實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)原理簡介

1、實(shí)時熒光定量技術(shù)原理簡介The principle of Real-time Quantitative PCR Content 1 Primary Principle 2 Quantitative Principle 3 Fluorescent Chemical Principle 4 Comparison with traditional PCR method一、 基本原理 在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析。 利用熒光信號的變化實(shí)時檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化,通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板

2、進(jìn)行定量分析。二、 定量原理 定量PCR以參照物為標(biāo)準(zhǔn)，對PCR終產(chǎn)物進(jìn)行分析或?qū)CR過程進(jìn)行監(jiān)測，從而達(dá)到評估樣本中靶基因的拷貝數(shù)。定量PCR的可行性定量一般是在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期進(jìn)行的。 Ct值指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。 閾值（threshold）指PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號，熒光閾值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。二、定量原理 Ct值與起始模板每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值。因此，只要

3、獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。 二、定量原理 用模板初始量（或未知量樣品的稀釋倍數(shù)）的log 值對每個稀釋樣品的Ct 值作圖，兩者呈遞減的線性關(guān)系，稱之為標(biāo)準(zhǔn)曲線。三、化學(xué)原理監(jiān)測目標(biāo)序列擴(kuò)增的化學(xué)方法熒光化學(xué)： DNA 結(jié)合染料（SYBR Green I） 熒光染料標(biāo)記地序列特異性寡聚核苷酸引物或探針（ TaqMan探針、分子信標(biāo)等）SYBR Green I SYBR Green I 是熒光定量PCR 最常用的DNA 結(jié)合染料，與dsDNA非特異性結(jié)合。在游離狀態(tài)下，SYBR Green I 發(fā)出微弱的熒光，但一旦與dsDNA 結(jié)合，其熒光增加1,000 倍

4、（圖）。 一個反應(yīng)發(fā)出的全部熒光信號與出現(xiàn)dsDNA 量成比例，且會隨擴(kuò)增產(chǎn)物的增加而增加。TaqMan 探針 TaqMan探針是一條序列特異地、熒光標(biāo)記的寡聚核苷酸探針，包含5端的熒光報告基團(tuán)（reporter）和3端的熒光淬滅基團(tuán)（quencher）。 探針完整時，由于熒光報告基團(tuán)接近淬滅基團(tuán)，報告基團(tuán)的熒光被淬滅，在擴(kuò)增反應(yīng)退火/延伸合并的階段，探針與靶標(biāo)雜交，Taq 酶53端的外切酶活性切除報告基團(tuán)，報告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離產(chǎn)生熒光信號，并與樣本中擴(kuò)增產(chǎn)物的量成比例。（圖 ）分子信標(biāo) 分子信標(biāo)是一段熒光標(biāo)記、具有莖環(huán)狀發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡聚核苷酸，5端附有熒光報告基團(tuán)，3端附有淬滅基團(tuán)，環(huán)被設(shè)計成與靶標(biāo)序列的1530 核苷酸特異雜交，環(huán)的兩端各有5-6 核苷酸互補(bǔ)形成莖結(jié)構(gòu)，將兩個基團(tuán)連接到一起。 發(fā)夾結(jié)構(gòu)中，報告基團(tuán)接近淬滅基團(tuán)，監(jiān)測不到熒光信號，退火階段分子信標(biāo)與靶標(biāo)序列結(jié)合，兩基團(tuán)分離，報告基團(tuán)不再被淬滅。 與TaqMan 實(shí)驗(yàn)不同，在反應(yīng)中分子信標(biāo)被替代而不是被破壞。由分子信標(biāo)上報告基團(tuán)發(fā)出的熒光信號強(qiáng)度與反應(yīng)中靶標(biāo)的量成比例。（圖）SYBR Green IExperiment of TaqMan 四、與傳統(tǒng)PCR的比較 可以用于定性（判斷一段序列的有無），也可以用于定量（確定DNA 拷貝數(shù)），而常規(guī)PCR 只能做半定量。 熒光定量PCR