DNA提取方法總結(jié)

1、對(duì)一些dna提取方法的總結(jié)細(xì)菌dna的提?。?-)試劑：1. 抽提緩沖液2% ctab (w/v)2% pvp k25 (w/v)(去色素)loomm tris-hci (ph8.0)25mm edta (ph8.0)2.0m naci2.10m lici3. 2m lici4. depc-water (抑制 rna 酶活性)5. 3m naac (ph5.2)6. 96%乙醇7. 70%乙醇步驟：1. 抽提緩沖液65°c預(yù)熱；2. 加菌體到己經(jīng)預(yù)熱的緩沖液(700ul)中混勻,659, lomin：3. 加酚/氯仿/異戊醇(25： 24： 1),振蕩，離心12,000rpm. lo

2、min；4取上清，加氯仿/異戊醇(24： 1)振蕩，離心12z000rpm, lomin；5. 取上清，重復(fù)4步驟；6. 加入1/10體積的3m醋酸鈉和1.5倍體積的乙醇(或加入等體積的界丙醇)，-20c沉淀；11. 離心 12,000rpm. lomin；12. 棄上淸，70%乙醇洗，也可以再用100%乙醇洗，然后溶解t 100ml水中。(二)(我們常用的方法，但是有時(shí)有些細(xì)菌特別不好提，就用上面的方法)1. 將菌株接種于液體lb培養(yǎng)基，37°c震蕩培養(yǎng)過夜。2. 取 1.5ml 培養(yǎng)物 12000rpm 離心 2min°3沉淀物加入567 ul的te緩沖液，反復(fù)吹打使之

3、重新懸浮,加入30ul 10%sds和15ul的蛋白酶k,混 勻，于37°c溫育lh4. 加入1 ooul 5mol/l naci,充分混勻，再加入80ul ctab/naci溶液,混勻后再65°c溫育lomin。5. 加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混勻，離心4-5min,將上清轉(zhuǎn)入一只新管中，加入0.6-0.8倍體積的異丙 醇，輕輕混介直到dna沉淀下來，沉淀可稍加離心。6. 沉淀用lml的70%乙醉洗滌后，離心棄乙醉.真菌dna的提?。?一)1. 取真菌菌絲0.5g,在液氮中迅速研弊成粉2. 加入4ml提取液，快速振蕩混勻3. 加入等體積的4ml的氯仿:異戊醉(24:1)

4、,渦旋35min (此處是粗提沒冇加酚，可以節(jié)約成本的喲！)4.1000rpm, 4°c, 5min5. 上清用體積的氯仿:異戊醇(24:1)再抽提-次(10,000 rpm, 4°c離心5 min)6. 取上清，加入2/3倍體積的2(tc預(yù)冷異丙醇或2.5倍體積的無水乙醇沉淀，混勻，靜置約30 min ulte>|«r7.用毛細(xì)玻棒挑出絮狀沉淀，用75%乙醇反復(fù)漂洗數(shù)次，再用無水乙醇漂洗1次，吹干,重懸于5008加入 1 ul rnasea (10 mg/ml), 37°c處理 lhr9用酚(ph8.0):氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異

5、戊醇(24:1)各抽提1次(10,000 rpm, 4°c離心5 min) 10取上清,1/10v 3m naacz2.5v體積的無水乙醇廠70t沉淀30 min以上11沉淀用75%乙醇漂洗，風(fēng)干，溶于200 uite中，-20 °c保存?zhèn)溆胐na提取液:0.2mtris-hci (ph 7.5), 0.5m nacl 0.01m edta, 1%sds,3m naac(二)1. 真菌菌絲0.5l gz在液氮屮迅速研m成粉2. 加入3 ml 65°c預(yù)熱的dna提収緩沖液，快速振蕩混勻65°c水浴30 min,期間混勻2-3次3. 加入 1 ml5mka

6、c，冰浴 20 min4. 等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000 rpm, 4°c離心5 min)5. 取上清，加入2/3倍體積的20°c預(yù)冷異丙醇，混勻，靜置約30 minlp6.用毛細(xì)玻棒挑出絮狀沉淀，用75%乙醇反復(fù)漂洗數(shù)次，再用無水乙醇漂洗1次，吹干，雨懸于500 te 中7. 加入 luirnasea (10 mg/ml), 37°c處理 1 hr8. 用酚(ph8.0):氯仿:界戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次(10,000 rpm, 4°c離心5 min)9. 取上清,1/10v 3m naac,

7、2.5v體積的無水乙醇z -70ec沉淀30 min以上10. 沉淀用75%乙醇漂洗，風(fēng)干,溶于200 ul te中，20 °c保存?zhèn)溆?。以上是我們常用的方?抗凝血dna的提取方法1.分離外丿對(duì)血白細(xì)胞(1)取患者肘靜脈血5ml, edta抗凝，2500rpm離心10 min。(2)小心吸取上層血 漿,分裝到3個(gè)0.5ml離心管中。(3)在血細(xì)胞中加入3倍體積的溶血液，搖勻,冰浴15 min。(4)2500rpm 離心10 min,棄上清。(5)加入10ml溶血液，搖勻，冰浴15 min。bfr3000rpm離心10 min,棄上清。(7)倒置離心管，去掉殘液。 j得口細(xì)胞，一80

8、oc凍存。2.從口細(xì)胞中提取基因組dna (1)取口細(xì)胞， 加4.5ml se,使勁吹打，混勻。(2)沿管壁加入0.5ml的10%sds。加蛋白酶e 50pl /管。(4)首尾 輕搖10 min,混勻。(5)37oc水浴過夜。眇第二夭取出，沿管壁加3 ml飽和nacl,迅速手搖15秒, 使蛋口變性析出。(7)4000rpm離心10 min. 取出上淸，放于另一管中，加入等體積的三氯甲烷，混 勻15 min。(9)2500rpm離心10 min。(10)取出上清，加入等體積的三氯甲烷，混勻10 min。(u)2500rpm 離心10 min. (12)取上清，轉(zhuǎn)入50ml管中，加3倍體積無水乙醇

9、。(13)首尾輕搖，見dna絮狀沉淀析 出。(14)將dna挑至管壁，75%乙醇洗滌2遍。(15)將dna挑至0.5ml管中，凍干。(16)加te300pl, 使dna溶解，4。(2保存。特殊組織dna的提取及鑒足1、提収dna的簡(jiǎn)易方法：1)、從全血中提取dna：取20$抗凝血于0.5ml無菌管中，加500|j|左右的ddh20 混勻后,12000rpm離心2分鐘,棄上清,(若沉淀中仍 有紅細(xì)胞,需重復(fù)此操作12次)加入樣品提取液 20jji,混勻z100°c煮10分鐘(可在擴(kuò)増儀上進(jìn)行)后12000rpm離心5分鐘，取上淸2pl進(jìn)行擴(kuò)增。2)、從其 它冇核細(xì)胞中提取dna：可育接

10、加適量的樣品提取液到裝冇發(fā)根、頭眉、骨髓、精子、紐織碎片等冇核細(xì) 胞的管中,100"c煮10分鐘(可在擴(kuò)增儀上進(jìn)行)后12000rpm離心5分鐘，取上淸進(jìn)行擴(kuò)增。2、從全血 中用有機(jī)溶劑提取dna： 1)試劑a10%sdsb20m醋酸鈉c.20mg/ml蛋白酶kd苯酚:氯仿:異戊醇 (25:24:1) e.分析純乙醇f.te(10mm triszl-ommedta溶液zph7.5)2)步驟a、血液樣本收集于含edta的 抽血用管子屮，樣品用手倒轉(zhuǎn)試筲混合后等分。每份700pl全血可放在1.5ml的教料離心管屮，-70°c儲(chǔ)存。 b、在解凍的(或液體的)血液中加入800$的t

11、e并混勻，12000rpm離心2分鐘。c、吸取10ml上清 液并棄去。d、加入l.omite,振蕩后離心2分鐘，去除盡可能多的上淸液，但不要影響沉淀。e、向沉淀中 加入：375pl 2m醋酸鈉;25pl 10%sds;5pl蛋白酶k溶液。略加振蕩,于56°c保溫一小時(shí)。f、加入120訓(xùn) 苯酚/氯仿/異戊醇，振蕩30秒。g、12000rpm離心5分鐘。h、小心移出水相（上層）到一新的1.5ml 的離心管屮。i、向水相中加入2.5倍體積預(yù)冷的分析純乙醉，倒轉(zhuǎn)試管加以混合，將試管于-20°c f放置 10分鐘以上。j、12000rpm離心10分鐘。k、傾去酒精，用移液器小心吸去剩

12、余酒精，不要觸動(dòng)沉淀。l、加180pl te后振蕩。加20pl2m醋酸鹽,手工混勻。m、加500預(yù)冷分析純酒精，用手輕輕混勻, 12000rpm離心10分鐘，傾去上清液。n、用室溫下的70%酒粘lml洗滌dna沉淀,12000rpm離心5分 鐘，傾去上清液。0、用移液器吸去殘余的酒精，管子置于真空離心抽除殘余的酒椿（大約10分鐘）?；?將管子放在100°c以下烘干。p、加200pl te于dna沉淀屮，混勻后于4°c保溫過夜（或56°c溶解dna2 小時(shí)以上），次日清晨振蕩10秒。3、從斑痕材料中用有機(jī)溶劑提取dna 1）試劑a.斑痕抽提緩沖液（1.21g tri

13、s,5.84gnaci,6.02g 二硫蘇糖醇，2%sdszlommedta/j|-zph8.0） b其它試劑見 2.1）2）步驟 a、將斑痕 剪成碎片后置于1.5ml的塑料離心管中。b、加400斑痕抽捉緩沖液及10pl蛋口腮k溶液，混勻，離心 數(shù)秒使碎片浸入液體。c、于56°c保溫過夜。d、用一新的滅菌牙簽將碎片中的液體擰干后從管中取出。 e、加500pl苯酚/氯仿/異戊略 手搖混勻，12000rpm離心3鐘。f、將上淸液轉(zhuǎn)移到新的離心管。g、 上淸液中加入2.5倍體積預(yù)冷的分析純酒精。h、手搖混勻試管中的各利減分，放置20°c10分鐘以上。i、 12000rpm離心10

14、分鐘。j、傾去酒粋。k. jij 1ml室溫的70%酒粘洗滌。l、12000rpm離心5分鐘。m、傾去酒精，用移液器吸去殘余酒精。n、真空離心10分鐘除去殘余酒將，或在100°c以下烘干.0、 56°c下用36plte溶解dna,時(shí)間至少2小時(shí)。4、從精斑中分離提取dna 1）試劑a.tne緩沖液（1.21g tris,5.84gnaci,0.37gedta/升）b.20%sarcosyl c.0.39m -硫蘇糖醇 d其它試劑見 2.1）2）步驟 a、從棉簽 上取卜-有檢材的棉花并置于1.5ml塑料離心管中。b、管中加入400|jl tne緩沖液；25pl 20%sarc

15、osyl;75|jl 水；5pl蛋口酶k溶液。手搖混勻，37保溫2小時(shí)。c、用一新的滅菌牙簽將棉花擰干后從管中取出，再 用12000rpm離心5分鐘。d、移上清液（內(nèi)含裂解細(xì)胞或' 1雌性“片段）于一新的1.5ml管，不要振蕩沉 淀物（內(nèi)含非裂解細(xì)胞或梢子）。再用tne洗脫沉淀物四次。e、在冇沉淀的管中加入 10|jltne;50ml20%sacrosyl;40mldtt;150ml 水；10pl 蛋白酶 k 溶液。手搖混勻,37c保溫 2 小時(shí)。f、按 3, 2） e0的方法分別抽提出兩管中的雌性dna和精子dna。5、用chelex從全血/血斑中抽提dna 1）試 劑a.te b.

16、 5%chelex 100（w/v t無菌水中）2）步驟a、3pl全血或3mmx3mm的血斑置于滅菌的1.5ml 離心管中，加入滅菌的1 mite于管中，振蕩數(shù)秒。b、置于室溫30分鐘，振蕩數(shù)秒。c、用12000rpm 離心3分鐘。d、棄上淸液，保留足夠上淸液蓋沒沉淀，勿攪起沉淀。e、加入200|jl 5%chelex,振蕩 數(shù)秒。f、于56°c保溫30分鐘。g、振蕩數(shù)秒。h、沸水浴8分鐘。i、振蕩數(shù)秒。j、用12000rpm 離心5分鐘，上淸中為提取的dna。6、用chelex從精斑中抽提dna 1）試劑a.te b.lomg/ml蛋白酚k c.20% chelexloo （w/v

17、 于無菌水中）d洗脫緩沖液（10mm trisz10mm edta/50mmnaci/2%sds,ph7.5） e.lmr.硫蘇糖醇2）步驟a、將附冇檢材的棉簽或纖維置于1.5ml滅菌離心管中，加lml滅菌的te,振 蕩數(shù)秒。b、室溫30分鐘。c、振蕩數(shù)秒。d、用一新的滅菌牙簽將殘片擰干后從管中取出。e.mj 12000rpm 離心3分鐘。f、棄去上淸液，但保留約50pl上清液，勿使“細(xì)胞沉淀”攪起（若沉淀體積較人，應(yīng)保留更 多上淸液，在此例中，保即的上清液體積應(yīng)為沉淀的2倍）。g、加150訓(xùn)滅菌的蒸懈去離子水和2pl蛋白 酶k溶液。h、56°c保溫1小時(shí)以裂解非粘子細(xì)胞。i、jij

18、 12000rpm離心5分鐘，沉淀為“粘子沉淀”。j、 取150訓(xùn)上清液（含裂解細(xì)胞組分）及到一新的l5ml離心管中,再加50|jl20%chelex,振蕩數(shù)秒后,稍 加離心，然后接步驟os進(jìn)行操作。k、用0.5ml洗脫緩沖液重新懸浮原管中的沉淀，略加振蕩，用 12000rpm離心5分鐘，棄去約450$上清液。l、重復(fù)步驟k再洗四次。m、用lml火菌的蒸飾去離子 水重新懸浮沉淀,稍經(jīng)振蕩,用12000rpm離 心5分鐘，棄去950$上清液。n、加150pl的5%chelex, 2pl蛋口酶k溶液，7|jllm的二硫蘇糖醇于“粘子組分”，振蕩數(shù)后，稍加離心。0、56°c保溫1小時(shí)。p、

19、 振蕩各管數(shù)秒。q、樣品于沸水浴8分鐘。r、振蕩數(shù)秒。s、用12000rpm離心3分鐘，兩管的上清中 分別含冇非精子細(xì)胞dna和椿子細(xì)胞dna°|h|、pcr擴(kuò)増：収一支離心管，加（反應(yīng)管數(shù)+l ）x（2|jl 10x 引物混合物+2pll0x反應(yīng)混合物+0.4pl hs-7aq （用前必須用手彈勻），混勻后，每個(gè)反應(yīng)管分裝4.4pl,然 后，加提取的dna2pl,再加13.6pl ddh20和-滴石蠟汕，（若模板dna濃度太低，可適當(dāng)增加其體積，但同時(shí) 要減少ddh20體積,以保持總反應(yīng)體積為20|jl）稍離心后按下列條件進(jìn)行擴(kuò)增：95°c預(yù)變性5分鐘，然后 94

20、6;c變性30秒；6356°c退火30秒（每循環(huán)一次降低一度）；72c延伸1分鐘，共循環(huán)30次。戢后72°c 保溫10分鐘?；蚪Mdna的提取基因組dna的提取概述 基因組dna的提取通常用于構(gòu)建基因組文庫、southern雜交（包插rflp） 及pcr分離基因等。利用基因組dna較長(zhǎng)的特性,可以將其與細(xì)胞器或質(zhì)粒等小分子dna分離。加入一定 量的異丙醇或乙醇，基因組的人分子dna即沉淀形成纖維狀絮團(tuán)飄浮其屮，可用玻棒將貫取出，而小分子 dna則只形成顆粒狀沉淀附于壁上及底部，從而達(dá)到提取的目的。在提取過程屮，染色體會(huì)發(fā)生機(jī)械斷裂, 產(chǎn)生人小不同的片段，因此分離棊因紐.dn

21、a時(shí)應(yīng)盡量在溫和的條件卜-操作,如盡量減少酚/氯仿抽提、混勻過 程耍輕緩，以保證得到較長(zhǎng)的dna。一般來說，構(gòu)建叢因組文庫，初始dna長(zhǎng)度必須在lookb以上,否則酶 切后兩邊都帶合適末端的冇效片段很少。而進(jìn)行rflp和pcr分析，dna長(zhǎng)度可短至50kb,在該長(zhǎng)度以上, 可保證酶切后產(chǎn)生rflp片段（20kb以下），并可保證包含pcr所擴(kuò)增的片段（一般2kb以下）。不同空物（植物、動(dòng)物、微生物）的基因組dna的提取方法冇所不同；不同種類或同一種類的不同組織因其細(xì)胞結(jié) 構(gòu)及所含的成分不同，分離方法也有差異。在提取某種特殊組織的dna時(shí)必須參照文獻(xiàn)和經(jīng)驗(yàn)建立相應(yīng)的 提取方法，以獲得可川的dna大

22、分子。尤其是組織中的多糖和酶類物質(zhì)對(duì)隨后的酶切、pcr反應(yīng)等有較強(qiáng) 的抑制作用，因此用富含這類物質(zhì)的材料握収基因組dna時(shí)，應(yīng)考慮除去多糖和酚類物質(zhì)。木實(shí)驗(yàn)以水稻幼苗（禾木科）、李（蘋果）葉子、動(dòng)物肌肉組織和人腸桿菌培養(yǎng)物為材料，學(xué)習(xí)基因組dna提収的 般方法。 第二節(jié)從植物組織提収基因組dna 一、材料 水稻幼苗或其它禾本科植物，李（蘋果）幼嫩葉 子。 二、設(shè)備移液器，冷凍髙速離心機(jī)，臺(tái)式髙速離心機(jī)，水浴鍋，陶瓷研缽，50ml離心管（有蓋）及5口1和1.5ml離心管，彎成鉤狀的小玻棒。三、試劑1、提取緩沖液i： loommol兒tris。,ph8.0z 20mmol/l edta, 500m

23、mol/l naci, 1.5% sds。 2、提取緩沖液 ii: 18.6g 葡萄糖,6.9g 二乙 基二硫代碳酸鈉,6.0gpvp,240ul毓基乙醇，加水至300ml。3,80:4:16/氯仿:戊醇:乙醉4、rnasea母液：配方見第一章。5、其它試劑：液氮、異丙醉、te緩沖液，無水乙醇、70%乙醉、3mol/l naace四、操作步驟： （一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因組dna提取 1.在50ml離心管中加入20ml 提取緩沖液1, 60°c水浴預(yù)熱。 2.水稻幼苗或葉子5-10gz剪碎，在研缽中加液氮磨成粉狀后立即倒 入預(yù)熱的離心管中，劇烈搖動(dòng)混勻，60°c水浴

24、保溫30-60分鐘（時(shí)間長(zhǎng),dna產(chǎn)最高），不時(shí)搖動(dòng)。3.加入20ml氯仿/戊醉/乙醉溶液，顛倒混勻（需帶手套，防止損傷皮膚），室溫下靜置5-10分鐘，使水相和冇機(jī) 相分層（必要時(shí)可重新混勻）。4.室溫下5000rpm離心5分鐘。 5.仔細(xì)移取上清液至另一 50ml離心管，加入1倍體積異內(nèi)醇，混勻，室溫下放置片刻即出現(xiàn)絮狀dna沉淀。6.在1.5ml eppendorf中加入1ml teo用鉤狀玻璃棒撈出dna絮團(tuán)，在干凈吸水紙上吸干,轉(zhuǎn)入含te的離心管中qna很快溶解于 teo 7.如dna不形成絮狀沉淀，則可用5000rpm離心5分鐘，再將沉淀移入te管屮。這樣收集的沉 淀,往往難溶解于t

25、e,町在60°c水浴放置15分鐘以上，以幫助溶解。 8.將dna溶液3000rpm離心5 分鐘，上清液倒入干凈的5ml離心管。9.加入5pl rnasea（10pg/|jl）z 37°c 10分鐘，除去rna（rna對(duì)dna的操作、分析一般無影響，可省略該步驟）。10.加入1/10體積的3mol/l naac及2x體積的冰乙醇，混勻廣20°c放置20分鐘左右,dna形成絮狀沉淀。11用玻棒撈岀dna沉淀,70%乙醇漂洗,再在干凈吸水紙上吸干。12.將dna匝溶解于1ml te, -20貯存。13.取2pl dna樣品在0.7%agarose膠上電泳，檢測(cè)dna的分

26、子大小。同時(shí)取15pl稀釋20倍，測(cè)定od260/od280,檢測(cè)dna含量 及質(zhì)量。注意5g樣品可保證獲得500pg dnaz足供rflp、pcr等分析z用。（二）從李（蘋果）葉子提取基因組dna1.取3-5克嫩葉，液氮磨成粉狀。2.加入提取緩沖液ii 10ml,再研磨至溶漿狀。10000rpm, 10min。3.去上清液，沉淀加提取液i 20mlz混勻。65°cz 30-60min,常搖動(dòng)。4. 同本節(jié)（一）中步驟373操作。第三節(jié)從動(dòng)物組織提収基因組dna、材料 哺乳動(dòng)物新鮮組織。 二、設(shè)備 移液管、高速冷凍離心機(jī)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋。 三、試劑 1、分 離緩沖液：lommol

27、兒trisclph7.4,10mmol/lnaci,25mmol/ledta。2、其它試劑：10% sds,蛋白酶k （20mg/ml或粉劑），乙儲(chǔ)，酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）,無水乙醇及70%乙醇,5mol/l naci, 3mol/l naac, teo四、操作步驟： 1.切収組織5g左右,剔除結(jié)締組織，吸水紙吸干血液，剪碎放入研缽（越細(xì)越好）。2倒入液氮，磨成粉末，加10ml分離緩沖液。3.加1ml 10% sds,混勻，此時(shí)樣品變得很粘稠。4.加50ul或lmg蛋白酶k, 37°c保溫12小時(shí)，點(diǎn)到紐.織完全解體。 5.加1ml5mol/l naci,混勻z5000r

28、pm離心數(shù)秒鐘。6取上清液于新離心管，用等體枳酚:氯仿:界戊醇（25:24:1）抽提。待分層后,3000pm離心5分鐘。 7.取上層水相至干凈離心管，加2倍體積乙儲(chǔ)抽提（在通風(fēng)情 況下操作）。8.移去上層乙陸保昭下層水相。9.加1/10體積3mol/l naac,及2倍體積無水乙醇顛倒混介沉淀dna。室溫下靜止1020分鐘，dna沉淀形成白色絮狀物。10.用玻棒鉤ii*, dna沉淀,70%乙醇中漂洗后，在吸水紙上吸干,溶解于1ml te中,20°c保存。11.如果dna溶液中冇不溶解顆粒，可在5000rpm短愆離心，取上清；如要除去其中的rna,可加5pl rnasea（10|jg

29、/|jl）, 37°c保溫30分 鐘，用酚抽提后，按步驟9-10重沉淀dnao第四節(jié)細(xì)菌基因組dna的制備 一、材料 細(xì)菌培 養(yǎng)物。 二、設(shè)備移液管，高速冷凍離心機(jī)，臺(tái)式離心機(jī)，水浴鍋。三、試劑 kctab/naci溶液：4.1g naci溶解于80ml h2 0,緩慢加入10g ctab,加水至100ml2、其它試劑：氯仿:界戊醇（24:1）,酚:氯仿:異戊醉（25:24:1）,異丙略70%乙略te, 10% sds,蛋白酶k （20mg/ml或粉劑）， 5mol/lnacl四、操作步驟：l100ml細(xì)菌過棧培養(yǎng)液,5000rpm離心10分鐘，去上淸液。 2.加9.5ml te懸浮

30、沉淀，并加0.5ml 10% sds, 50pl 20mg/ml（或lmg干粉）蛋白酶k,混勻，37c保溫1小 時(shí)。 3.加 1.5ml 5mol/l naci,混勻。 4.加 1.5ml ctab/naci 溶液，混勻，65°c保溫 20 分鐘。5. 用等體積酚:氯仿:界戊醇（25:24:1）抽捉,5000rpm離心10分鐘，將上淸液移至干凈離心管。6.用等體積氯仿:異戊醉（24:1）抽提，取上清液移至干凈管屮。7.加1倍體積異丙醉，顛倒混合，室溫下靜止10分鐘，沉淀dnao 8.用玻棒撈出dna沉淀,70%乙醇漂洗屁 吸干,溶解丁 lml te, -20保存。 如dna沉淀無法撈

31、岀，可5000rpm離心，使dna沉淀。 9如要除去其中的rna,可以按本章第三節(jié) 中操作步驟處理。第五節(jié) 基因組dna的檢測(cè)上述方法得到的dna 一般可以用作southern, rflp、pcr等分析。山于所用材料的不同，得到的dna產(chǎn)量及質(zhì)最均不同，冇時(shí)dna中含冇酚類和多糖類物質(zhì)，會(huì) 影響酶切和pcr的效果。所以獲得基因組dna后，均需檢測(cè)dna的產(chǎn)量和質(zhì)量。 1. dna溶液稀釋20-30 倍扁測(cè)定0d260/od280比值，明確dna的含雖:和質(zhì)雖:。2.取25pl在0.7% agarose膠上電泳，檢測(cè)dna的分子大小。3.取2|jg dna,川10單位（u）hindlll酶切過夜

32、，0.7% agarose膠上電泳，檢測(cè)能否完全廨解（做rflp, dna必須完全廨解）。如果dna屮所含雜質(zhì)多，不能完全悔切，或小分子dna多，彩響接續(xù)的分析和操作，可以用下列方法處理：（1）選用幼嫩植物組織，可減少淀粉類的含量。（2）酚:氯仿抽提，去除蛋h質(zhì)和多糖。（3） sepharose柱過濾，去除酚類、多糖和小分子dna。（4） csci梯度離心，去除雜質(zhì)，分離大片段dna（可用作文庫構(gòu)建）。血塊中提取dna的方法1.取15ml研磨器，加入5ml血塊,4-5ml溶血試劑，研磨至無凝塊存在。轉(zhuǎn)移 到50ml離心管中,2500rpm, 10min. 2去上淸，假溶血試劑淸洗一遍，2500rpm, 10min,至無紅色存在。3.去上淸，加1ml細(xì)胞裂 解液，轉(zhuǎn)移到離心管，加20mg/ml蛋白酶kloml, 56度3小時(shí).4.每管加lml平衡酚，混勻，6000rpm, 10min5重復(fù)步驟4.6取上清t 2mlep管,加等體積氯仿/異丙醇,混勻，6000rpm, 10min. 7.取上清于 另一 2mlep管,加naac,混勻,加等體積的異丙醇,混勻,可見白色沉淀,loooorpm, 5min. 8去上清, 加03ml無水乙醇,loooorpm, 5min,去酒精，風(fēng)干。9加te,水浴至dna溶解，測(cè)dna濃度。注意 事項(xiàng)：要看一下酚的顏色，一般為