多重不對稱擴增介紹

1、多重不對稱pcr 黃桃生（生物芯片組）多重不對稱pcr多重pcr(multiplex pcr)不對稱pcr（asymmetric pcr）獲得大量不同片段的單鏈dna（ssdna）多重pcr又稱多重引物pcr或復合pcr，它是在同一pcr反應體系里加上二對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的pcr反應，其反應原理，反應試劑和操作過程與一般pcr相同. 1、擴增單一基因中多個片段（華法林檢測） 2、擴增不同基因中多個片段（hpv分型）多重pcr技術優(yōu)點高效性高效性：在同一pcr反應管內(nèi)同時檢出多種病原微生物，或?qū)τ卸鄠€型別的目的基因進行分型，特別是用一滴血就可檢測多種病原體。系統(tǒng)性系統(tǒng)性：多重pc

2、r很適宜于成組病原體的檢測，如肝炎病毒，腸道致病性細菌，性病，無芽胞厭氧菌等同時檢測。經(jīng)濟經(jīng)濟簡便簡便性性：多種病原體在同一反應管內(nèi)同時檢出，將大大的節(jié)省時間，節(jié)省試劑，節(jié)約經(jīng)費開支，為臨床提供更多更準確的診斷信息。多重pcr技術難點反應原理，反應試劑和操作過程與一般pcr相同.難點主要體現(xiàn)在前期引物設計過程中反應體系的平衡 反應體系不平衡反應體系的不平衡導致在前期的幾輪反應中某些優(yōu)勢引物及其模板迅速擴增，獲得大量的擴增產(chǎn)物，而這些擴增產(chǎn)物同時又是dna聚合酶的良好抑制劑（santalucia, 2007）。所以，隨著擴增產(chǎn)物的大量出現(xiàn)，聚合酶的聚合能力被越來越強烈的抑制住了，因此，前期處于劣

3、勢的引物及其模板，這時就更加舉步維艱，最終導致擴增產(chǎn)物量非常之小，以至于無法檢測。正所謂強者更強、弱者更弱。導致不平衡的原因： 1、引物特異性； 2、最佳退火溫度不一致； 3、引物二聚體；4、模板量不同；5、引物擴增效率引物特異性如果引物與體系中其他非目的基因片段結(jié)合能力更強，那么目的基因結(jié)合引物的能力就會受到競爭，從而導致擴增效率下降。嚴格blast驗證最佳退火溫度不一致將多對引物放置入一個體系中擴增，由于進行pcr反應的退火溫度相同，所以要求每一對引物的最佳退火溫度接近。前期引物設計時減少最佳退火溫度的差異，最佳退火溫度的差異不超過35為宜。引物二聚體包括引物間的二聚體以及引物自身所形成的

4、發(fā)卡結(jié)構，還有一類是第三方dna介導的二聚體，這些二聚體和非特異引物一樣都會干擾引物與目標結(jié)合位點的競爭，影響擴增效率。針對不同對引物之間二聚體，目前可以采用visual omp6軟件（7天試用版）進行驗證。引物擴增效率這個因素很重要，但也很籠統(tǒng)，它也許包含了上面提到的幾個因素，但更多的因素還不清楚。引物的擴增效率到目前為止，還沒有一個可以明確的定量計算方法。目前也有文章提出使用統(tǒng)計學方法，利用qpcr的數(shù)據(jù)建立一個模型，來預測引物與目標序列的擴增效率。 http:/srvgen.upct.es/efficiency.html不對稱pcr用不等量的一對引物進行模板的擴增，pcr擴增后產(chǎn)生大量的

5、單鏈dna。這對引物分別稱為非限制性引物和限制性引物。在擴增過程前10-20個循環(huán)，其擴增產(chǎn)物主要是雙鏈dna，但當限制性引物(低濃度引物)消耗殆盡，不再引導擴增，而非限制性引物(高濃度引物)引導的pcr會繼續(xù)進行，從而就會產(chǎn)生大量的單鏈dna。不對稱pcr優(yōu)缺點優(yōu)點優(yōu)點可以獲得大量ssdna，快速進行下游操作。比如直接進行測序，或者下游雜交檢測無需經(jīng)過變性這一步驟。缺點缺點前期10-20循環(huán)相當于對稱擴增，單鏈dna在此之后才會出現(xiàn)，從而導致pcr擴增循環(huán)數(shù)增加，靈敏度較對稱性擴增低。不對稱擴增對于低拷貝樣本的擴增較難，對于病原體檢測需要更詳盡的pcr設計和優(yōu)化。不對稱pcr設計設計不對稱p

6、cr引物時，限制性引物的tm值較非限制性引物tm值高46，擴增效果更佳。不對稱pcr設計在于控制限制性引物（低濃度引物）的絕對量，限制性引物過多或過少，均不利于ssdna的制備。限制性引物量可以考慮設置在0.8-1.5p之間。設置限制性引物量后，再通過實驗驗證限制性引物濃度和非限制性引物濃度的比例，目前常用比例1:3、1:5、1:10、1:15、1:20進行優(yōu)化，一般情況下，1:10、1:20比例情況下效果可能更佳。增加單鏈的方法1、納米金微粒介導不對稱擴增 納米金顆?？梢栽鰪妏cr擴增效率和特異性，有可能是由于金納米顆粒與單鏈引物之間特異性結(jié)合，類似單鏈結(jié)合蛋白ssb功能，一直pcr非特異性

7、擴增，更重要的可能是，金納米顆粒的熱效率和熱傳導，在液相中，納米顆?？梢钥焖賯鬟f熱量并且與周圍環(huán)境在10200ps內(nèi)形成熱平衡，增強擴增效率。通過金納米顆粒介導進行的不對稱pcr，可以獲得與普通不對稱pcr更好的效果。2、late-pcr(linear-after-the-exponential pcr)多重不對稱pcr重要影響因素引物二聚體引物特異性 主要是導致不對稱pcr限制性引物和非限制性引物比例的改變，或者限制性引物絕對量的改變，從而導致擴增差異化或者擴增失敗。多重不對稱pcr設計軟件primerplex（付費）一款設計特征寡核苷酸片斷、用于同時分析100種核酸序列的工具。mpprimer（開放、在線）最多一次可以設計6對引物、基于pp3內(nèi)核。pp5/oligo 6+ omp 6（目前芯片組設計多重不對稱擴