illuminaSNP分析技術(shù)方案書

1、genergy編號：jn20110912i i lumina snp分析技術(shù)方案書晶能生物技術(shù)（上海）有限公司二o年九月十二日公司背景illumina公司是一家從事開發(fā)，制造及銷售用于分析遺傳變異和生物功能的 綜合系統(tǒng)的高科技公司，于1998年成立，2005年進入中國，2007和2009年 兩次入選福布斯雜志評出的全美年度成長速度最快的高科技公司，同時亞太地區(qū)是 illumina全球增長最快的區(qū)域。公司在福布斯所公布的2009年度成長最快的高 科技公司中超越google,位列榜首。illumina的業(yè)務(wù)范圍包括生物芯片技術(shù)，和新一代高通量測序技術(shù)兩大領(lǐng) 域，具體則包括測序分析、基因表達(dá)分析、基

2、因調(diào)控及表觀遺傳學(xué)分析、蛋白篩選分 析、基因分型及cnv (拷貝數(shù)變異)分析。當(dāng)然最為用戶所知的是30倍磁珠覆蓋 產(chǎn)生的業(yè)內(nèi)最高重復(fù)度及準(zhǔn)確率，另外基因分型分析作為一種新興遺傳學(xué)技術(shù)，也正 成為illumina的一種核心技術(shù)。這項技術(shù)能夠從核酸水平分析導(dǎo)致個體疾病的遺 傳變異，為多基因復(fù)雜疾病易感性，復(fù)雜疾病的發(fā)生機制和疾病防治與藥物開發(fā)等領(lǐng) 域的研究提供幫助。在illumina領(lǐng)先技術(shù)引導(dǎo)下，以大規(guī)模snp基因分型數(shù)據(jù)為 基礎(chǔ)的全基因組關(guān)聯(lián)分析技術(shù)將為未來的個體化疾病診斷奠定基礎(chǔ)。illumina并購新一代高通量測序技術(shù)公司solexa后，測序成為illumina 另一項核心技術(shù)，華大基因(

3、bgi)近日花巨資購買的128臺最新的測序系統(tǒng) -hiseq 2000系統(tǒng)是illumina公司新發(fā)布的最高通量測序系統(tǒng)。利用兩個流 動槽和一種新穎的雙表面成像方法，hiseq 2000能夠在單次運行中產(chǎn)生600 gb 的數(shù)據(jù)，每天能產(chǎn)生75gbo該平臺已經(jīng)將人類基因組的測序費用降至1萬美元以 下。要知道早在幾年前人類基因組計劃全球數(shù)個國家花費了數(shù)億美元才完成這項工 作。晶能(genergy)生物技術(shù)有限公司是illumina自中國區(qū)總部移到上海 后，聯(lián)合各方資源成立的專業(yè)服務(wù)平臺公司，公司成立以來完成了數(shù)百項服務(wù)項目， 在華東地區(qū)競爭激烈的科研外包服務(wù)市場取得不錯比例的市場份額，也贏得了客戶

4、 的認(rèn)可，公司服務(wù)實驗室裝備華東地區(qū)第一臺hiseq 2000測序儀，已經(jīng)完美運 作完成數(shù)十項二代深度測序項目。芯片平臺如iscan平臺至今已完成3項 gwas項目，總計5000個樣本；各類基因芯片總計3500張。sequenom質(zhì) 譜檢測系統(tǒng)完成近20萬個snp位點分型。熒光定量服務(wù)近百項。晶能旨在能為 廣大科研開發(fā)工作者提供專業(yè)可靠的分子生物學(xué)科研外包服務(wù)。snp檢測技術(shù)背景人類基因組計劃的完成,標(biāo)志著人們進入了新的時代一一后基因組學(xué)時代，人們從基因 的序列研究跨越到功能的研究。人類基因組計劃完成后，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)任意兩個不相關(guān)的人的 dna序列有99. 9%是一致的，只有0. 1%的差異。而

5、這部分0. 1%由于包含了遺傳上的差異因素 而非常重要。這些差異造成人們罹患疾病的不同風(fēng)險和對藥物的不同反應(yīng)。單核昔酸多態(tài)性（single-nucleotide polymorphisms, snp）成為研究及標(biāo)記人與人之間微 小差異的最佳遺傳標(biāo)記。snp是在基因組中，不同個體的dna序列上的單個堿基的差異。女1,某些人的染色體 上某個位置的堿基是a,而另一些人的染色體的相同位置上的堿基則是gottkgctggc除性染色體外，每個人體內(nèi)的染色體都有兩份。一個人所擁有的一對等位位點的類型被稱作 基因型（genotype）。檢定一個人的基因型，被稱作基因分型（genotyping）。人類的基因不

6、到三萬個，存在超過1千萬個snp,其中3百萬個snp決定了人類的異質(zhì)性。snp的篩選及檢 測來發(fā)現(xiàn)于疾病相關(guān)的snp位點，是了解引起人類疾病的復(fù)雜原因的最重要途徑之一。同時 這些snp位點也標(biāo)記著不同個體罹患各種疾病的風(fēng)險，以及對藥物的不同反應(yīng)。snp是繼rflp和str后的第三代分子遺傳標(biāo)記，以其為標(biāo)簽，可尋找和發(fā)現(xiàn)疾病（如腫 瘤，高血壓，心臟病，各種精神性疾病等等）相關(guān)的基因。常用的方法是將一定數(shù)量的病人 檢休與正常人檢體作相關(guān)基因的snp分析，觀察特定s7p在兩組人群中出現(xiàn)頻率的差別。隨 著基因分型技術(shù)的飛速發(fā)展，越來越多與疾病有關(guān)的基因以及藥物效應(yīng)的個體差異與基因多 型性的關(guān)系被闡明，

7、snp成為未來醫(yī)學(xué)中個體化的疾病防治提供基礎(chǔ)，即朝向針對不同患者 的基因型態(tài)施以個人化醫(yī)療的方向發(fā)展。用于snp分型的技術(shù)有高分辨率熔解（high-resolution melting,簡稱hrm）分析技術(shù),基于一代sanger測序技術(shù)的分型方法,基于質(zhì)譜技術(shù)的sequenom mass array®分子量陣列技術(shù)，及基于illuminagoldengate專利的定制芯片分型技術(shù)。目前前兩者技術(shù)因為分型成本過高逐漸為后面三種技術(shù)所取代，而當(dāng)單一樣本需要同時分型的位點數(shù)超過100個時,illumina goldengate技術(shù)的成本是最低的且國際上公認(rèn)度最高。人類全基因組計劃完成后，全

8、球多個國家合作（美國，英國，口本，中國等）啟動了一 項后續(xù)計劃，人類單體型計劃（hapmap計劃），這個計劃的目的就是研究snp位點和疾病的關(guān) 系，旨在建立一個人類健康、疾病以及對藥物和環(huán)境因子的個體反應(yīng)差異相關(guān)的基因公用數(shù) 據(jù)庫。這一全球性計劃有70%的數(shù)據(jù)就是在goldengate®這個專利技術(shù)平臺上產(chǎn)生的，其中中 國科學(xué)家承擔(dān)了共10%的工作，這中間95%工作都是在goldengate®技術(shù)平臺上完成的（見nature2005年10月封面文章）。natureproject下附幾種snp分型技術(shù)比較表:snp分型技術(shù)比較表技術(shù)名稱原理簡述單次反應(yīng)通量平臺儀器單樣本單位點

9、 分析成本hrm snp分析技術(shù)通過不同基因型不同 pcr反應(yīng)時候退火溫 度不同，從溶解曲線 的差異識別基因型每個樣本1個位 點一次反應(yīng)熒光定量pcr儀器 50萬20_30 兀一代sanger測序技術(shù)通過對snp位點前后 一段序列測序知道基 因型每個樣本1個位 點一次反應(yīng)測序儀150萬20元sequenom massarray®snp 分析技術(shù)由于snp位點不同堿 基的分子量差別，質(zhì) 譜方法識別通過磁場 到達(dá)接收裝置時間不 同來識別基因型每個樣本最多 30個位點一次 反應(yīng)sequenom 質(zhì)譜儀 300萬8-10 元illumina goldengato snp分析技術(shù)針對特定snp

10、位點設(shè) 1+2-3組探針，其中 只有一組探針可以完 成擴增，帶入的堿基 因為事先標(biāo)記的特定 波長熒光信號而被識 別每個樣本最多 1536個位點一 次反應(yīng)iliumina 微珠芯片 工作站 150萬5元當(dāng)樣本量及同時分 析樣本數(shù)多時更低要求同時分析樣本數(shù)480以上附1:goldongate的基本原理如下:genomk dna1.準(zhǔn)備 gdna 250ng| attach gdna to solid support2.將gdna和固相磁性小珠相連| oligo anneafingialleie-spectfic extension and bgationpcr with imiversal pri

11、mersarray hybridization and imaqinaa/a l_a/g ii3. 加入根據(jù)snp位點特殊分析設(shè)計的探針組 opa,如snp是t/c位點，則合成的等位基因 特異性探針末端為a/g；通過等位基因特異 性延伸和連接酶連接得到一段包含該snp位 點的片斷。同吋該片斷帶有一段特殊設(shè)計的 地址序列。4. 該片斷進行pcr擴增，并在反應(yīng)過程屮加入 cy3,cy5 熒光5. 雜交：和芯片進行雜交，芯片的微珠上連 接有地址序列(address)的互補序列，通過 地址序列完成雜交，雜交效率兒乎完全一致。 snp位點通過兩種熒光顏色讀取區(qū)分goldengate®檢測技術(shù)和

12、veracode平臺相結(jié)合，可以靈活地根據(jù)實驗者需要在一個樣品中檢測48, 96, 144, 192或384個snp位點，這些位點的設(shè)計挑選靈活，完全根據(jù)需要而定。在檢測中，根據(jù)snp位點設(shè)計2組不同的探針，每一組分別代表一個snp的等位基因goldengate 檢測的特點1.高度靈活：內(nèi)容高度靈活：完全根據(jù)研究需要確定snp位點制成芯片，每個樣品可同時進行384, 76& 1536 plex snp位點的研究。芯片形式靈活:客戶可根據(jù)樣本量以及snp位點數(shù)量來確定使用何種格式的芯片illumina公司的芯 片有三種格式，universal-12, universal-16, univ

13、ersal-32,每張芯片進行 12, 16, 32個樣本 的檢測，可針對384, 76& 1536個snp位點進行探針的設(shè)計。2實驗成功率高：goldengate ®檢測芯片采用了特殊的設(shè)汁，芯片的微珠上僅帶有地址序列而 沒有基因組的對應(yīng)序列，不同snp位點的檢測差異在opa探針組的設(shè)計上實現(xiàn)，這一專利的設(shè)計 使芯片雜交在地址序列和其互補序列進行間接雜交完成，和基因組序列無關(guān)。所有的地址序列都 經(jīng)過特殊設(shè)計，具有近似的雜交溫度，退火溫度以及cg含量穩(wěn)定等特點，朵交效率很高。所以, 使用微珠芯片進行基因分型實驗的成功率也就很高，成功率一般99%。3實驗重復(fù)性高：基于微珠芯片以

14、及goldengate ®檢測獨特的設(shè)汁：每個snp位點有30倍的重 復(fù)，雜交在地址序列i'可發(fā)生等特點，檢測重復(fù)性99.7%。4密度高，信息量大：面積直徑為15.75mmx 1.8mm的微珠芯片包含有900,000個微珠，其密度高 達(dá)400萬/cm2 fl前密度最高的芯片，是傳統(tǒng)芯片密度的4400倍，而其研允通量為傳統(tǒng)基因分型 手段的8至48倍。5低樣品量：250ngdna可檢測1536個snp位點的基因型信息。6實驗過程全程監(jiān)控一內(nèi)參微珠：芯片屮設(shè)計了幾百個內(nèi)參微珠對實驗過程進行監(jiān)控，女山樣品 污染，延伸特異性等。genomestudio基因分型分析軟件自動報告實驗監(jiān)控結(jié)

15、果。7完全均一：微珠芯片采用了微珠和光纖的設(shè)計，芯片點（微珠）大小完全均一：3微米，點和點 之間間距完全均一：5.7微米。解決了傳統(tǒng)芯片點大小，定位難以高度均一的瓶頸問題。8芯片生產(chǎn)100%qc質(zhì)控：微珠芯片生產(chǎn)過程中專利的解碼技術(shù)，質(zhì)控能深入到每張芯片上每個 微珠每個特性，保證數(shù)據(jù)的可靠性和重復(fù)性。9.高性價比：單個位點的分析成本是其他技術(shù)的1/4甚至1/10.附2： illumina snp分析技術(shù)部分文獻(xiàn)：sigurdsson s, nordmark g, gamier s, grundberg e, kwan t, et al. (2008) a risk haolotyoe of s

16、tat4 for systemic iudus erythematosus is over-expressed, correlates with anti-dsdna and shows additive effects with two risk alleles of irf5. hum mol genet 17:2868-76.karlsson ek, lindblad-toh k (2008) leader of the pack: gene madding in dogs and other model organisms. nat rev genet 9:713-25moss?yp,

17、 laudenslager m, longo l, cole ka, wood a, et al. (2008) identification of alk as a major familial neuroblastoma predisposition gene. nature 455:930-5.cooper gm, johnson ja, langaee ty, feng h, stanaway ib, et al. (2008) a genome-wide scan for comm on genetic varia nts w讓 h a large in fluence on war

18、fari n mainte nance dose. blood 112:1022-7.levran o, londono d, ohara k, nielsen da, peles e, et al. (2008) genetic susceptibility to heroin addiction; a candidate-gene association study. genes brain behav epub ahead of print.,sakamoto h, yoshimura k, saeki n, katai h, et al. (2008) genetic variatio

19、n in psca is associated with susceptibility to diffusetyoe gastric cancer. nat genet 40:730-40.chambers jc, elliott p, zabaneh d, zhang w, li y, et al. (2008) comm on genetic variati on near mc4r is associated with waist circumference and insulin resistance. nat genet 40:716-8.loos rj, lindgren cm,

20、li s, wheeler e, zhao jh, et al. (2008) common variants near mc4r are associated with fat mass, weight and risk of obesity. nat genet 40:768-75.plenge rm, seielstad m, padyukov l, lee at, remmers ef, et al. (2007) traf1-c5 as a risk locus for rheumatoid arthritisa genomewide study. n engl j med 357:

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22、dy of major determinants for host control of hiv-1 scienee 317:944-7.stefansson h，rye db, hicks a, petursson h, ingason a, et al. (2007) a genetic risk factor for periodic limb movements in sleep. n engl j med 357:639-47hakonarson h, grant sf, bradfield jp, marchand l, kim ce, et al. (2007) a genome

23、-wide association study identifies kiaa0350 as a type 1 diabetes gene. nature 448:591 -4.moffatt mf, kabesch m, liang l, dixon al, strachan d, et al. (2007) genetic variants regulating ormdl3 expression contribute to the risk of childhood asthma. nature 448:470-3.gudbjartsson df, amar do, helgadottir a, gretarsdottir s, holm h, et al. (2007) variants conferring risk of atrial fibrillation on chromosome 4q25 nature 448:353-7van es ma, van vught pw,