小木蟲分離過柱子經(jīng)驗(yàn)

1、柱層析淺談 極性小的用乙酸乙酯：石油醚系統(tǒng)極性較大的用甲醇：氯仿系統(tǒng)極性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系統(tǒng)拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸 硅膠柱層析下面介紹慣用的方法：勻漿法。1。稱量。200-300目硅膠，稱30-70倍于上樣量；如果極難分，也可以用100倍量的硅膠H。干硅膠的視密度在0.4左右，所以要稱40g硅膠，用燒杯量100ml也可以。2。攪成勻漿。加入干硅膠體積一倍的溶劑用玻璃棒充分?jǐn)嚢?。如果洗脫劑是石油?乙酸乙酯/丙酮體系，就用石油醚拌；如果洗脫劑是氯仿/醇體系，就用氯仿拌。如果不能攪成勻漿，說明溶劑中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不與水配伍走分配色譜的話，必須預(yù)先用無水硫酸

2、鈉久置干燥。氯仿用無水氯化鈣干燥，以除去1%的醇。如果樣品對酸敏感，不能用氯仿體系過柱。3。裝柱。將柱底用棉花塞緊，不必用海沙，加入約1/3體積石油醚（氯仿），裝上蓄液球，打開柱下活塞，將勻漿一次傾入蓄液球內(nèi)。隨著沉降，會有一些硅膠沾在蓄液球內(nèi)，用石油醚（氯仿）將其沖入柱中。4。壓實(shí)。沉降完成后，加入更多的石油醚，用雙聯(lián)球或氣泵加壓，直至流速恒定。柱床約被壓縮至9/10體積。無論走常壓柱或加壓柱，都應(yīng)進(jìn)行這一步，可使分離度提高很多，且可以避免過柱時由于柱床萎縮產(chǎn)生開裂。5。上樣。干法濕法都可以。海沙是沒必要的。上樣后，加入一些洗脫劑，再將一團(tuán)脫脂棉塞至接近硅膠表面。然后就可以放心地加入大量洗脫

3、劑，而不會沖壞硅膠表面。6。過柱和收集。柱層析實(shí)際上是在擴(kuò)散和分離之間的權(quán)衡。太低的洗脫強(qiáng)度并不好，推薦用梯度洗脫。收集的例子：10mg上樣量，1g硅膠H，0.5ml收一餾分；1-2g上樣量，50g硅膠（200-300目），20-50ml收一餾分。7。檢測。要更多地使用專用噴顯劑，如果僅用紫外燈，會損失較多產(chǎn)品，紫外的靈敏度一般比噴顯劑底1-2個數(shù)量級。8。送譜。收集的產(chǎn)品旋干，在送譜前通常需要重結(jié)晶。如果樣品太少或?yàn)橐后w，可過一小凝膠柱，作為送譜前的最后純化手段?？沙渥V1.5ppm左右所謂的“硅膠”峰。1.先根據(jù)TLC方法篩選好洗脫劑，使兩相鄰物質(zhì)Rf值之差最大化2.將柱子必須裝平整、均

4、勻3.考慮有限柱填料的吸附量4.可考慮用剃度法分開并洗脫關(guān)于柱子的尺寸，應(yīng)該是粗長的最好。柱子長了，相應(yīng)的塔板數(shù)就高。柱子粗了，上樣后樣品的原點(diǎn)就?。ǚ从吃谥由暇褪菢悠穼颖容^?。?，這樣相對的減小了分離的難度。試想如果柱子十厘米，而樣品就有二厘米，那么分離的難度可想而知，恐怕要用很低極性的溶劑慢慢沖了。而如果樣品層只有0.5厘米，那么各組分就比較容易得到完全分離了。當(dāng)然采用粗大的柱子要犧牲比較多的硅膠和溶劑了，不過這些成本相對于產(chǎn)品來說也許就不算什么了（有些不環(huán)保的說，不過溶劑回收重蒸后也就減小了部分浪費(fèi)）?，F(xiàn)在見到的柱子徑高比一般在1：510，書中寫硅膠量是樣品量的3040倍，具體的選擇要具

5、體分析。如果所需組分和雜質(zhì)分的比較開（是指在所需組分rf在0.20.4，雜質(zhì)相差0.1以上），就可以少用硅膠，用小柱子（例如200毫克的樣品，用2cm×20cm的柱子）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我覺得可以增加柱子的直徑，比如用3cm的，也可以減小淋洗劑的極性等等。真空液相層析即vacuum liquid chromatography(VLC),即用真空代替壓力進(jìn)行層析，具體方法可見Synthesis,2001,No,16,2431-,and J chem edu,1997,10,1222-干法上樣，一般用于固體或粘度大的液體樣品。樣品用低沸點(diǎn)易溶溶劑溶解，加入1-3倍的粗硅

6、膠，晾干或旋干，干燥的標(biāo)準(zhǔn)是硅膠成細(xì)粉而不粘在瓶壁上。裝好的柱子上留一段溶劑，把吸附了樣品的硅膠慢慢到進(jìn)去，震動柱子或再加一些溶劑，把粘在柱壁上的硅膠洗下常說的過柱子應(yīng)該叫柱層析分離，也叫柱色譜。我們常用的是以硅膠或氧化鋁作固定相的吸附柱。由于柱分的經(jīng)驗(yàn)成分太多，所以下面我就幾年來過柱的體會寫些心得，希望能有所幫助。柱子可以分為：加壓，常壓，減壓。壓力可以增加淋洗劑的流動速度，減少產(chǎn)品收集的時間，但是會減低柱子的塔板數(shù)。所以其他條件相同的時候，常壓柱是效率最高的，但是時間也最長，比如天然化合物的分離，一個柱子幾個月也是有的。減壓柱能夠減少硅膠的使用量，感覺能夠節(jié)省一半甚至更多，但是由于大量的空

7、氣通過硅膠會使溶劑揮發(fā)（有時在柱子外面有水汽凝結(jié)），以及有些比較易分解的東西可能得不到，而且還必須同時使用水泵抽氣（很大的噪音，而且時間長）。以前曾經(jīng)大量的過減壓柱，對它有比較深厚的感情，但是自從嘗試了加壓后，就幾乎再也沒動過減壓的念頭了。加壓柱是一種比較好的方法，與常壓柱類似，只不過外加壓力使淋洗劑走的快些。壓力的提供可以是壓縮空氣，雙連球或者小氣泵（給魚缸供氣的就行）。特別是在容易分解的樣品的分離中適用。壓力不可過大，不然溶劑走的太快就會減低分離效果。個人覺得加壓柱在普通的有機(jī)化合物的分離中是比較適用的。關(guān)于無水無氧柱，適用于對氧，水敏感，易分解的產(chǎn)品?？梢詽裰部梢愿芍?。不過在樣品之前

8、至少要用溶劑把柱子飽和一次，因?yàn)槿軇┖凸枘z飽和時放出的熱量有可能是產(chǎn)品分解，畢竟要分離的是敏感的東東，小心不為過。也是因?yàn)榉蛛x的東西比較敏感，所以接收瓶一定要用可密封的，遵循schlenk操作。至于是加壓、常壓、減壓，隨需而定。因?yàn)槭莝chlenk操作，所以點(diǎn)板是個問題，如果樣品是顯色的，恭喜了，不用點(diǎn)板，直接看柱子上的色帶就行了。如果樣品無色，只好準(zhǔn)備幾十個schlenk瓶，一瓶一瓶的點(diǎn)，不過幾次之后就知道樣品在哪，也就可以省些了。像我以前過一根無水無氧柱，需要六個schlenk，現(xiàn)在只一個就能把所要的全收集到。無水無氧柱中用的比較多的是用氧化鋁作固定相。因?yàn)楣枘z中有大量的羥基裸露在外，很容

9、易是樣品分解，特別是金屬有機(jī)化合物和含磷化合物。而氧化鋁可以做成堿性、中性和酸性的，選擇余地比較大，但是比硅膠要貴些。聽說有個方法，就是用石英做柱子，然后用GF254做固定相，這樣在柱子外面用紫外燈一照就知道產(chǎn)品在哪里了，沒有驗(yàn)證過?！局黝}】黃酮類化合物的分離體會【實(shí)驗(yàn)過程】我做的是某中藥的化學(xué)成分研究，該中藥中主要為黃酮類成分，遵循傳統(tǒng)用藥原則，我采取水煎煮，之后水提液濃縮至一定體積，過大孔吸附樹脂，乙醇水梯度洗脫，梯度：水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇。每個梯度最為一個流分，再進(jìn)行細(xì)分。下一步主要是運(yùn)用聚酰胺柱色譜，中低壓ODS，Sephadex LH20進(jìn)一步分離，最好

10、制備液相得到單體化合物?！窘?jīng)驗(yàn)分享】主要和大家分享我使用聚酰胺柱的經(jīng)驗(yàn)，我一般是聚酰胺薄膜結(jié)合聚酰胺柱，類似于硅膠板結(jié)合硅膠柱。所用的聚酰胺為30-60目，聚酰胺薄膜一盒50片，規(guī)格為8cm x 8cm，70塊錢左右，可以根據(jù)需要剪成條狀使用。聚酰胺薄膜常用的溶劑系統(tǒng)說明書上有，我常用甲醇-水，因?yàn)辄S酮類化合物有一定的酸性，展開劑要加點(diǎn)酸，甲酸乙酸都可以，抑制其解離，保持游離狀態(tài)的話，樣品成點(diǎn)性好，否則拖尾很嚴(yán)重。在此需要指出的是，聚酰胺可以用反相溶劑系統(tǒng)，如甲醇水；也可以用正相溶劑系統(tǒng)，如二氯甲烷甲醇。要根據(jù)自己樣品的極性來定。以我的80%乙醇洗脫物為例，進(jìn)行詳細(xì)的敘述。此部分極性較小。我用

11、二氯甲烷溶解，拌樣，揮干。洗脫系統(tǒng)為甲醇水，聚酰胺柱起始用水裝柱，上樣，上面要放一塊棉花，然后用玻璃塞子壓?。ň埘０繁容^輕，防止加溶劑時沖起來），甲醇水梯度洗脫。之前點(diǎn)板顯示，50%甲醇水剛剛展開一點(diǎn)，因此起始用50%甲醇水洗脫，然后梯度設(shè)為55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、最后甲醇沖柱。過程中每100mL一接，蒸干轉(zhuǎn)移至小瓶。最后用一大塊聚酰胺對得到的流分進(jìn)行合并。得到大概9-10個流分，HPLC-DAD分析，找到合適的液相色譜條件之后，用制備液相進(jìn)行制備?！倔w會和教訓(xùn)】黃酮類化合物用聚酰胺分離效果非常好，但是死吸附較嚴(yán)重，樣品比較多時可以使用，少就算了。凝膠S

12、ephadex LH20效果也非常好，建議多使用。黃酮類成分溶解性比較折磨人，但提醒一點(diǎn)在進(jìn)行制備液相時，樣品一定要用流動相溶解，或接近流動相，多加點(diǎn)總會溶解的，然后用0.45m濾膜過濾。不用流動相溶解很容易把柱子弄裂分。原因在于，進(jìn)樣之后，樣品析出，堵了柱塞板，導(dǎo)致局部流速過快，沖塌固定相?！局黝}】一種中藥的乙酸乙酯層浸膏的分離心得【實(shí)驗(yàn)過程】課題是某中藥的化學(xué)成分研究，通過立式真空壓力消毒罐用70%乙醇提取三次，回收，萃取，硅膠，凝膠柱，以及高效液相色譜制備的方法得到單體，到打譜的全流程。【經(jīng)驗(yàn)分享】下面我要講我的經(jīng)驗(yàn)了。    課題拿來的時候就知道要分離，對于具體怎么

13、分，分哪層沒有什么具體概念，這里給大家一個提議，如果想讓自己的分離有點(diǎn)價值，建議先把各層（石油醚層，乙酸乙酯層，氯仿層，正丁醇層，水層）先做藥理看看哪層有活性，或者取總皂苷，總黃銅，總生物堿，總多糖等各組分做藥理，看看哪個組分有活性，再具體的進(jìn)行分離，不然分出來的東西，很多也不知道有沒有活性，可能東西也比較少，不夠做藥理的，那樣分離就沒有有目標(biāo)的分離意義大了。1 預(yù)實(shí)驗(yàn)   （1）用少量的藥提取，然后分層萃取，計(jì)算一下各層的出膏率，我分的乙酸乙酯層出高率就特別低，但是以前不懂也就分了，結(jié)果費(fèi)了好多的藥，分得的單體量還特別少，建議可以萃取完事之后進(jìn)進(jìn)液相看看，那層的峰多不多，

14、大不大，心里大概有個數(shù)，如果峰都特別小，那可能分這層就很費(fèi)勁，浸膏當(dāng)然是越多越好分了，這里還要記住一點(diǎn)，就是分離和你以后要做含量測定以及藥理的藥要都是一批藥，我因?yàn)橛昧藘膳幾龇蛛x，結(jié)果在第一批藥里分得的東西，在以后用第二批藥的樣品進(jìn)高效液相的時候找不到那個峰，所以買藥一定要買夠，不然影響你以后做含量測定等一系列的東西。   （2）摸薄層條件，將提取好已經(jīng)萃取的乙酸乙酯層用少量乙酸乙酯溶解，（這里具體用什么試劑溶解你可以自己摸摸，比如丙酮啊，氯仿啊，都行，目的是將浸膏最大程度的溶解，點(diǎn)板看看膏子里的各種成分）。一般乙酸乙酯層用到的展開劑配伍有：石油醚-乙酸乙酯 石油醚-丙酮

15、 氯仿-丙酮 氯仿-甲醇 乙酸乙酯-甲醇 乙酸乙酯-氯仿 一般用3：1大概看看點(diǎn)的分離情況，如果有分開的跡象，就可以用這個展開劑調(diào)整比例，如果拖尾很嚴(yán)重，或者點(diǎn)分開的不是很好，那么建議換一個展開劑試試。摸好條件后，把樣品中的第一個點(diǎn)降低展開劑的極性往下拉，使第一個點(diǎn)的RF=0.2 這個時候展開劑的比例就是初始溶媒了，也就是你以后要上大柱子的洗脫劑的初始比例。2 正式實(shí)驗(yàn)     因?yàn)槭谴罅刻崴?，所以需要濃縮的浸膏液非常多 ，不要閑麻煩一定要用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，我就是直接在火上濃縮的，最后分出來的東西，跟樣品有的對不上，懷疑是不是因?yàn)闇囟冗^高轉(zhuǎn)化了，這個就不能確定啦。 

16、  好的浸膏用水融了之后放入一個貌似廣口瓶的大罐子里 ，倒入跟浸膏液等體積的萃取液進(jìn)行萃取，這里面要說一嘴，在用乙酸乙酯萃取的時候，禁止劇烈震搖，過于劇烈會讓乙酸乙酯層產(chǎn)生非常強(qiáng)烈的乳化層，乳化層就不知道到底是上層的東西還是下層的東西了，輕輕搖的話乳化層會小一點(diǎn)，如果一旦產(chǎn)生乳化層了，可以用熱抹布溫一溫瓶子外面，或者找個盆加熱一下，大概50°左右把這個大罐子放里面，一會乳化層就下降了很多，不能說完全都變沒了，只能說有好轉(zhuǎn)。萃取好的浸膏液，減壓濃縮，備用。    裝柱：這里面大家需要知道幾個比例：      

17、0;           浸膏量和拌樣硅膠量=1：1-1：1.5                   浸膏量和柱層析硅膠比例=1：20-1：30                  柱層析硅膠和洗脫劑的比例=1：3       在進(jìn)行大柱子粗分的時候，

18、柱層析硅膠用100-200目的。拌樣硅膠用200-300目的。以后細(xì)分的時候柱層析硅膠用200-300目的。      好了，現(xiàn)在我們開始裝柱子。用三倍量的洗脫劑將柱層析硅膠攪拌均勻，溶脹半小時左右。      這時侯我們剪棉花，棉花的直徑要略微比柱子的直徑小一點(diǎn)，剪好后用玻璃棒送進(jìn)柱子底部，玻璃棒按住底部的同時，加少量的洗脫劑，排一排底部的氣泡。拍好后，將容賬好的硅膠研玻璃棒倒入柱子里，最好一次倒入，一次倒入不了，也盡快將剩下的倒進(jìn)去，別讓它分層了。裝柱子的同時記錄柱體積，為以后接餾分的時候做準(zhǔn)備。裝好后，沉降一

19、晚。    拌樣：這里要提到的是拌樣最好跟上柱子是同一天，因?yàn)榘铇又螅烷_始有死吸附了 ，所以，越快上樣，越減少硅膠對樣品的死吸附。拌樣前期準(zhǔn)備一個滴管，一個蒸發(fā)皿，稱取跟浸膏重一樣重的硅膠，備用。取三分之一的硅膠放入蒸發(fā)皿中，將浸膏用少量甲醇溶解，然后用滴管吸取溶解的浸膏液，每次加三 四滴左右到裝好硅膠的蒸發(fā)皿中，用藥匙或者研棰研磨，直至浸膏完全融進(jìn)硅膠里面，再繼續(xù)加浸膏甲醇液，每次滴加必須少量，加多了，硅膠對浸膏的吸附效果就不好了，直至將所有浸膏甲醇液都絆到硅膠里，期間如果硅膠吸附不進(jìn)去了，可以再加點(diǎn)硅膠，所用硅膠量越少越好，最大不超過浸膏量的1-1.5倍。拌好后，硅

20、膠的顏色應(yīng)該是均勻的顏色，如果不均勻還得繼續(xù)研磨，直至均勻?yàn)橹?，然后在水浴鍋上揮掉甲醇至無醇味，就可以上樣啦。    上樣：將拌好的樣品用藥勺均勻的撒入柱子里，一手拿藥勺，另一手輕輕的磕拿藥勺的手使樣品墜落，不要用一只手去上樣，這樣你掌握不好你手的力度。盡量是樣品保持在同一水平線上。上好后在樣品上加1cm高的硅膠，防止以后加洗脫劑的時候把樣品表面砸的不平整了。待樣品被洗脫劑沖到柱子的三分之二柱子處時，開始接餾分。一般一個梯度接4-5個柱體積。    樣品濃縮：接下來的餾分用圓底燒瓶濃縮，洗脫劑是可以回收的，配第一個梯度的時候用密度計(jì)測一下密度，之后用回收

21、的溶劑的時候可以用兩者互相勾兌，達(dá)到原來的密度，這里要注意的是，回收的時候不要讓圓底燒瓶里進(jìn)水了，進(jìn)水了回收的就特別慢，對以后配洗脫劑也有影響，極性就改變了。    合瓶：一般合瓶的時候用的用的硅膠板選用GF254的，這樣能看到暗斑，選用的條件都是要比你這個餾分所用的洗脫劑的極性要大。比如這個餾分是石油醚：丙酮8:1下來的，那么點(diǎn)板用的展開劑的比例一般就是石油醚：丙酮：左右，有時候就用氯仿：丙酮10:1左右，反正就是要比洗脫劑的極性大。合瓶的時候展開劑并不是像洗脫劑那樣單一的，可以用很多試劑都試一試，因?yàn)橛泻芏鄸|西相對比較純了，所體現(xiàn)的理化性質(zhì)就不同，用的顯色劑也不同，比如

22、酚酸類，一般展開劑里面要加點(diǎn)甲酸，跑板的效果才好，而且要用三氯化鐵顯色，跑板摸條件是要有恒心和毅力的，大家堅(jiān)持住呀，希望就在前方(*_*) 分離的各種方法的使用1 制備薄層如果你的東西不是特別多的話，就不要用了，因?yàn)橹苽浔雍芾速M(fèi)樣品，制備出來的純度也不一定夠打譜，如果純度不夠還得通過液相制備。制備方法： （1）將硅膠板弄的稠一點(diǎn)。    （2）鋪20cmX20cm的大薄層板，這樣展開效果好，斑點(diǎn)清晰可見。    （3）板跑好后，噴顯色劑的時候，用玻璃板蓋住已經(jīng)跑好的板，留下只有一個點(diǎn)的一條，進(jìn)行噴板，噴好后，通過那個點(diǎn)上面跑出來的顏色，就大概知道刮取的

23、部位在哪了。    （4）將刮取的硅膠，用甲醇超聲，將超聲好的溶液濾過，濾液為所要成分。2 SephadexLH一20一般這個凝膠的洗脫劑用甲醇或者氯仿甲醇1:1到底用哪個可以看看你要上樣的東西的極性，如果你的東西用氯仿：甲醇1:1溶，就用氯仿甲醇上樣，洗脫。上樣的時候，用最少量的洗脫劑把樣品溶了，當(dāng)樣品溶液都下到凝膠里面了，再加洗脫劑，不然就相當(dāng)于把樣品稀釋了一樣。一般上凝膠有的東西色素太嚴(yán)重了，最好別上，上完之后整個凝膠的污染了，有時候再生也不能回到以前的顏色了，如果東西太混的話，建議上樣之前用濾紙過濾一下，不過這樣是會有損失的，所以樣太少了就別濾了。我以前上過一個東西，色素全掛在凝膠上了，用純甲醇沖了次都沖不下來，就只好把凝膠倒出來再生了，不過還好再生之后，凝膠還是很干凈的。這里給大家講一下我的凝膠的再生方法：用0.5mol/L NaOH和0.5mol/L NaCl泡凝膠，一天一宿，在50攝氏度的水浴鍋里面泡，泡好后用水洗至中性，（用pH試