植物蛋白提取

1、植物蛋白提取植物全蛋白提取方法：TCA丙酮沉淀法、Tris-HC1法、Trizol沉淀法 提取法。1 TCA丙酮沉淀法基于蛋白在酸或疏水條件下變性使蛋白濃 縮并去除污染物原理的TCA丙酮沉淀法，最早用 于小麥蛋白的提取，是目前提取植物蛋白的常用 方法之一。具有降低次生代謝物質(zhì)的干擾、減少蛋白降 解等優(yōu)點(diǎn)。TCA能有效地抑制蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的水解作 用，保證在制樣過(guò)程中蛋白質(zhì)不被降解； 丙酮溶 液能除去樣品中的酚類(lèi)及色素等干擾物質(zhì)，同時(shí)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用的高速離心辦法能較好地去除 多糖的影響。然而該方法的一個(gè)最大缺點(diǎn)是蛋白 質(zhì)很難重新溶解，而且樣品中的非蛋白成分很難 除去，可能會(huì)丟失膜蛋白和疏水性蛋白

2、，導(dǎo)致 2-DE圖譜上有明顯的橫縱條紋。在研磨樣品時(shí)加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或 交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮（PVPP）用來(lái)吸附樣品中 富含的酚、 醌類(lèi)物質(zhì)。它們能通過(guò)疏水鍵與酚 類(lèi)形成復(fù)合物，離心可以去除該復(fù)合物。然而，TCA丙酮沉淀法中與蛋白共沉淀的污染物在隨后 的有機(jī)溶劑清洗步驟中通常難以去除，可以通過(guò) 振蕩和延長(zhǎng)蛋白沉淀在裂解緩沖液中溫育時(shí)間 的方法來(lái)增加蛋白的溶解能力。在提取的過(guò)程中同時(shí)加入了 TCA、3 -巰基乙醇及DTT 3種藥 劑可以更好的抑制蛋白質(zhì)的水解及去除干擾物質(zhì)。TCA丙酮提取法耗時(shí)少且容易操作，一般 作為植物蛋白提取的初始方案，該方法常用于 幼嫩組織中蛋白的提取，對(duì)更為復(fù)

3、雜的植物組 織該方法并非最佳選擇。但該方法還是在植物 蛋白的提取中占有重要位置，很多木本植物的樣品應(yīng)用該方法效果很好，如鵝掌 楸葉片、巴 東木蓮的雌蕊柱頭、檳榔葉片、銀杏葉片及枝條、茶樹(shù)葉片及芽、紅豆杉的愈傷組織、石斛葉 片等。草本植物中的大豆葉片、生菜葉片、黃瓜 葉 片、番茄子葉、龍膽花芽、灰木相思葉片等 應(yīng)用該方法 都獲得了較清晰的2-DE圖譜。TCA protein precipitati on protocolStock Solutions: 100%(w/v) Trichloroacetic acid (TCA)recipe: dissolve 500g TCA(as shipped

4、) in to 350 ml dH2O, store at RT.Precipitatio n Protocol:1. Add 1 volume of TCAstock to 4 volumes of protein sample.i.e. i n 1.5ml tube with maximum vol., add250 卩 l TCA to 1.0ml sample.2.1 ncubate 10 min at 4° C.3. Spin tube in microcentrifugeat 14K rpm,5 mi n.4. Remove super nata nt,leav ingp

5、rote inpellet in tact. Pellet should be formed from whitish,fluffy ppt.5. Wash pellet with 200 卩 l cold acetone.6. Spi n tune in microfuge at 14K rpm, 5mi n.7. Repeat steps 4-6 for a total of 2 acet one washes.8. Dry pellet by placing tube in 95° C heatblock for 5-10 min to drive off acet one.9

6、. For SDS-PAGE, add 2X or 4X sample buffer (with or without bME) and boil smaple for10 min in 95° C herat block before loadingsmaple on to polyacrylamide gel.2 Trizol 沉淀法與TCA丙酮沉淀法相比，Trizol沉淀蛋白 質(zhì)的方法可有效地除去色素、酚類(lèi)等干擾電泳 的化學(xué)物質(zhì)，特 別是對(duì)植物樣品中高豐度蛋白 Rubisco1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧 酶(Ribulose-1,5-bisphosphatecarboxyl

7、ase/oxygenase，通常簡(jiǎn)寫(xiě)為 RuBisCO。 采用此方法能夠減少高豐度蛋白對(duì)2-DE結(jié)果的干擾。植物樣品中高豐度蛋白(如 Rubisco )的 存在對(duì)其他蛋白質(zhì)，尤其是低豐度蛋白的檢測(cè)的 影響也很大，因此，選擇合適的蛋白質(zhì)制備方法 尤其重要。另外，使用聚乙二醇也可以去除該蛋 白，效果較好。Trizol法相對(duì)于酚法蛋白質(zhì)獲 得產(chǎn)率高，方法操作亦不復(fù)雜，但對(duì)試劑要求嚴(yán) 格，大量制備樣品時(shí)成本較高。目前使用此方法 的植物比較少，對(duì)野牛草的種子、幼苗葉片及黃 花苜蓿幼苗提取蛋白的效果很好。1. 取凍存組織加入 1ml Trizol(invitrogen )勻漿，樣品量不可超過(guò)總體積的 10

8、%室溫孵育5min，超聲粉碎至組織完全溶于 液體中；2. 加入0.2ml氯仿，劇烈晃動(dòng)15s，室溫孵 育 2-3min , 4C 12000X g 離心 15min;此時(shí)溶液 分為水相和有機(jī)相。3. 小心吸取并丟棄上層水相（該水相中富含 細(xì)胞總RNA用于提取RNA進(jìn)行PCF實(shí)驗(yàn)）；4. 在剩下的中間層及有機(jī)相中加入 0.3ml 無(wú)水乙醇，顛倒充分混勻后室溫放置2-3min ,4C 下 2000 X g 離心 5min;5. 小心吸取并收集上層有機(jī)相（沉淀為 DNA,轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入1.5ml異丙醇， 輕輕混勻后室溫放置10min, 4C下12000X g離 心10mi n;此時(shí)沉淀為蛋

9、白。6. 棄上清液，加2ml 0.3M鹽酸胍（95%乙 醇溶解）清洗沉淀3次，每次清洗過(guò)程中，先將 沉淀保存于清洗液中20min，然后在4C下7500 X g離心5min。最后一次清洗后，丟棄上層液相， 將沉淀懸浮于2ml乙醇中，渦旋震蕩15s后在室 溫下放置20min,然后在4C下7500X g離心 5mi n。7. 丟棄上層液相，將沉淀真空干燥5-10min。 然后將沉淀溶解于1% SDS（十二烷基硫酸鈉） 中。在50C水浴中反復(fù)吹打以助溶。不溶物在 4C下10000X g離心10 min去除。收集上清，轉(zhuǎn)移到新的收集管中。該上清中的蛋白樣品可直 接用于 Western Blotting

10、實(shí)驗(yàn)或保存于-20 C。 常見(jiàn)問(wèn)題：1. 得率低：樣品裂解或勻漿處理不徹底； 最后得到的蛋白質(zhì)沉淀未完全溶解2. 蛋白質(zhì)降解：組織取出后未馬上冷凍3.電泳時(shí)條帶變形：蛋白質(zhì)沉淀洗滌不充 分3 Tris-HC1 法Tris-HCI法在膜蛋白和疏水性蛋白的提取 方面有所改善。用含SDS的Tris-HCI與TCA丙 酮聯(lián)合使用提取蛋白質(zhì)；用80%勺丙酮洗滌以除 去水溶性雜質(zhì)（包括高濃度的鹽離子），比TCA丙 酮法利用高速離心與丙酮洗滌的方法能更有效 地排除雜質(zhì)，也比傳統(tǒng)的脫鹽和透析方法要省時(shí) 省力。Tris-HC1法提取的蛋白圖譜效果明顯比 用TCA丙酮法提取的效果好，主要表現(xiàn)在不同分 子量范圍內(nèi)蛋

11、白點(diǎn)的數(shù)目及分離效果方面。TCA丙酮法所提取蛋白在小分子量區(qū)域分布不均勻， 蛋白點(diǎn)不清晰，水平條紋與豎直條紋較為嚴(yán)重， 而Tris-HC1法克服了上述缺點(diǎn)，并分離出 TCA 丙酮法所不易分離出的酸性蛋白，TCA丙酮法能 夠得到較多中等分子量蛋白而 Tris-HC1法除了 分離到較多的中等分子量的蛋白質(zhì)外， 還得到了 很多的高分子量和低分子量蛋白質(zhì)。另外， Tris-HC1法操作簡(jiǎn)便，時(shí)間較短，成本適中， 提取步驟簡(jiǎn)單，減少了因處理步驟繁多而造成的 蛋白 質(zhì)的損失，大大提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性。 Tris-HC1法對(duì)箭毒木種子、白樺花芽及蘋(píng)果葉 片的提取效果非常好。在清洗步驟中，用10倍 體積 的

12、-20 C預(yù)冷10% TCA丙酮沉降蛋白質(zhì)， 實(shí)驗(yàn)表明Tris-HCl提取法所得圖譜背景清晰， 沒(méi)有橫縱條紋及 彌散狀的蛋白質(zhì)點(diǎn)，蛋白質(zhì)點(diǎn) 數(shù)最多。(1) 準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5g葉片，剪碎后加入 0.25mLTris-HCL溶液冰浴研磨。(2) 加入0.75mL提取液。(7moL/L尿素， 2moL/L 硫脲，0.4%CHAP，10mmoL/LDT)(3) 研磨至勻漿后，轉(zhuǎn)移至 1.5mL離心管 中，10000r/min 。(4) 取上清，即為含蛋白樣品。植物提取蛋白定量：總蛋白定量分析1.常用的總蛋白定量分析方法。檢機(jī)制攻點(diǎn)230 nfH01-101mg mil不莘藥工污神炷剖,越異筍二商啟nm融

13、或口？*到Cu1*） 心與20*2000 mg'ml羊言去舌刑和受性711去耳遽f氏克不萍哥迅哼FEracfordjXi 斷也d70 nn善刖浣益鍛料和蛋口質(zhì)之就 時(shí)20 20GOFriQ'mlLowry750 nm蛋逵翩鈉串三市備蘭物翅瞑Falin-Ciocalteu1D-1DOO rngtnl不兼容去潮礎(chǔ)撕1,2針對(duì)特定蛋白的定量檢測(cè) 常用的方法是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，免疫印跡分析 和質(zhì)譜。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA ）是溶液中特定蛋白 定量的一種常用方法。通常是在 96孔板上進(jìn)行 的。關(guān)鍵步驟是特定抗原/蛋白的固定。具體來(lái) 說(shuō)，ELISA有不同

14、變種。直接或間接 ELISA， 是特定抗原/蛋白直接吸附到檢測(cè)板。封閉未被 抗原包被的孔板表面，然后在孔板中加入酶標(biāo)（直接ELISA ）或未酶標(biāo)（間接 ELISA ）的第 一抗體，在測(cè)試孔板中，一抗與抗原 /蛋白相結(jié) 合。對(duì)于未酶標(biāo)的第一抗體，加入酶標(biāo)的第二抗 體與第一抗體結(jié)合。最后，加入酶底物（通常， 四甲基聯(lián)苯胺-TMB或堿性磷酸酶-AP），溶液 發(fā)生顏色變化，使用分光光度計(jì)檢測(cè)。顏色變化 與蛋白質(zhì)濃度是直接相關(guān)的。ELISA常用的一個(gè) 變種是夾心ELISA，也就是說(shuō)，特定抗原/蛋白 結(jié)合在孔板表面包被的第一抗體（捕獲抗體）和 酶標(biāo)的第二抗體（檢測(cè)抗體）之間。直接ELISA 的優(yōu)點(diǎn)是速度快

15、，并且沒(méi)有第二抗體的交叉反應(yīng) 問(wèn)題，但局限是，第一抗體的標(biāo)記可能是費(fèi)時(shí)和 昂貴的。此外，信號(hào)放大是最弱的。因此，間接 ELISA是更常用的，因?yàn)榭梢詮墓举I(mǎi)到各種各 樣的第二抗體，最重要的是靈敏度提高了。然而, 可能會(huì)發(fā)生第二抗體的交叉反應(yīng)。最后，任何 ELISA測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的一個(gè)重要環(huán)節(jié)都是蛋 白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，通常是連續(xù)稀釋已知濃度的蛋白 質(zhì)，從而繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。免疫印跡分析免疫印跡只能半定量。通過(guò)凝膠電泳把原始或變 性的蛋白質(zhì)分開(kāi)。把蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜（硝酸纖維素或 polyvi nylidene-PVDF ），然后使用特定的酶標(biāo) 抗體檢測(cè)。最后，加入適當(dāng)?shù)牡孜铮ɑ瘜W(xué)發(fā)光底 物）產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。雖

16、然免疫印跡比ELISA 更費(fèi)時(shí)，但是免疫印跡不僅可以對(duì)特定的蛋白進(jìn) 行定量，而且可以在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)檢測(cè)蛋白質(zhì) 修飾。蛋白質(zhì)質(zhì)譜蛋白質(zhì)質(zhì)譜是蛋白質(zhì)定量的新興方法。 在蛋白質(zhì) 組學(xué)分析中，除了蛋白定性之外，一個(gè)重要的步 驟就是對(duì)特定的蛋白的定量。質(zhì)譜蛋白定量的方 法有很多。常用的方法，較重的穩(wěn)定同位素碳（13C）或氮（15N ）加入到第一個(gè)樣本（多肽 或蛋白質(zhì)），而相應(yīng)的輕同位素（12C和14N） 加入到第二個(gè)樣本（內(nèi)標(biāo)），然后混合這兩個(gè)樣 本進(jìn)行分析。由于兩個(gè)樣本的質(zhì)量差，用質(zhì)譜分 析儀測(cè)定的兩個(gè)樣本峰強(qiáng)度的比值，就相當(dāng)于其 相對(duì)豐度比。質(zhì)譜蛋白定量的第二種方法，可以 不用標(biāo)記樣本（即用基質(zhì)輔

17、助激光解吸 /電離- MALDI分析）。這里，我們要強(qiáng)調(diào)的是，使用 質(zhì)譜這種通用方法就可以在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)定 量和定性檢測(cè)。然而，這種方法需要的檢測(cè)儀器 可能不是任何實(shí)驗(yàn)室都能買(mǎi)得起，這可能就限制 了這種方法的使用。非變性膠與變性膠區(qū)別：非變性凝膠里面沒(méi)加變性劑，一般是SDS。非變性膠跑出來(lái)的蛋白能保持其活性一般用做功 能試驗(yàn)，如EMSA。由于沒(méi)有變性劑的原因非變 性膠電泳時(shí)除了與蛋白分子量有關(guān)也會(huì)受都電 荷的影響，因此對(duì)蛋白等電點(diǎn)的確定和緩沖液的 酸堿性有注意，有時(shí)需要倒轉(zhuǎn)電泳時(shí)的正負(fù)極。從跑的膠來(lái)看，變性膠會(huì)比較好看，帶比較窄， 非變性膠跑出來(lái)則比較粗糙。Western blot prot

18、ocol步驟：1. 分離膠和積層膠，制膠板；注意：灌分離膠時(shí)不要加太多。2. 蛋白變性：準(zhǔn)備蛋白樣本，加入等體積的 2X 上樣Buffer稀釋?zhuān)糜诜兴兄?10min （預(yù)染 marker 煮 5min）3. 加樣：每孔加入2040卩l(xiāng)樣品4. 電泳：置于電泳槽中電泳45min，恒定電流90mA（2塊板），如為1塊板則電 流為50mA5. 取出膠板，用切割刀修好膠；6. 將膠置于轉(zhuǎn)膜液中浸泡7. 按順序放好下列物質(zhì)：黑面海綿濾紙膠NC膜濾紙（用吸管趕去氣 泡）海綿；8. 置于轉(zhuǎn)膜槽中于，黑面對(duì)黑面，加上冰塊，加入轉(zhuǎn)膜液；9. 裝好電極，于恒定電壓 100V下，90min；10. 麗春紅染膜；

19、11. 用TBST洗去麗春紅；12. 封閉：加入5%脫脂奶粉+ TBST常溫?fù)u床搖1h；13. 回收封閉液，加入一抗【一抗用 5% BSA+ TBS稀釋】；14. 置于4 °C搖床搖過(guò)夜；15. 回收一抗，TBST洗膜，10min，共 3 次；16. 加入二抗【二抗用5%脫脂奶粉+ TBS稀釋】 常溫?fù)u床搖1h；17. 回收二抗，TBST洗膜，10min，共 3 次；18. 將膜置于發(fā)光液中浸泡約1mi n；19. 將膜鋪于曝光盒中，于暗室中曝光，洗膠片。常用溶液配制：I 細(xì)胞裂解液（PLC Lysis Buffer ）Final concen trati on100ml500ml1

20、M Hepes(pH7.5)50mM5ml25ml5M NaCl150mM3ml15mlGlycerol10%10ml50ml50mM MgCI21.5mM3ml15mlTriton X 1001%1ml5ml0.5M1mM200卩1mlEDTA(pH8.0)l0.1M NaPPi10mM10ml50ml0.5M NaF10Mm2ml10ml每次提取蛋白前加入1 %蛋白酶抑制劑II . SDS-PAGE膠配方及其它常用溶液的配制1. 30%烯酰胺丙烯酰胺29gN-N -亞甲雙丙烯酰胺 1g溶于總體積為60ml的水中，加熱至37 C使其 溶解，補(bǔ)加水至終體積為100ml。用Nalgene濾器 （

21、0.45卩n孔徑）過(guò)濾除菌或 Whatmar!號(hào)濾紙過(guò) 濾，查證該溶液的pH直不大于7.0，置棕色瓶中 保存于RT。注：（1）丙烯酰胺是強(qiáng)烈的神經(jīng)毒素，可經(jīng)皮膚 吸收，丙烯酰胺的作用具累積性。（2）稱(chēng)取時(shí)，必須戴手套、口罩；取溶液時(shí) 也要戴手套。（3）貯存期間，丙烯酰胺和雙丙烯酰胺緩慢 轉(zhuǎn)化為丙烯酸和雙丙烯酸，這一脫氨反應(yīng)是光催 化和堿催化的。應(yīng)檢查丙烯酰胺溶液的pH直是否 在7.0或更低，并應(yīng)在RT下避光保存。每隔數(shù)月 應(yīng)重新配制溶液。2. 3M Tris-HCI,pH8.8 （用于分離膠）Tris 堿分子量為121.1。將72.66gTris堿溶于 重蒸水（不超過(guò)200ml）中，加濃鹽酸調(diào)

22、節(jié)pH至 8.8，讓溶液泠卻至RT,再最終調(diào)至所需pH直。 加重蒸水定容至 200ml, 1.034 x 105 Pa, 20min 高壓滅菌，RT貯存。注：（1）如溶液呈現(xiàn)黃色，應(yīng)予丟棄，并置備 質(zhì)量更好的Tris.（2）Tris溶液的pH值因溫度而異，溫度每升高1C, pH直大約降低0.03個(gè)單位。3. 2M Tris-HCl,pH6.8 （用于積層膠）同上方法，將48.44gTris堿加重蒸水定容至200ml，加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.8。4. 10%十二烷基硫酸鈉（SDS在900ml水中溶解100g電泳級(jí)SDS加熱至68 C助溶，加入幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH直至7.2，加水定容至1L,分裝

23、備用。注: SDS勺微細(xì)晶粒易于擴(kuò)散，因此稱(chēng)量時(shí)要 戴面罩，稱(chēng)量完畢后要清除殘留在稱(chēng)量工作區(qū)和 天平上的SDS 10%SD溶液無(wú)須滅菌。5. TEMED（N,N,N ,N'-四甲基乙二胺）TEMED通過(guò)催化過(guò)硫酸銨形成自由基而加速 丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的聚合。由于 TEME只能 以游離堿的形式發(fā)揮作用，因此pH值較低時(shí)聚合 反應(yīng)受到抑制。6. 10%±硫酸胺過(guò)硫酸胺提供驅(qū)動(dòng)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的自由基。可用去離子水配制小量10%(W/V的貯存液于保存于4C。由于過(guò)硫酸銨會(huì) 緩慢分解，故應(yīng)隔新鮮配制。方法：把IgAPS溶解于終量為10ml水溶液中，4 C保存數(shù)周。7.

24、 電泳緩沖液 SDS buffer: 10X(running buffer )Tris base 30.3gGlyc ine 144.0gSDS 10.0gddHO to 1L(1X cone: 25mM Tris base, 192mM glycine,0.1%SDS,)8. 轉(zhuǎn)膜緩沖液 Transfer Buffer(10 x) pH8.3Tris base 30.3gGlyc ine 144.0g20%v/v metha nol (Fresh!)ddH2O to 1 L(1X cone: 25mM Tris base, 192mM glycine, 200ml methanol)9. T

25、BST(10X) pH: 7.5Tris base 24.2gNaCl 80.0gTwee n-20 10 mlddHO to 1L (1X conc: 100mM Tris base, 150mM NaCl,0.1%Twee n20)10. Tris 緩沖鹽溶液(1X TBS, 25mmol/LTris )NaCI 8.0gKCI 0.2gTris 堿 3.0g溶解于800ml蒸餾水中，加入0.015酚紅并用 HCI調(diào)pH值至7.4，用蒸餾水定容至1L,分裝 后在 15lbf/in 2(1.034 X 105 Pa)，高壓下滅菌 20min, RT貯存。11. 發(fā)光劑100mM Tris Base (pH8.5)10 ml