑 制劑，已廣泛應(yīng)用于臨床治療自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反應(yīng)。 其作用機(jī) 理有賴于McAb的種類及其免疫學(xué)特性。注射抗小鼠 Thy-1抗原的單抗，可以抑制小鼠同種皮膚移植的排斥反應(yīng)。止匕外，對用于同種骨髓移植的供體骨髓， 在體 外經(jīng)抗T細(xì)胞單抗加補(bǔ)體處理，能減輕移植物抗宿主病的發(fā)生。如莫羅單抗(muromonab- CD3,CD3Orthoclo

13、ne, OKT3是FDA批單克隆抗體，-準(zhǔn)用于腎移植患者防止異體排斥反應(yīng)的第一個(gè)鼠源型McAb此外，人-鼠嵌合抗體Basiliximab、人源化McAbDaclizumab在器官移植排斥反應(yīng)的治療上也取得了良好的效果。O967654321C lo.cio.o,o.o.o.oo,C 9 8 7 6 5 4 lo.o.o.o,o.aHR(95% 1)=0.80(0.64-0.99 卜=0.04單格比升他=之20百出普單酰*叱方皿山打 104月HM1處 ClM)34lO43<6。)*<0.加 1單捷化療tn=noiffiS BI* ttf7 (iitZT：)莫羅單抗(muromonab-

14、 CD3,CD3Orthoclone , OKT3)單克隆抗體，-3、單克隆抗體在其它疾病中的應(yīng)用單克隆抗體藥物不只在月中瘤的治療中取得了很好療效，在其他疾病的治療中也取得了一些療效，例如：奧馬珠單抗(omalizumab)通過與游離IgE結(jié)合而顯著降 低游離IgE的水平，阻斷IgE與肥大細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞結(jié)合，防止炎癥介質(zhì)的釋 放?？娠@著改善哮喘病人的癥狀、肺功能及生活質(zhì)量，減少哮喘惡化的發(fā)作次數(shù)， 減少糖皮質(zhì)激素的用量，使用安全，具有很好的耐受性。Mab03.2C1C2在體外能抑 制白念珠菌芽管的形成，從而抑制白念珠菌對上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，降低 白念珠菌的侵襲力。.圖奧馬珠單抗治療慢性

15、尊麻疹?yuàn)W馬珠單抗(Omalizumab)是人源化DNA克隆抗體，具有：選擇性與血液中 游離IgE結(jié)合，阻斷IgE與Fc e RI或Fc e RII結(jié)合，從而阻斷肥大細(xì)胞或嗜堿 性粒細(xì)胞釋放組胺；當(dāng)游離IgE濃度降到“0時(shí)，能下調(diào)嗜堿性粒細(xì)胞或肥大 細(xì)胞表面Fce R I的表達(dá)，降低效應(yīng)細(xì)胞對過敏原的反應(yīng)性；IgE奧馬珠單抗 復(fù)合物在循環(huán)和組織中積聚，對新進(jìn)入的過敏原分子具有清道夫的作用；馬珠單抗與表達(dá)IgE受體的B細(xì)胞結(jié)合，抑制抗原遞呈。近年來，奧馬珠己被FDA批準(zhǔn)用于治療成人中重度持續(xù)性過敏性哮喘和 12歲以 上兒童患者，對過敏性關(guān)節(jié)炎和類似抗IgE復(fù)合物引起的疾病。Blune JW等首先報(bào)

16、告1例患有中等度持續(xù)性哮喘、結(jié)節(jié)病伴有復(fù)發(fā)性水月中8年的61歲高家索患者，經(jīng)過奧馬珠治療后血管水月中很快意外消失。SpeclDr SL等報(bào)告3例經(jīng)傳統(tǒng)方法不能控制的慢性尊麻疹患者， 其中1例IgE水平低下，抗IgE受體的抗體 水平升高；1例IgE水平升高但抗IgE受體的抗體水平正常；另1例IgE水平非 常高，抗IgE受體的抗體水平也高。3例均按推薦方案給藥，結(jié)果：2例在治療 1周后癥狀完全消失，另1例在6周內(nèi)消失，治療后異常的抗IgE受體的抗體水 平均恢復(fù)正常。Sha iro CA等報(bào)告6例嚴(yán)重性尊麻疹伴有或不伴有水月中病例， 這些患者或者對免疫抑制劑無效或者拒絕，按照哮喘的方法和劑量給藥，間

17、隔時(shí)間依據(jù)尊麻疹或水月中的復(fù)發(fā)情況而定，5/6的患者在治療1周內(nèi)所有癥狀被控制， 逐漸停用其它藥物，1例無效，絕大多數(shù)患者在6個(gè)月后停藥無復(fù)發(fā)。另有研究顯示，輸注英夫利昔單抗（Infliximab ）可快速、顯著緩解頑固性銀屑病、關(guān)節(jié)炎病人的關(guān)節(jié)和皮損癥狀。.圖幼年脊柱關(guān)節(jié)病使用英夫利昔單抗 又如單抗8H8一種抗登革熱病毒核衣殼蛋白（C蛋白）的單抗對登革熱病和登革 熱出血熱/失血性休克綜合征的早期診斷和治療均有一定效果。在艾滋病的治療 上，利用基因工程手段制備的中和抗體 F425-B4e8（ B4e8）,可以中和艾滋病病 毒1上的抗原表位，阻止艾滋病病毒 1對人體正常組織的感染。對自身免疫性

18、疾病的治療，單抗藥物能夠與黏附分子、激活標(biāo)記、抗原或受體靶分子結(jié)合，能 在分子水平上調(diào)節(jié)免疫病理反應(yīng)，從而干擾炎性反應(yīng)的發(fā)生。還有治療感染性休克和膿毒血癥的單抗，個(gè)別也有治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、I型糖 尿病和腸炎的單抗。止匕外，還有臨床試用于預(yù)防器官移植抗排異反應(yīng)、抗血小板 凝集和艾滋病的單抗。3.3 抗腫瘤單抗偶聯(lián)物（生物導(dǎo)彈）抗月中瘤單抗耦聯(lián)物免疫耦聯(lián)物分子由單抗與兩部分構(gòu)成?？捎米鳌皬楊^”的物質(zhì)主要有三類，即放射性核素、藥物和毒素；與單抗連接分別構(gòu)成放射免疫耦聯(lián)物、 化學(xué)免疫耦聯(lián)物和免疫毒素。止匕外，酶結(jié)合單抗偶聯(lián)物、光敏劑結(jié)合單抗偶聯(lián)物 也已進(jìn)入月中瘤治療的研究范疇。單抗靶向治療作用方式（

19、一）、直接作用：通過抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒（ADCC、補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒（CDC 的細(xì)胞溶解效應(yīng)殺傷月中瘤細(xì)胞。（二）、間接作用：單抗作為靶向載體，偶聯(lián)細(xì)胞毒藥物（放射性核素、化療藥 物、毒素等）。靶向月中瘤后利用細(xì)胞毒殺傷月中瘤細(xì)胞。放射免疫治療的作用機(jī)理 主要是間接作用。1、免疫偶聯(lián)物放射免疫治療（RIT）放射免疫耦聯(lián)物放射性免疫耦聯(lián)物是以單克隆抗體為載體，以放射性核素為彈頭 通過抗體特異性結(jié)合月中瘤細(xì)胞相關(guān)抗原，將產(chǎn)生高能射線的放射性核素靶向到腫 瘤細(xì)胞，借助放射性同位素的電離輻射效應(yīng)殺傷月中瘤細(xì)胞或抑制其生長，同時(shí)又降低對正常組織的放射性損傷。實(shí)現(xiàn)對月中瘤的近距離內(nèi)照射治療。RIT利用攜

20、帶 放射性核素的單克隆抗體特異地結(jié)合到病灶部位，減少了對正常組織的損傷。如學(xué)資學(xué)習(xí)網(wǎng)在前列腺癌治療中應(yīng)用最廣泛的抗前列腺特異性膜 抗原的單抗,其CYT- 356為最早制備的一種單抗放射免疫治療圖131I-月中瘤細(xì)胞核人鼠嵌合單抗腦膠質(zhì)瘤免疫導(dǎo)向放療2、免疫毒素免疫毒素是用化學(xué)方法或基因工程方法將月中瘤選擇性單抗與經(jīng)修飾的多肽毒素共價(jià)連接而成的月中瘤治療藥物。免疫毒素可與月中瘤細(xì)胞表面受體或與細(xì)胞表面的 靶抗原相結(jié)合后內(nèi)化，繼而在胞內(nèi)抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致月中瘤細(xì)胞死亡。毒素 有很多種，如植物毒素、細(xì)菌毒素、動(dòng)物毒素。國內(nèi)上海將肺癌單抗與篦麻毒素、 相思子毒素和抗癌藥如阿霉素、絲裂霉素、氨甲喋吟等偶聯(lián)成功。圖 針對CD25的免疫毒素3、化學(xué)免疫偶聯(lián)物單抗化學(xué)免疫耦聯(lián)物單抗與藥物耦聯(lián)物對月中瘤靶細(xì)胞顯示選擇性殺傷