實(shí)驗(yàn)六果蠅唾液腺染色體的觀察及制備

1、實(shí)驗(yàn)五 果蠅唾液腺染色體的觀察及制備 一.目的1. 了解果蠅唾液腺染色體的形態(tài)學(xué)及遺傳學(xué)特征。2. 習(xí)分離果蠅幼蟲(chóng)唾液腺的技術(shù)。3. 掌握唾液腺染色體制片方法。二、原理蠅、搖蚊幼蟲(chóng)唾液腺細(xì)胞中的巨大染色體。雙翅目昆蟲(chóng) 的唾液腺細(xì)胞發(fā)育到 一定階段之后就不再進(jìn)行有絲分裂 ,而 永久停留在分裂間期。但隨著幼蟲(chóng)的生長(zhǎng) ,唾 液腺染色體仍 不斷地進(jìn)行自我復(fù)制而且不分開(kāi) ,經(jīng)過(guò)許多次的復(fù)制形成約 1 000 4 000拷貝的染色體絲，合起來(lái)直徑達(dá)5卩m長(zhǎng)度達(dá)400卩m比普通細(xì)胞中期染色體約 大100150倍，所以又稱(chēng)為多線染色體（polytene chromosome或巨大染色體（giant chrom

2、osome。唾液腺染色體的另一特點(diǎn)是體細(xì)胞中同源染色體處于 緊密配對(duì)狀態(tài) ,這種狀態(tài) 稱(chēng)為“體細(xì)胞聯(lián)會(huì)”。在以后不斷 的復(fù)制中仍不分開(kāi) ,由此成千上萬(wàn)條核蛋白纖維絲 唾液腺染 色體（salivary gland chromosome是一類(lèi)存在于雙翅目 昆蟲(chóng),如果結(jié)合在一 起，緊密盤(pán)繞。所以細(xì)胞中染色體只呈 單倍數(shù)。黑腹果蠅的染色體數(shù)目2n=8其中 第U、第川染色體為中部著絲粒染色體，第W染色體和第IX染色體為端著 絲粒染 色體。唾液腺染色體形成時(shí) ,染色體著絲粒和近著絲粒的異染色質(zhì)區(qū)聚于一起形成一個(gè)染色中心（chromo-center ,所以在光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)從染色中心 處伸出 6條配對(duì)的染色

3、體 臂,其中 5條為長(zhǎng)臂 , l 條為緊靠 染色中心的很短的臂。唾液腺染色體經(jīng)染色后，呈現(xiàn)深淺不同,疏密各異的橫紋（band。這些橫紋的數(shù)目 ,位置,寬窄及排列順序都具有 物種的特異性。研究認(rèn)為這些橫紋與染色體的基因 是有一定 關(guān)系的。通過(guò)一定的實(shí)驗(yàn)方法使果蠅唾液腺染色體各臂分散 開(kāi), 并且使帶 紋、 膨突等特征不受雜質(zhì)影響清晰地顯示出來(lái) , 是進(jìn)行果蠅遺傳學(xué)研究的很重要的一個(gè)環(huán)節(jié) .果蠅唾液腺染 色體在不同種間的共同點(diǎn)是染色體的著絲點(diǎn)位于一個(gè)染色 區(qū)域 ,但不同的種類(lèi)往往其染色體臂數(shù)目不同 .每條染色體 臂上分布著染色深淺不 同、粗細(xì)各異的磺紋 （band, 這些 橫紋的寬窄疏密程度以及排列

4、順序和數(shù)目又都有 種的特異 性和種內(nèi)的差異 . 由此, 果蠅唾液腺染色體近幾十年來(lái) , 已 廣泛用于種內(nèi)系 統(tǒng)發(fā)生和種間親緣關(guān)系的研究中 , 因?yàn)榉N 間及種內(nèi)不同品系和近緣種中的遺傳差異 經(jīng)常反映在唾液腺染色體的不聯(lián)會(huì)、形成泡（puff、縊虞（constriction和間帶區(qū)的 伸縮性以及頂體（telomere的形態(tài)等多方面的差異，而特別重要的是研究它的基因序 列的差異 （觀察是否產(chǎn) 生了例位以及染色體的斷裂、融合和重排. 因此,無(wú)論從 細(xì)胞遺傳學(xué)的角度研究基因與突變性狀之間的聯(lián)系,還是從進(jìn)化遺傳遺傳學(xué)方面研究染色體的系統(tǒng)發(fā)生 ,探討種間以及 近緣種間的遺傳差 異和生殖隔離的機(jī)制等 ,唾液腺染

5、色體的 分析研究都是十分重要的 .從其橫紋分布特 征可對(duì)物種的進(jìn) 化特征進(jìn)行比較分析 ,而一旦染色體上發(fā)生了缺失 ,重復(fù), 倒位。易 位等結(jié)構(gòu)變化 ,也可較容易地在唾液腺染色體上觀 察識(shí)別出來(lái)。三、儀器設(shè)備及材料 ,試濟(jì) 儀器設(shè)備:解剖鏡,顯微鏡,恒溫培養(yǎng)箱,鑷子,解剖針, 載玻片及蓋玻片 ,吸水紙 解剖鏡,顯微鏡,恒溫培養(yǎng)箱 ,鑷子,解剖針,載玻片及蓋 玻片。材料：黑腹果蠅（Drosophila melanogaster三齡幼蟲(chóng) 試劑:醋酸洋紅液，蒸溜水，濃 鹽酸五、實(shí)驗(yàn)步驟1. 材料準(zhǔn)備 發(fā)育充足、肥大的三齡幼蟲(chóng) ,唾液腺和唾液腺 細(xì)胞發(fā)育良好。利用 這樣的唾液腺細(xì)胞才能制備出理想的染 色

6、玻片標(biāo)本。因此要求培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富 ,含 水量較高。比較 松軟,發(fā)酵良好。2. 剝離唾腺 在一干凈載玻片上滴一滴生理鹽水 ,選擇行動(dòng) 遲緩、肥大、爬在管 壁上即將化蛹的三齡幼蟲(chóng) ,或者選擇經(jīng) 低溫處理的果蠅三齡幼蟲(chóng)置于載玻片上。如 果分不清頭尾著 可以從它爬行的時(shí)候確認(rèn)其頭尾 ,由于果蠅的唾液腺位于幼蟲(chóng)體前 1/3-1/4處,所以在解剖鏡下左手持解剖針按壓住幼蟲(chóng)后端 1/3 處。固定幼蟲(chóng),右手持解剖針扎住幼蟲(chóng)頭 部口器處 ,適當(dāng)用力向后拉 ,把頭部與身體拉開(kāi) ,唾液 腺腺 體隨之而出。把載玻片移到顯微鏡下查找唾液腺。果蠅的唾 液腺是位于口器 后端神經(jīng)節(jié)兩側(cè)的一對(duì)透明而微白的類(lèi)似 香蕉形的長(zhǎng)形小囊

7、 ,由單層細(xì)胞構(gòu)成。細(xì) 胞大,細(xì)胞核大 , 細(xì)胞輪廓清晰。用解剖針先將含有腺體的一團(tuán)組織與其它組織分開(kāi).然后再將腺體與脂肪等組織分開(kāi) .得到透明的香蕉 狀的唾液腺。3. 低滲處理 :將唾液腺放于低濃度的 Nacl 溶液中處理 10-15min, 以使細(xì)胞充分 吸水而容易弄破。4. 解離將唾液腺在載玻片上滴一滴Imol /L HCI,讓唾液 腺在Imol /L HCI中解 離 2-3分鐘,以松軟組織,利于染 色體分散。5. 染色 解離后的腺體可用水沖洗 2-3次后滴 2 滴品紅染 液染色 20分鐘 （解剖 和染色過(guò)程勿使腺體于燥 。在酒精燈 上加熱以增強(qiáng)染色效果?？梢圆唤?jīng)解離一步 而直接染色 ,

8、也 可以在將幼蟲(chóng)頭部與身體拉開(kāi)后馬上加染液染色 ,然后慢慢 剖離腺體 .6. 滴片 當(dāng)腺體被染成紅色后 ,用濾紙擦去染液周?chē)蝗Φ?黑色沉淀物 ,再用蒸餾 水沖洗 2 3次,然后加上蓋玻片 , 在蓋玻片上方再植蓋一層濾紙 ,用鑷子在蓋玻片 ,輕 輕敲擊 幾下。再用拇指按住蓋玻片用力下壓 ,把腺體細(xì)胞壓破 ,把 染色體壓散開(kāi) .壓 片時(shí)放載玻片的桌面要干 ,不要使蓋片滑 動(dòng)。制好的玻片標(biāo)本用蠟封住蓋玻片四周 以防干燥。經(jīng)低溫 冷凍處理的材料經(jīng)解離 ,染色.加蓋片后不必敲擊 .鏡檢即 可看到 分散良好的染色體。7. 觀察 將制好的片子先用低倍顯微鏡觀察。找到好的染色體于視野中心 ,再用高倍鏡觀察之

9、。如果制片理想 ,可做成 永久制片。8. 攝影 仔細(xì)觀察的唾液腺染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)并攝像。五.實(shí)驗(yàn)結(jié)果在顯微鏡下我們看到的結(jié)果如下六思考與討論1何謂先染色體1 j種纜狀的巨型染色體,見(jiàn)于有些生物生命周期的某 些階段里的某些細(xì)胞中。L1J核內(nèi)有絲分裂產(chǎn)生的參股染色 單體平行排列血成。各染色單體上的染色粒（見(jiàn)燈刷染色 ?。┎⑴排帕?，構(gòu)成多線染色體的帶，帶與帶Z間則稱(chēng)間 帶稔多線染色體的這種結(jié)構(gòu)可用光學(xué)顯微鏡觀察，也能在多線染色體上用原位分子雜交法進(jìn)行基因定位，并就其結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)研究，因此是細(xì)胞學(xué)和遺傳學(xué)研究的有用材料。核內(nèi)DNA多次復(fù)制 產(chǎn)生的子染色體平行排列，且體細(xì)胞內(nèi)同源染色體配

10、對(duì)，緊密結(jié)合在一起，從而阻止 了染色體纖維進(jìn)一步聚縮，形成體積很大的由多條染色體 組成的結(jié)構(gòu)叫多線染色 體。多線化的細(xì)胞處于永久間期，體積也相應(yīng)增大，它存在于雙翅目昆蟲(chóng)的 幼蟲(chóng)組織內(nèi)，如唾液腺、氣管等。2.如何區(qū)別你看到的就是唾腺染色體？答：（1）由于在唾液腺細(xì)胞中8條染色體之間以著絲粒互相 連結(jié)在一起形成染色盤(pán)或 異染中心和同源染色體之間的假 聯(lián)會(huì)，經(jīng)堿性染料染色后，可以觀察到一個(gè)染色 較深的染色 盤(pán)和以染色盤(pán)為中心向外輻射出的 5條染色體臂。（2在這些染色體臂 上可以看到染色深淺不同， 被稱(chēng)做明 帶、暗帶的橫紋，這些橫紋的位置，寬窄、 數(shù)目都具有 物種的特異性。不同物種，不同染色體的不同部

11、位形態(tài)位置是固定的。因此根據(jù)染色體各條臂帶紋特征和各條臂端部帶紋特征能準(zhǔn)確識(shí)別各條染色 體。（3在染色體臂上還可看到某些帶紋通過(guò)染色體的解旋、膨大形成的疏松區(qū)和巴爾比尼氏環(huán)，其富含轉(zhuǎn)錄出來(lái)的 RNA，因此 不著色（4）.唾液腺細(xì)胞處于永 久早期，染色體解旋呈伸展?fàn)顟B(tài)在幼蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞核中的 DNA 多次 復(fù)制， 但細(xì)胞、 細(xì)胞 核不分裂。 復(fù)制后的染色單體 DNA 不分開(kāi)，從而形成了多線染色體（ 5）每一臂 上所有的 每一臂上所有的 橫紋的大小和位置是恒定的，即具有種的特征。 橫紋的 大小和位置是恒定的，即具有種的特征。 3.在昆蟲(chóng)學(xué)中，二齡幼蟲(chóng)，三齡幼蟲(chóng)有何 生物學(xué)意義？答： 果蠅是完全變

12、態(tài)發(fā)育的生物之一，二齡幼蟲(chóng)，三齡幼蟲(chóng)是其 變 態(tài)發(fā)育的重要特點(diǎn)。從初生卵發(fā)育至新羽化的成蟲(chóng)為一個(gè) 完整的發(fā)育周期，在 25C, 60%相對(duì)濕度條件下，大約為10天。通過(guò)控制養(yǎng)殖的溫度，可以加速和減 緩果蠅的發(fā)育。 果蠅個(gè)體很小，幼蟲(chóng)在三齡時(shí)達(dá)到最大，約 2 毫米，成年果 蠅也 僅為 23 毫米。新羽化的雌性成蟲(chóng)大約 8 小時(shí)之后即 可進(jìn)行交配，交配之后大約 40 小時(shí)開(kāi)始產(chǎn)卵，第 4-5 天出現(xiàn) 產(chǎn)卵高峰。性成熟雌性果蠅生殖能力很強(qiáng)，產(chǎn)卵 初期每天可 達(dá)5070枚，累計(jì)產(chǎn)卵可達(dá)上千枚。 黑腹果蠅是最普遍應(yīng)用于遺傳學(xué) 的果蠅，也是奠定經(jīng)典遺傳 學(xué)基礎(chǔ)的重要模式生物之一，對(duì)其染色體組成和表 型、基因 編碼和定位的認(rèn)識(shí)，是其它生物無(wú)法比擬的?；谇逦倪z 傳背景和便 捷