SOCS1沉默的DCCIK細(xì)胞治療晚期惡性腫瘤安全性及近期療效分析

1、s0cs1沉默的dccik細(xì)胞治療晚期惡性腫瘤安全性及近期療效分析(安徽省宿州市立醫(yī)院腫瘤內(nèi)科安徽宿州234000)【摘要】目的：socs1 沉默的 iapa (inhibition of antigen presentationattenuators) dc/cik細(xì)胞治療晚期惡性腫瘤惠者的安全性及近期臨床療效。方 法：觀察27例臨床確診為晚期惡性腫瘤的患者，iapadc/cik治療的不良反應(yīng)、 肝腎功能變化；治療后腫瘤標(biāo)記物、免疫指標(biāo)和卡氏(kps)評(píng)分的變化。結(jié)果： socs1沉默的iapadc/cik細(xì)胞治療不良反應(yīng)發(fā)生率低，安全可靠；治療后，腫 瘤標(biāo)記物有降低，cd3+、cd4+、c

2、d8+的指標(biāo)都有顯著提高p<0.05), kps評(píng)分 不同程度的提高。結(jié)論：socs1沉默的iapadc/cik細(xì)胞治療晚期惡性腫瘤患者 安全性好，近期臨床療效好，改善患者的生活質(zhì)量?！娟P(guān)鍵字】dc/cik; socs1沉默;晚期惡性腫瘤；療效；安全性【中圖分類號(hào)】r733【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】b 【文章編號(hào)】1004-6194 (2015)02-0434-02【abstract】 obiecdve: to inwestigate the safety and clinical effects of socs1 silenced iapa( inhibition of antigen p

3、resentation attenuators )dc/cik on patients with advanced cancer.methods:twenty-seven patients with advanced cancer were treated with iapa dc/cik therapy .t lymphocyte subtypes and intra-cellular cytokines in peripheral blood of the patients were analyzed.performance status (kps) and clinicaleffects

4、 were observed.the safety were also observed.results:the ratios of cd3+,cd4+ and cd4/cd8 increased after treatment,which showed significantstatistical difference(<0.05).the effective rate of kps was 96.296%. conclusion: iapa dc/cik cell-therapy can improe functions and elevate life quality of

5、 the patients. iapa dc/cik celltherapy is likely to be an effective adoptive immunotherapy for advanced cancer.【key words】 dc/cik; socs1 silenced ； advanced cancer； clinicl effects； the safty腫瘤是嚴(yán)重危害人民生活和健康的重人疾病之一。腫瘤的生物治療己成 為繼手術(shù)、放療、化療后的第四種腫瘤治療模式。在腫瘤的生物治療中，以樹突 狀細(xì)胞（dendritic cell，dc）遞呈腫瘤抗原誘導(dǎo)機(jī)體特異性抗腫瘤免疫，

6、結(jié)合腫 瘤抗原特異性ctl治療的腫瘤生物治療模式己成為0前臨床試驗(yàn)研究的方向。 socs1沉默的dc/cik細(xì)胞技術(shù)：是一種新型免疫細(xì)胞治療技術(shù)，技術(shù)的核心系采 用小干擾核糖核酸（sirna）特異性阻斷抗原呈遞細(xì)胞（dc細(xì)胞）和淋巴細(xì)胞中 關(guān)鍵的負(fù)調(diào)節(jié)因子，使其基因表達(dá)沉默，誘導(dǎo)機(jī)體突破自身對(duì)腫瘤的免疫耐受。 我們主要觀察患者socs1沉默的dc/cik細(xì)胞治療的近期臨床療效及臨床安全性 分析。1材料及方法1.1材料收集收集我院從2013年5月至2014年9月間采用s0cs1沉默的dc/cik細(xì) 胞治療惡性腫瘤病人，共27例，女10例，男17例，年齡38-70歲；其中肺癌 5例，食管癌2例，胃

7、癌1例，結(jié)直腸癌3例，腎癌1例，乳腺癌1例，卵巢癌 2例，前列腺癌2例，軟組織肉瘤3例，宮頸癌1例，肝癌2例，鼻咽癌1例， 腦瘤2例，子宮內(nèi)膜癌1例，胃套細(xì)胞淋巴瘤1例。27例患者均接受過(guò)放化療。 患者入選標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均經(jīng)過(guò)病理學(xué)確診，kps評(píng)分>60分，預(yù)計(jì)生存期超 過(guò)3個(gè)月，外周血白細(xì)胞數(shù)3×109 / l, mcv必須大于30%、肝腎功 能、血凝大致正常，無(wú)心、肺、腎、腦功能障礙，入選患者完成至少兩次以上的 s0cs1沉默的dc/cik免疫細(xì)胞治療。治療期間未接受放化療。1.2具體方法1.2.1外周單個(gè)核細(xì)胞的采集治療前簽署知情同意書，常規(guī)檢查血常規(guī)、

8、肝腎功能、免疫四項(xiàng)、血凝 四項(xiàng)、腫瘤標(biāo)志物、流式細(xì)胞儀測(cè)淋巴細(xì)胞亞群、心電圖；采血前6小吋患者不 可食用過(guò)度油膩食物；用血細(xì)胞分離機(jī)循環(huán)采血，采血循環(huán)總量為3000毫升-5000毫升，收 集外周血中單核細(xì)胞80-100ml,淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法進(jìn)一步純化申 個(gè)核細(xì)胞(pbmc),獲得純度在90%以上的pbmc,種子細(xì)胞獲取量為1x109-2x109； 1.2.2在gmp細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行單核細(xì)胞的培養(yǎng)、擴(kuò)增。獲取的pbmc在37°c，5%co2貼培養(yǎng)箱中孵育。收集貼壁細(xì)胞即dc 細(xì)胞，在第0天用含il-4、tnf等細(xì)胞因子的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，隔天需半量換液，培養(yǎng)至第6天加入tnf

9、-a，iapa因子細(xì)胞(iapa因子由北京英默生物科技有限公 司提供)，第七天dc細(xì)胞成熟，蘇數(shù)量可以達(dá)到1-2x108。收集懸浮細(xì)胞即cik細(xì)胞，第0天加入含ifn-γ、抗cd3單抗等 無(wú)血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基。24h后加入含il-1、il-2等無(wú)血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基。每23d更 換培養(yǎng)基一次，補(bǔ)加il-2。培養(yǎng)至第14天成熟。細(xì)胞數(shù)量可以達(dá)到5-6x109;乙型肝炎、丙型肝炎病毒感染者細(xì)胞培養(yǎng)在負(fù)壓實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。1.2.3質(zhì)檢臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面cd3、cd8、cd56 等分子的表達(dá);在電子顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞數(shù)0人工計(jì)數(shù)；取少量培養(yǎng)物檢測(cè)細(xì)菌、 真菌、衣原體、病

10、毒等。單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞擴(kuò)增后，要求淋巴細(xì)胞比例90%以上，每次冋輸細(xì)胞數(shù)為1.5×109,細(xì)胞活率≥95%, cd3+cd56+≥20%, cd3+cd8+≥50%,不含細(xì)菌、真菌、支原體和內(nèi)毒素；1.2.4細(xì)胞冋輸?shù)谄咛旌偷诎颂?，成熟的dc細(xì)胞半量分別加入100ml生理鹽水靜脈回 輸；第十四、十五天，冋輸培養(yǎng)成熟的cik細(xì)胞半量加入100ml生理鹽水中靜脈 冋輸；冋輸結(jié)束后第二天流式細(xì)胞儀測(cè)患者淋巴細(xì)胞亞群，腫瘤標(biāo)志物在下一 療程治療前復(fù)査。冋輸中、后盡量避免應(yīng)用地塞米松等免疫抑制劑。治療吋機(jī)選 擇：一般放療結(jié)束后5天，化療結(jié)束

11、后7天。兩次生物治療之間應(yīng)該間隔2個(gè)月。 1.3評(píng)價(jià)方法冋輸吋及冋輸結(jié)束后對(duì)其安全性進(jìn)行評(píng)定.安全性評(píng)價(jià)包括不良反應(yīng)觀察、血常規(guī)、肝腎功能相關(guān)指標(biāo)的改變；治療兩個(gè)療程后對(duì)近期療效的評(píng)定包括 生活質(zhì)量、病灶緩解情況、腫瘤標(biāo)志物變化、免疫系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)的改變。統(tǒng)計(jì)學(xué) 方法采用spss 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，p<0.05為差異冇統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1安全性評(píng)價(jià)(1) 不良反應(yīng)觀察靜脈冋輸過(guò)程中及冋輸后24 h內(nèi)患者是否出現(xiàn)發(fā) 熱、皮疹、嘔吐、腹痛、呼吸閑難、胸悶等不良反應(yīng)。至今已完成治療27例患者中，有不良反應(yīng)者3例(11.11%, 3/27):均 表現(xiàn)為發(fā)熱，最高達(dá)39.6°c

12、,經(jīng)對(duì)癥處理即可緩解，發(fā)熱吋間一般冋輸?shù)漠?dāng)天和 第二天，并且初次治療出現(xiàn)發(fā)熱的患者，在后面每次治療中均有發(fā)熱出現(xiàn)。無(wú)腹 痛、嘔吐、皮疹、呼吸閑難、胸悶等不良反應(yīng)。(2) 血常規(guī)、肝腎功能相關(guān)指標(biāo)改變治療前后患者血常規(guī)(白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、血小板)，及肝腎功能(glu/alt/ast / alb / tbil / dbil / cr / bun)檢測(cè)均無(wú)明顯改變。2.2近期療效評(píng)定(1) 生活質(zhì)量：米用kps評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，提高20分以上為顯效；提高10 一 20分為有效;提高10分以下至下降10分以內(nèi)為穩(wěn)定;下降10分以上為惡化。27例患者在兩療程治療結(jié)束后顯效7例，有效12例，穩(wěn)定7例，

13、惡化 1 例?？傆行?96.296% (26/27).(2) 療效評(píng)價(jià)：可測(cè)量病灶客觀緩解率(or)。用ct或彩超測(cè)量病灶 大小(雙徑測(cè)量)，按who規(guī)定的評(píng)定腫瘤近期療效標(biāo)準(zhǔn)，即每2個(gè)療程后作 評(píng)價(jià)，分為病灶完全緩解(cr)，病灶部分緩解(pr)，病灶穩(wěn)定(sd),病灶進(jìn)展(pd)27 例患者中 cr 0 例，pr10 例，sd 15 例，pd 2 例，or 92.592%(25/27)。(3) 治療前后腫瘤標(biāo)記物的檢測(cè)檢測(cè)患者的s0cs1沉默的dc/cik細(xì)胞治療前后的腫瘤標(biāo)記物(cea、 cai25、scc、afp、ca199)的改變情況:27例中12例下降;14例無(wú)變化;0例升高。(

14、4) 細(xì)胞治療前后免疫系統(tǒng)的影響27例患者細(xì)胞冋輸后均表現(xiàn)精神狀態(tài)良好，治療前后前后患者免疫系 統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)如表1所不，治療前后患者的外周血中cd3+、cd4+細(xì)胞均存明顯的 上升(p&lt;o. 05)(5) 腫瘤進(jìn)展和生存觀察27例患者socs1沉默的dc/cik細(xì)胞治療2-7療程結(jié)束以后，隨訪結(jié)果 5例死亡，9例病情穩(wěn)定，13例患者奮不同程度的病情進(jìn)展。3討論原發(fā)性肝癌具有起病隱匿、病程短、進(jìn)展快、惡性程度高、生存期短等 特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)吋多屬晚期，故臨床治療難度大，患者生活質(zhì)量差，病死率高，嚴(yán)重 危害著人類的生命和健康。原發(fā)性肝癌的治療在于早發(fā)現(xiàn)、早治療，以往外科切 除手術(shù)一直是原發(fā)性

15、肝癌的主要治療手段1】。但原發(fā)性肝癌是在肝炎和肝硬化 的基礎(chǔ)上發(fā)生，越來(lái)越多證據(jù)顯示其多為多中心性發(fā)生。手術(shù)切除(特別是腫瘤 位于接近第一肝門部位吋)直接影響肝臟儲(chǔ)備功能；手術(shù)中擠壓可能導(dǎo)致腫瘤細(xì) 胞的轉(zhuǎn)移；手術(shù)后患者全身的免疫機(jī)能受到抑制；多中心起源的病例治療難度大， 無(wú)法徹底清除肝內(nèi)所有病變(包括亞影像學(xué)微小多發(fā)病變)。以上諸多因素存在導(dǎo) 致單純外科手術(shù)切除肝癌模式難以進(jìn)一步提高原發(fā)性肝癌患者的生存率2】?；?于肝癌的局部治療上經(jīng)驗(yàn)的逐步總結(jié)和積累以及療效的提高，肝癌的治療模式從 原先單一的外科手術(shù)治療逐漸演變到0前的多學(xué)科綜合治療。目前認(rèn)為,肝癌的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體的免疫功能狀態(tài)密切相關(guān)3

16、,肝癌患 者免疫功能低下是肝癌容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要原因之一。因此，如何將現(xiàn)有治療 原發(fā)性肝癌的主要手段手術(shù)及介入微創(chuàng)治療與腫瘤的細(xì)胞免疫治療有機(jī)的結(jié)合 起來(lái)是0前探討的熱點(diǎn)o近年來(lái)的臨床試驗(yàn)研究表明過(guò)繼細(xì)胞免疫治療對(duì)抑制 原發(fā)性肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移具有重要作用4.本實(shí)驗(yàn)研究中的socs1沉默的iapa細(xì)胞的核心系采用小干擾核糖核酸 (small interfering ribonucleic acid, sirna)特異性阻斷抗原呈遞細(xì)胞(如 dc)和淋巴細(xì)胞中關(guān)鍵的負(fù)調(diào)節(jié)因子（如s0cs1基因），使其基因表達(dá)沉默，誘導(dǎo)機(jī)體 突破自身對(duì)腫瘤的免疫耐受，進(jìn)而提高腫瘤免疫治療的臨床療效。其主要特點(diǎn)在

17、以下3方面：（1）通過(guò)抑制s0cs1的表達(dá)，可有效突破自體免疫耐受，增強(qiáng)療 效；（2） iapa技術(shù)選擇廣譜腫瘤抗原survivin和muc1負(fù)載dc，可增強(qiáng)dc對(duì)特 異性抗原的呈遞能力；（3） iapa技術(shù)可有效促進(jìn)腫瘤抗原特異性細(xì)胞毒性t細(xì)胞 ctl的增殖與活化，同吋抑制負(fù)調(diào)節(jié)treg細(xì)胞表達(dá)。本研究結(jié)果顯示中，iapa dc/cik細(xì)胞冋輸后患者外周血t淋巴細(xì)胞亞群中cd3+, cd4+效應(yīng)細(xì)胞的比例和 cim+/cd84比值顯著上升，cd8+t效應(yīng)細(xì)胞比例下降，反映了機(jī)體免疫功能得 到不同程度的改善，增強(qiáng)了清除腫瘤細(xì)胞的能力，使腫瘤細(xì)胞對(duì)機(jī)體的免疫抑制 減弱；肝癌患者冋輸iapadc/

18、cik細(xì)胞后，體內(nèi)nk細(xì)胞數(shù)量明顯提高，對(duì)清除殘 存腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤的復(fù)發(fā)具有重要作用。本研究中細(xì)胞的制備執(zhí)行了嚴(yán)格的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，使用的試劑符合sda的 安全標(biāo)準(zhǔn)，操作均在符合gmp要求的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，并多次進(jìn)行多次的細(xì)菌、 真菌、支原體和內(nèi)毒素檢測(cè)，結(jié)果均為陰性，才進(jìn)行冋輸，確保治療的安全性; 采用自體iapadc/cik細(xì)胞，避免使用異體細(xì)胞可能帶來(lái)的免疫排斥反應(yīng)；在治 療過(guò)程中，除發(fā)熱外無(wú)其他明顯不良反應(yīng)，0前認(rèn)為生物治療中患者中度發(fā)熱 是機(jī)體免疫功能正常反應(yīng)的結(jié)果，該反應(yīng)對(duì)治療有益5】。絕大多數(shù)無(wú)其他嚴(yán)重 不良反應(yīng)，有較好的耐受性。以上充分說(shuō)明了 iapadc/cik細(xì)胞治療的安全性。 在生活質(zhì)量上，通過(guò)kps評(píng)分對(duì)患者進(jìn)行體能狀態(tài)評(píng)估發(fā)現(xiàn)，治療后kps評(píng)分 總有效率96.296%;此外，大多數(shù)忠者乏力、食欲小振及精神狀態(tài)差等臨床癥狀 冇明顯改善。從s0cs1沉默的dc/cik細(xì)胞