生物制藥層析技術

1、LOGO層析技術1李紹軍李紹軍2 層析技術（層析技術（chromatographychromatography）又稱）又稱色譜技色譜技術、層離技術術、層離技術等，是一組相關技術的總稱。等，是一組相關技術的總稱。 層析技術具有分離精度高、設備簡單、操作方便等優(yōu)點，是當前獲得高純度產(chǎn)物最有效的分離純化技術。主要內(nèi)容主要內(nèi)容第一節(jié)第一節(jié) 概述概述第二節(jié)第二節(jié) 凝膠層析技術凝膠層析技術5概述概述1、層析基本原理2、層析技術分類3、層析操作過程中一些基本概念和參數(shù)4、層析系統(tǒng)的基本組成及基本操作67 當含有被分離物質(zhì)的料液流過層析柱時，由于層析劑當含有被分離物質(zhì)的料液流過層析柱時，由于層析劑對各組分的阻

2、滯力不同而使各組分分離開來（不同組分在對各組分的阻滯力不同而使各組分分離開來（不同組分在流動相和固定相分配不同）。流動相和固定相分配不同）。第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述一、層析基本原理一、層析基本原理三通閥三通閥收集器收集器檢測器檢測器泵泵泵泵流流動動相相料料液液DCBA層層析析柱柱時間（或流出體體積）時間（或流出體體積）流流出出組組分分濃濃度度A B C D（a）層析系統(tǒng)基本組成）層析系統(tǒng)基本組成（b）分離出組分峰圖）分離出組分峰圖8按流動相按流動相- -固定相分固定相分F氣氣- -液色譜（液色譜（GLCGLC）F氣氣- -固色譜（固色譜（GSCGSC）F液液- -液色譜（液色譜（LLCLLC）

3、F液液- -固色譜（固色譜（LSCLSC）按固定相不同分按固定相不同分F柱色譜柱色譜F紙色譜紙色譜F薄層色譜薄層色譜按分離機理不同分按分離機理不同分F吸附色譜吸附色譜F離子交換色譜離子交換色譜F凝膠色譜凝膠色譜F親和層析親和層析F疏水層析疏水層析二、層析技術分類二、層析技術分類第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述9三、層析操作過程中一些基本概念和參數(shù)三、層析操作過程中一些基本概念和參數(shù)料液料液( (各組分各組分)層析柱分離層析柱分離隨流動相依次流出隨流動相依次流出進入檢測器進入檢測器響應信號響應信號 色譜圖的縱坐標為檢測器的響應信號，橫坐標為時間或色譜圖的縱坐標為檢測器的響應信號，橫坐標為時間或流動相流出

4、體積。流動相流出體積。時間（或流出液體積）時間（或流出液體積）流流出出組組分分濃濃 度度A B C D1.1.色譜流出曲線色譜流出曲線( ( 色譜圖色譜圖) ) 102. 2. 體積、時間體積、時間 總柱床體積（總柱床體積（V Vt t）：層析劑經(jīng)溶脹、裝柱、沉降，）：層析劑經(jīng)溶脹、裝柱、沉降，體積穩(wěn)定后所占據(jù)層柱內(nèi)的總體積。體積穩(wěn)定后所占據(jù)層柱內(nèi)的總體積。 外水體積（外水體積（V Vo o）：柱中層析劑顆粒間隙的液相體積）：柱中層析劑顆粒間隙的液相體積的總和。的總和。 內(nèi)水體積（內(nèi)水體積（V Vi i）：溶脹后的層析劑顆粒網(wǎng)孔中的液）：溶脹后的層析劑顆粒網(wǎng)孔中的液相體積的總和。相體積的總和。

5、 基質(zhì)體積（基質(zhì)體積（V Vg g）：干膠體積，是層析劑基質(zhì)顆粒骨）：干膠體積，是層析劑基質(zhì)顆粒骨架所占據(jù)的體積。架所占據(jù)的體積。Vt = Vo十十ViVg11 洗脫時間洗脫時間( (或保留時間或保留時間)(te)(te)：從洗脫開始，某一成：從洗脫開始，某一成分從柱頂部到底部的洗脫液中出現(xiàn)濃度達到最大值分從柱頂部到底部的洗脫液中出現(xiàn)濃度達到最大值( (洗脫峰最高點洗脫峰最高點) )時的時間。時的時間。 洗脫體積洗脫體積(Ve)(Ve)：從洗脫開始，某一成分從柱頂部到底：從洗脫開始，某一成分從柱頂部到底部的洗脫液中出現(xiàn)濃度達到最大值部的洗脫液中出現(xiàn)濃度達到最大值( (洗脫峰最高點洗脫峰最高點)

6、 )時時的流動相體積。的流動相體積。12 死體積死體積( (V Vm m) )：指不被層析柱層析劑滯留的惰性組分，從：指不被層析柱層析劑滯留的惰性組分，從開始洗脫到柱出口出現(xiàn)濃度最大值時流出的流動相體積開始洗脫到柱出口出現(xiàn)濃度最大值時流出的流動相體積。其值等于外水體積加內(nèi)水體積。其值等于外水體積加內(nèi)水體積。 死時間死時間( (t tm m) )：指不被層析柱層析劑滯留的惰性組分，從：指不被層析柱層析劑滯留的惰性組分，從開始洗脫到柱出口出現(xiàn)濃度最大值所需的時間。其值等開始洗脫到柱出口出現(xiàn)濃度最大值所需的時間。其值等于流動相流過層析柱所需的時間。于流動相流過層析柱所需的時間。 調(diào)整保留時間調(diào)整保留

7、時間( (t te e t tm m) )： 保留時間扣除死時間的值。保留時間扣除死時間的值。1314峰高（峰高（H H）：色譜峰頂點與峰底之間的垂直距離稱為峰高。）：色譜峰頂點與峰底之間的垂直距離稱為峰高。峰寬峰寬(W)(W)和半峰寬和半峰寬(W(W1/21/2):):峰寬是通過色譜峰的拐點作切線在峰寬是通過色譜峰的拐點作切線在峰底部的截距。半峰寬是洗脫峰高一半時的寬度。峰底部的截距。半峰寬是洗脫峰高一半時的寬度。峰面積峰面積(A):(A):峰與峰底之間的面積稱為峰面積。峰與峰底之間的面積稱為峰面積。 3. 3. 峰高、峰面積和峰寬峰高、峰面積和峰寬15分離度分離度(R)(R)又稱分辨率，是

8、相鄰兩個洗脫峰保留時間之又稱分辨率，是相鄰兩個洗脫峰保留時間之差的差的2 2倍與色譜峰峰基寬之和的比值，表示式為：倍與色譜峰峰基寬之和的比值，表示式為：R R = = 2 2（t te2e2t te1e1）（WW1 1 + + WW2 2） R1R1時，兩峰部分重疊；時，兩峰部分重疊；R=1R=1時，兩峰有時，兩峰有98%98%的分離；的分離；R=1.5R=1.5時，兩峰分離程度可達時，兩峰分離程度可達99.7%99.7%。因此，一般用因此，一般用R=1.5R=1.5作為兩種組分完全分離的標志。作為兩種組分完全分離的標志。 4. 4. 層析柱的分離度層析柱的分離度 式中：式中：te2 和和te

9、1洗脫峰洗脫峰2和峰和峰1的保留時間；的保留時間； W1 和和W2 洗脫峰洗脫峰1和峰和峰2的峰寬。的峰寬。16它們之間的換算關系為：它們之間的換算關系為：體積流速（體積流速（mL/mimmL/mim） = = 線性流速（線性流速（cm/hcm/h）層析柱截面積（層析柱截面積（cmcm2 2）/60/60。 5. 5. 流速的表示法流速的表示法在放大過程中應保持在放大過程中應保持線性流速線性流速不變；而增加不變；而增加體積流速體積流速將將隨隨層析柱截面層析柱截面積積的增大而增加。的增大而增加。流速有流速有線性流速線性流速(cm/h)(cm/h)和和體積流速體積流速(mL/min)(mL/min

10、)。176. 6. 柱效柱效 柱效柱效是表達層析柱性能的重要參數(shù)，可用是表達層析柱性能的重要參數(shù)，可用理論塔板數(shù)理論塔板數(shù)N N和和理論塔板高度理論塔板高度H H來衡量來衡量。 N=5.54 (te/W1/2)2H=L/N 理論塔板數(shù)越理論塔板數(shù)越大大或理論塔板高度越或理論塔板高度越小小，說明層析說明層析柱分離效率越柱分離效率越高高。18四、柱層析系統(tǒng)的基本組成及基本操作四、柱層析系統(tǒng)的基本組成及基本操作F層析柱層析柱+ +層析劑層析劑F上樣洗脫系統(tǒng)上樣洗脫系統(tǒng)F檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)F收集系統(tǒng)收集系統(tǒng)1.1.柱層析系統(tǒng)的基本組成柱層析系統(tǒng)的基本組成三通閥三通閥收集器收集器檢測器檢測器泵泵泵泵流流動

11、動相相料液料液DCBA層層析析柱柱19時間（或流出體體積）時間（或流出體體積）流 出流 出組 分組 分濃度濃度A B C D 層析劑選擇和預處理層析劑選擇和預處理 裝柱裝柱 平衡平衡 上樣上樣 洗脫洗脫 檢測檢測 收集收集層析劑再生和保存層析劑再生和保存2.2. 柱層析的基本操作柱層析的基本操作第二節(jié)第二節(jié)凝膠層析技術凝膠層析技術1、定義2、應用3、原理4、凝膠的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)5、凝膠層析的生產(chǎn)條件和操作6、凝膠層析的應用2021gel filtration chromatography,GFC一、一、定義定義凝膠層析（凝膠層析（gel chromatography）也稱：也稱： 分子篩層析分子篩

12、層析 分子排阻層析分子排阻層析 凝膠過濾凝膠過濾 凝膠色譜等凝膠色譜等二、二、應用應用l凝膠層析法適用于分離和提純蛋白質(zhì)、酶、多肽、激素、多糖、核酸類等物質(zhì)。l分子大小彼此相差25%的樣品，只要通過單一凝膠床就可以完全將它們分開。l利用凝膠的分子篩特性，可對這些物質(zhì)的溶液進行脫鹽、去熱源和脫色。三、三、原理原理凝膠是一類多孔性高分子聚合物，每個顆粒猶如一個篩子。當樣品溶液通過凝膠柱時，相對分子質(zhì)量較大的物質(zhì)沿著凝膠顆粒間的孔隙，隨著溶劑流動，首先流出層析柱；相對分子質(zhì)量較小的物質(zhì)可自由地進出凝膠顆粒的網(wǎng)孔，使流量增長，移動速率慢而最后流出層析柱。中等大小的分子在大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)之間被洗脫

13、。這樣，經(jīng)過層析柱，混合物中的各物質(zhì)按其分子大小不同而被分離。帶網(wǎng)孔的帶網(wǎng)孔的葡聚糖珠葡聚糖珠小分子進小分子進入葡聚糖入葡聚糖珠內(nèi)珠內(nèi)大分子不大分子不能進入珠能進入珠內(nèi)，經(jīng)珠內(nèi)，經(jīng)珠之間縫隙之間縫隙流出流出固定相（凝膠）固定相（凝膠）三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)樣品樣品固固定定相相流流動動相相小分子小分子被延滯被延滯小分子小分子大分子大分子較快流出較快流出分子篩效應分子篩效應： 按分子大小不同按分子大小不同, ,在凝在凝膠受到的膠受到的阻滯作用阻滯作用有差異有差異, ,從從而造成各組分在凝膠柱中的而造成各組分在凝膠柱中的遷移速度不同得到分離。遷移速度不同得到分離。 1、比孔穴孔徑大的分子不能擴散到孔穴內(nèi)部

14、，完全被排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外的空間隨流動相向下流動，它們經(jīng)歷的流程短，流動速度快，所以首先流出； 2、較小的分子則可以完全滲透進入凝膠顆粒內(nèi)部，經(jīng)歷的流程長，流動速度慢，所以最后流出； 3、分子大小介于二者之間的分子在流動中部分滲透，滲透的程度取決于它們分子的大小，所以它們流出的時間介于二者之間。 凝膠過濾層析凝膠過濾層析凝膠過濾層析過程示意凝膠過濾層析過程示意圖圖小分子小分子大分子大分子凝膠基質(zhì)凝膠基質(zhì)凝膠珠凝膠珠 分子越大的組分越先流出，分子越小的組分越后流出。這樣樣品經(jīng)過凝膠層析后，各個組分便按分子從大到小的順序依次流出，從而達到了分離的目的。 30（一）平衡排除理論（一）平衡排

15、除理論當溶質(zhì)層流過一個填料顆料這段距離時，溶質(zhì)分子已多次進出于填料的孔，達到平衡。平衡條件只是在流速很慢時的一個極端情況。31（二）（二）擴散分離理論擴散分離理論 溶質(zhì)分子在流經(jīng)色譜柱的過程中，在流動相和固定相之間沒有達到平衡，存在著流速依賴性。聚苯乙烯和苯乙烯樣品淋出曲線的流速依賴性聚苯乙烯和苯乙烯樣品淋出曲線的流速依賴性1 1流速為流速為0.65ml/min0.65ml/min；2 2流速為流速為2.0ml/min2.0ml/min溶劑為甲苯溶劑為甲苯 32（三）（三）流動分離理論流動分離理論 紅細胞在毛血細管中流動時比血漿流得快。 較大的分子較先通過或繞過這個填料顆粒，使溶質(zhì)能按其大小進

16、行分離。 33分離過程分離過程三種不同分子量物質(zhì)的混合樣品用某種規(guī)格的凝膠柱進行分離。樣品加入，以水或其他溶液進行洗脫，即得洗脫曲線 。34分離過程分離過程最先流出物質(zhì)A，A分子量最大，完全不能進入顆粒內(nèi)部，只能從顆粒間隙流過， “全排阻”。其流經(jīng)體積最小，等于外水體積V0。最后流出物質(zhì)C，它分子量最小，其分子可以自由進出凝膠顆粒， “全滲入”。流經(jīng)體積是外水體積與內(nèi)水體積之和V0+Vi。物質(zhì)B分子量介于滲入限與排阻限之間，其分子能夠部分地進入凝膠顆粒中。 “部分排阻”或“部分滲入”。流徑體積Ve是全部外水體積加上內(nèi)水體積的一部分，即Ve=V0+KdVi 35分配系數(shù)分配系數(shù)Kd排阻系數(shù)：當K

17、d=1時，洗脫體積Ve=V0+Vi，為全滲入。當Kd=0時，洗脫體積Ve=V0，為全排阻。0Kd1時，洗脫體積Ve=Vo+KdVi，為部分滲入。36凝膠層析的特點凝膠層析的特點（1）凝膠層析操作簡便，所需設備簡單。（2）分離效果較好，重復性高。（3）分離條件緩和。（4）應用廣泛。（5）分辨率不高，分離操作較慢。37四、四、凝膠的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)凝膠的結(jié)構(gòu)和性質(zhì) 一、葡聚糖凝膠 (Sephadex)二、修飾葡聚糖凝膠 (Modified Sephadex)三、聚丙烯酰胺凝膠 （Bio-Gel P）四、瓊脂糖類凝膠 （Sepharose ） 五、多孔玻璃微球 (Bio-glas)六、疏水性凝膠（hydr

18、ophobic gels） 38（一一）、）、葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠 (Sephadex)商品名為Sephadex G類。交聯(lián)葡聚糖的基本骨架是葡聚糖。再經(jīng)3-氯-1，2-環(huán)氧丙烷為交聯(lián)劑，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子化合物。其交聯(lián)度是通過交聯(lián)劑的加量及反應條件來控制的。 交聯(lián)葡聚糖凝膠的化學結(jié)構(gòu)交聯(lián)葡聚糖凝膠的化學結(jié)構(gòu) 葡聚糖凝膠網(wǎng)孔大小可通過調(diào)節(jié)交聯(lián)劑和葡聚糖的配比葡聚糖凝膠網(wǎng)孔大小可通過調(diào)節(jié)交聯(lián)劑和葡聚糖的配比及反應條件來控制。交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔越小，吸水膨脹就越及反應條件來控制。交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔越小，吸水膨脹就越小。交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔越大，吸水膨脹就越大小。交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔越大，吸水膨脹就越大

19、。 G G類葡聚糖凝膠常用類葡聚糖凝膠常用G-XG-X代表，代表，X X數(shù)字既代表交聯(lián)度，也數(shù)字既代表交聯(lián)度，也代表特水量。代表特水量。X X數(shù)字越小，交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔越小，適用于數(shù)字越小，交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔越小，適用于分離低分子質(zhì)量生化產(chǎn)品。分離低分子質(zhì)量生化產(chǎn)品。X X數(shù)字越大，交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔數(shù)字越大，交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔越大，適用于分離高分子生化產(chǎn)品。越大，適用于分離高分子生化產(chǎn)品。X X數(shù)字也代表凝膠的持數(shù)字也代表凝膠的持水量，水量，如如G-25G-25表示表示1g1g干膠持水干膠持水2.5mL2.5mL，G-100G-100表示表示 1g1g干膠持干膠持水水10mL10mL，依次類推。，

20、依次類推。41Sephadex G編號意義： 1、吸液量； 2、溶漲時間； 3、凝膠孔徑； 4、分離范圍 蛋白質(zhì)、多糖42葡聚糖凝膠性能與編號的關系葡聚糖凝膠性能與編號的關系43葡聚糖凝膠（葡聚糖凝膠（G類）的規(guī)格類）的規(guī)格44葡聚糖凝膠（葡聚糖凝膠（G類）特點類）特點1、孔徑。2、穩(wěn)定性。3、吸附作用。4、芳香族化合物和雜環(huán)化合物。 1、Sephadex在水、鹽、堿、弱酸以及有機溶液中都比較穩(wěn)定，可以多次重復使用。 2、穩(wěn)定工作pH為210，強酸溶液和氧化劑會使交聯(lián)的糖苷鍵水解斷裂。 3、在高溫下穩(wěn)定，可煮沸消毒，在100 C下40 min對凝膠的結(jié)構(gòu)和性能都沒有明顯的影響。性質(zhì)與特點性質(zhì)與

21、特點 4、含有羥基，呈弱酸性，有可能與分離物中的一些帶電基團（尤其是堿性蛋白）發(fā)生吸附作用。但一般在離子強度大于0.05的條件下，幾乎沒有吸附作用。 5、有各種顆粒大?。ù?、中、細、超細）可以選擇，一般粗顆粒流速快，但分辨率較差；細顆粒流速慢，但分辨率高。 6、機械穩(wěn)定性相對較差，不耐壓，分辨率高的細顆粒要求流速較慢，所以不能實現(xiàn)快速而高效的分離。 47保存保存保存的方法有干法、濕法和半縮法三種。濕法：加入一定量的防腐劑置于冰箱中作短期保存（6個月以內(nèi)）。常用0.02%疊氮化鈉、0.02%三氯叔丁醇、20%乙醇等。干法：用濃度逐漸升高的乙醇分步處理洗凈的凝膠，脫水收縮，抽濾，用6080吹干。半

22、縮法：48（二二）修飾葡聚糖凝膠修飾葡聚糖凝膠 (Modified Sephadex)（一）親脂性葡聚糖凝膠（Lipophilic Sephadex） 骨架結(jié)構(gòu)上引入一些有機基團，如甲基、羥丙基，使呈親脂性，同時保留親水性。 這種凝膠既親脂又親水，可在多種有機溶劑中膨脹。這種凝膠在pH2的不含氧化劑的溶液中穩(wěn)定。用低級醇為溶劑時，對芳香族、雜環(huán)族化合物仍有吸附作用。但用氯仿時則可去除對上述化合物的吸附作用，而對含羥基與羧基的化合物卻有吸附作用 。 國產(chǎn)國產(chǎn)Sephadex LHSephadex LH2020可用于分子篩層析、吸附層析和可用于分子篩層析、吸附層析和分配層析。很適用于脂肪酸、甘油脂

23、、類固醇、維生素、激分配層析。很適用于脂肪酸、甘油脂、類固醇、維生素、激素類生化產(chǎn)品的分離。洗脫劑可用單一有機溶劑如甲醇、氯素類生化產(chǎn)品的分離。洗脫劑可用單一有機溶劑如甲醇、氯仿等，也可用混合溶劑如氯仿與甲醇的混合液。仿等，也可用混合溶劑如氯仿與甲醇的混合液。（二）葡聚糖凝膠離子交換劑（二）葡聚糖凝膠離子交換劑 在在G G類凝膠上引入一些酸性或堿性基團后，則制得各種葡類凝膠上引入一些酸性或堿性基團后，則制得各種葡聚糖凝膠離子交換劑聚糖凝膠離子交換劑 。 如引入磺乙基（如引入磺乙基（SE-SephadexSE-Sephadex）、羧甲基（）、羧甲基（CM-SephadexCM-Sephadex）

24、及二乙胺基乙基（及二乙胺基乙基（DEAE-Sephadex ADEAE-Sephadex A）等。葡聚糖凝膠離子交）等。葡聚糖凝膠離子交換劑具有離子交換和分子篩雙重作用。其結(jié)構(gòu)多孔、疏松、非換劑具有離子交換和分子篩雙重作用。其結(jié)構(gòu)多孔、疏松、非特異性吸附很少，層析時流速易控制，特別適用于蛋白質(zhì)、酶特異性吸附很少，層析時流速易控制，特別適用于蛋白質(zhì)、酶、激素、多核苷酸等的分離純化，以及生化制劑的除熱原。、激素、多核苷酸等的分離純化，以及生化制劑的除熱原。 51 （三）Supperdex系凝膠由高交聯(lián)度多孔瓊脂糖與葡聚糖共價結(jié)合而成。（四）Sephacryl系凝膠是由烯丙烷基葡聚糖經(jīng)甲叉雙丙烯酰胺

25、共價交聯(lián)制成的。理化穩(wěn)定性好，為硬性凝膠，可耐高壓滅菌。52Supperdex系凝膠系凝膠53Sephacryl系凝膠系凝膠54（三三) )、聚丙烯酰胺凝膠、聚丙烯酰胺凝膠 商品名為生物凝膠-P（Bio-Gel P）。該凝膠由丙烯酰胺組成；以亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑，聚合而成。只要控制單體用量和交聯(lián)劑的比例，就能得到不同型號的凝膠。特點： 1、孔徑； 2、穩(wěn)定性、強度； 3、無非特異吸附，保存方便； 4、編號反映出它的分離界限。 在聚丙烯酰胺凝膠的合成過程中，單體和交聯(lián)劑的配比在聚丙烯酰胺凝膠的合成過程中，單體和交聯(lián)劑的配比可以任意改變。以（可以任意改變。以（T T）代表）代表100mL100

26、mL凝膠溶液中含有的單體和凝膠溶液中含有的單體和交聯(lián)劑總克數(shù)，稱為交聯(lián)劑總克數(shù)，稱為凝膠濃度凝膠濃度。而其中交聯(lián)劑占單體和交聯(lián)。而其中交聯(lián)劑占單體和交聯(lián)劑總量的百分比稱為劑總量的百分比稱為交聯(lián)度交聯(lián)度，以（，以（C C）表示，交聯(lián)度越大，網(wǎng)）表示，交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔越小，交聯(lián)度越小，則網(wǎng)孔越大。聚丙烯酰胺凝膠全是由孔越小，交聯(lián)度越小，則網(wǎng)孔越大。聚丙烯酰胺凝膠全是由碳一碳骨架構(gòu)成，穩(wěn)定性較好，適合于做凝膠層析的載體。碳一碳骨架構(gòu)成，穩(wěn)定性較好，適合于做凝膠層析的載體。只有在極端只有在極端pHpH條件下酰胺鍵才被水解為羧基，使凝膠帶有一條件下酰胺鍵才被水解為羧基，使凝膠帶有一定的離子交換基團，故一

27、般只在定的離子交換基團，故一般只在pH2pH21111的范圍內(nèi)使用。的范圍內(nèi)使用。 像像SephadexSephadex一樣，商品聚丙烯酰胺為顆粒狀的干粉，它一樣，商品聚丙烯酰胺為顆粒狀的干粉，它有十分明顯形成塊狀并粘附在一起的傾向，在溶劑中能自動有十分明顯形成塊狀并粘附在一起的傾向，在溶劑中能自動溶脹成膠。溶脹成膠。 根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠的溶脹性質(zhì)和分離范圍的不同，可根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠的溶脹性質(zhì)和分離范圍的不同，可分成分成1010種類型。各種類型均以英文字母種類型。各種類型均以英文字母P P和阿拉伯數(shù)字表示，和阿拉伯數(shù)字表示，從從Bio-Gel P-2Bio-Gel P-2至至Bio-Ge1

28、P-300Bio-Ge1 P-300。P P后面的阿拉伯數(shù)字乘以后面的阿拉伯數(shù)字乘以10001000即相當于排阻限度（按球蛋白或肽計算）。即相當于排阻限度（按球蛋白或肽計算）。目前，美國目前，美國Bio-Rad LaboratoriesBio-Rad Laboratories生產(chǎn)并出售多種規(guī)格的生產(chǎn)并出售多種規(guī)格的Bio-Gel PBio-Gel P。57聚丙烯酰胺凝膠的性質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠的性質(zhì) 生物凝膠的編號反映出它的分離界限。如Bio-Gel P-100。58( (四四) )、瓊脂糖類凝膠、瓊脂糖類凝膠 （Sepharose ） （一）瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)是由-D-半乳糖與3，6-脫水-L-半乳

29、糖以-1，3-和-1，4-糖苷鍵相間連接而成的鏈狀分子。SepharoseSepharose 瓊脂糖凝膠（agarose gel）可以分離葡聚糖凝膠和生物膠所不能分離的大分子，使凝膠層析的分離區(qū)間擴大到大分子和病毒顆粒，其最大范圍可達相對分子質(zhì)量108，但是由于瓊脂有強烈的吸附作用，給使用造成了困難，后來，從瓊脂中分離出兩個組分，一個組分為帶負電荷的瓊脂果膠，含有磺酸基和羧基；另一組分叫瓊脂糖，它不含有帶電基團，其結(jié)構(gòu)是有-D-吡喃半乳糖和3，6脫水-L-吡喃半乳糖相結(jié)合的鏈狀多糖。這種瓊脂糖被用來進行凝膠層析，它既具有瓊脂凝膠相同的分離區(qū)間，又沒有吸附作用。但其穩(wěn)定性遠不如葡聚糖凝膠和生物膠

30、P，強酸強堿能引起結(jié)構(gòu)破壞。最好使用條件控制在pH 49之間，溫度040，超出此范圍,可能被破壞。61瓊脂糖凝膠特點：瓊脂糖凝膠特點：1、沒有共價鍵的交聯(lián)。2、孔徑依賴于瓊脂糖的濃度。3、瓊脂糖凝膠的化學穩(wěn)定性較差。4、非特異性吸附力低。5、分離范圍大。6、顆粒強度差。 瓊脂糖的商品名稱有: Sepharose(瑞典) Bio-gel A(美國) Segavac(英國) Gelarose(丹麥)等多種，因生產(chǎn)廠家不同名稱各異。 瓊脂糖凝膠是由瓊脂中分離出來的天然凝膠。它的商品名因生產(chǎn)廠家不同而異。 瑞典的商品名稱為Sepharose，有3種型號，即Sepharose 2B，4B和6B（同中國相

31、同）。阿拉伯數(shù)字表示凝膠中干膠的百分含量。 美國的為BioGA，有6個型號，即Bio-G 0.5M，1.5M，5M，15M，50M和150M。阿拉伯數(shù)字乘以106表示排阻限度。 。 英國的稱為Sagavac，又分為Sagavac 2F，4F，6F，8F，10F和2C，4C，6C，8C，10C。前面的阿拉伯數(shù)字表示凝膠中干膠的百分數(shù)，F(xiàn)代表粉末狀，C代表顆粒狀。 丹麥的稱為Gelarose，有5種類型，即2，4，6%，8和10。 瓊脂糖凝膠做成珠狀后不再脫水干燥，否則不能再溶脹恢復原有形狀，因此商品大都以含水狀態(tài)供應，并應在濕態(tài)保存。一般懸浮在l0-3 mo1/L EDTA和0.02%疊氮化鈉溶

32、液中。百分數(shù)表示干膠量。66瓊脂糖凝膠分離范圍瓊脂糖凝膠分離范圍瓊脂糖凝膠有3個規(guī)格：Sepharose2B、4B、6B分別表示瓊脂糖濃度為2%，4%，6%。67 架橋瓊脂糖凝膠為瓊脂線性分子經(jīng)1，3-二溴丙醇交聯(lián)的凝膠。它的凝膠孔徑均勻，機械強度明顯加大。對熱和化學物質(zhì)的穩(wěn)定性大大增加,在pH314范圍內(nèi)穩(wěn)定。 架橋瓊脂糖凝膠（架橋瓊脂糖凝膠（Sepharose CL）68Sepharose CL的性質(zhì)的性質(zhì) 69超膠（超膠（Utro-gel ACA）所謂超膠是瓊脂糖與聚丙烯酰胺的混合凝膠。商品名稱后面的編號為兩位數(shù)，各表示混合膠中聚丙烯酰胺與瓊脂糖的百分濃度。70 Superose系凝膠系

33、凝膠 是由珠狀瓊脂糖經(jīng)兩次交聯(lián)制得的可用于HPLC的高速凝膠過濾介質(zhì)。有6%和12%兩個規(guī)格。71（五五）、多孔玻璃微球、多孔玻璃微球(Bio-glas)特點： 1、化學穩(wěn)定性高、強度大。 2、對糖類、蛋白質(zhì)等物質(zhì)有吸附作用。 3、編號表示其孔徑, 越大，分離分子量也越大。72六、疏水性凝膠（六、疏水性凝膠（hydrophobic gels）常見的有：聚甲基丙烯酸酯凝膠和聚苯乙烯凝膠。Styragel商品, 分離范圍為1 60040 000 000。生物珠（Bio-Bead S），適于分離分子量較小的物質(zhì)。分離不溶水的有機物質(zhì)。73常用的商品化凝膠介質(zhì)常用的商品化凝膠介質(zhì) 74一一五、五、 凝

34、膠層析的凝膠層析的生產(chǎn)生產(chǎn)條件和操作條件和操作 7576凝膠層析的凝膠層析的生產(chǎn)生產(chǎn)條件和操作條件和操作 （一）、凝膠的選擇（一）、凝膠的選擇（二）、凝膠層析柱的設計（二）、凝膠層析柱的設計 （三）、凝膠層析柱的填裝（三）、凝膠層析柱的填裝（四）、（四）、凝膠床的檢查和維護凝膠床的檢查和維護（五）、凝膠層析操作（五）、凝膠層析操作 77（一一）凝膠的選擇凝膠的選擇一、凝膠的選擇 選擇適宜的凝膠是取得良好分離效果的最根本的保證。選取何種凝膠及其型號、粒度，一方面要考慮凝膠的性質(zhì)，包括凝膠的分離范圍（滲入限與排阻限）還有它的理化穩(wěn)定性、強度、非特異吸附性質(zhì)等；另一方面還要注意到分離目的和樣品的性質(zhì)

35、。 凝膠粒度的大小對分離效果有直接的影響。般來說，細粒凝膠柱流速低，但洗脫峰窄，分辨率高，多用于精制分離或分析等。粗粒凝膠柱流速高，但洗脫峰平坦，分辨率低，多用于粗制分離，脫鹽等。下圖表示在同一流速下不同粒度的Sephadex G-25柱的洗脫效果。 凝膠粒度與洗脫效果的關系圖凝膠粒度與洗脫效果的關系圖 對生物樣品來說，經(jīng)常遇到的是兩種分離形式。一種是只將分子量極為懸殊的兩類物質(zhì)分開，如蛋白質(zhì)與鹽類，稱作類分離或組分離。另一類則是要將分子量相差不很大的大分子物質(zhì)加以分離，如分離血清球蛋白與白蛋白，這叫做分級分離。后者對實驗條件和操作要求都比較高。下面以最常用的葡聚糖凝膠類為例，分別加以討論 。

36、 80將分子量極為懸殊的兩類物質(zhì)分開，如蛋白質(zhì)與鹽類，稱作類分離或組分離。將分子量相差不大的大分子物質(zhì)加以分離，如分離血清球蛋白與白蛋白，這叫做分級分離。1 1類分離類分離 目的是分開樣品中分子量懸殊的“較大分子組”和“較小分子組”兩類物質(zhì)，并不要求分離分子量相近的組分。 選擇凝膠時，應使樣品中大分子組的分子量大于其排阻限，而小分子組的分子量小于滲入限。也就是說大分子的分配系數(shù)Kd= 0，小分子的Kd1。這樣能取得最好的分離效果。例如從蛋白質(zhì)溶液中除去無機鹽。我們知道，蛋白質(zhì)的分子量都大于5000D，而無機鹽的分子量一般在幾十到幾百之間。所以常選用Sephadex G-25凝膠作為分離固定相，

37、因為它的分離范圍是10005000D。被分離的兩組物質(zhì)的分子量正好落在分離范圍的兩側(cè)。大分子組為全排阻，而小分子組為全滲入，其Kd值的差可達最大值1。對于分子量小于5000D的肽類進行脫鹽操作則常選用Sephadex G-15凝膠。83（1）使大分子的分配系數(shù)Kd=0；（2）小分子的Kd=1。選用Sephadex G-25凝膠，分離范圍1 0005 000。2 2分級分離分級分離 目的是分開分子量不很懸殊的大分子物質(zhì)。選擇凝膠型號時必須使各種物質(zhì)的Kd值盡可能相差大一些。為此，首先決不能使它們的分子量都分布在凝膠分離范圍的一側(cè)，也就是Kd不要都接近于0或1，而要使組分的分子量盡可能分布在凝膠分

38、離范圍的兩側(cè)，或接近兩側(cè)的位置。如果樣品中含有3個組分的話，最好一個接近全排阻，另一個接近全滲入，第三個為部分滲入，且分子量大于滲入限的3倍，并小于排阻限的13。因為分子量如與滲入限比較靠近，該組分分子在凝膠顆粒中運動所受的約束很小，不易與低分子組分分開。如分子量與排阻限比較靠近則不易與高分子組分分開。如用Sephadex G-200分離血清蛋白質(zhì)的效果要比Sephadex G-150為好。但也有人選用G-150，那是因為G-200強度太低不便操作的緣故（見下圖）。 不同分離范圍的葡聚糖凝膠上，血清蛋白的層析圖不同分離范圍的葡聚糖凝膠上，血清蛋白的層析圖87（1）使各種物質(zhì)的Kd值盡可能相差大

39、。（2）不使分子量分布在凝膠分離范圍的一側(cè)。（3）分子量大于滲入限的3倍，并小于排阻限的1/3。如用Sephadex G-200分離血清蛋白質(zhì)的效果要比Sephadex G-150為好。88二、二、凝膠粒度的選擇凝膠粒度的選擇細粒凝膠柱流速低，洗脫峰窄，分辨率高，用于精制分離或分析。粗粒凝膠柱流速高，洗脫峰平坦，分辨率低，用于粗制分離，脫鹽。 凝膠顆粒大小一般分為粗、中、細和超細四類。顆粒越細，分離效果越好，因為它容易達到平衡，但流速慢。顆粒越粗，流速越快，會使區(qū)帶擴散，使洗脫峰變平變寬。在一般柱層析中，使用干顆粒直徑在70m左右較合適。對于在水中保存的凝膠如瓊脂粉凝膠顆粒直徑應在150m左右

40、。凝膠顆粒大小要均勻，這樣流速穩(wěn)定，效果較好。 產(chǎn)品名稱：瓊脂糖凝膠 4FF英文名稱：Sepharose 4FF性 狀：白色微球, 無嗅、無味凝膠類型：凝膠層析介質(zhì)；快流速，物理與化學性質(zhì)穩(wěn)定。產(chǎn)品基質(zhì)：4瓊脂糖粒 徑：45-165m工作PH值：3-13操作溫度：4-40 分離范圍：70,000-20 106保存條件：4-8應 用：巨大分子，病毒，疫苗的分離純化等包 裝：10升/桶瓊脂糖凝膠 4FF，大大加強了機械性能，流速特快，適合工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。經(jīng)去電荷處理，非特異性吸附極低，提高回收率。極高的化學穩(wěn)定性，可用多種促溶劑、有機溶劑工作及0.1-0.5M NaOH 在位清洗 凝膠過濾分離總覽凝

41、膠過濾分離總覽93 （二二）、凝膠層析柱的設計、凝膠層析柱的設計 1、層析柱2、蠕動泵3、檢測儀4、工作站95 1 1、層析柱層析柱層析柱長度與直徑的比值稱作“柱比”。對于類分離，柱床體積一般為樣品溶液體積的5倍，柱比5:1到10:1即可。對于分級分離，則要求柱床體積大于樣品體積25倍以上，至多達100倍。柱比在25至100之間。BPG層析柱通用電氣公司 （英語：General Electric Company, GE，NYSE：GE）是美國一家提供技術和服務業(yè)務的跨國公司。BPGBPG層析柱層析柱BPGBPG層析柱層析柱蠕動泵蠕動泵英國Watson-Marlow公司是斯派莎克集團的下屬公司沃

42、森馬洛生產(chǎn)。工作原理：通過對泵的彈性輸送軟管交替進行擠壓和釋放來泵送流體。檢測儀檢測儀1、紫外檢測儀是液相色譜中的一種紫外裝置，儀器配上層析柱，恒流泵，部分收集器等，即組成一完整的液相色譜分離分析裝置。2、紫外檢測儀波長：280nm和215nm。檢測儀檢測儀3、儀器工作原理的依據(jù)是光吸收定律。從光源發(fā)出的光經(jīng)狹縫、濾光片、樣品池到光電培增管上，使束由于樣品濃度不同所引起光強的變化轉(zhuǎn)換成光電流的變化，此光電流經(jīng)放大器輸入到對數(shù)轉(zhuǎn)換器，使透光率T轉(zhuǎn)成A輸出，即A=1g =CL式中為待測樣品的克分子消光系統(tǒng)，C為樣品濃度，采用克分子/升單位，L為光程，用厘米作單位。根據(jù)上式就知測出了A，就知樣品濃度

43、C。若從放大器直接輸入記錄儀，繪出的是樣品透光率T變化的圖譜，若從對數(shù)轉(zhuǎn)換器輸入到記錄儀繪出的是樣品光密度A變化的圖譜。檢測儀檢測儀4、蛋白質(zhì)分子中所含的酪氨酸和色氨酸殘基使蛋白質(zhì)在下具有最大吸收值。5、CPS在206nm有吸收、一般在外水體積有吸收。 6、蛋白質(zhì)的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收測定時，可用215nm來測定。工作站工作站從紫外檢測儀對數(shù)轉(zhuǎn)換器輸入到記錄儀（電腦）繪出樣品光密度A變化的圖譜。工作站工作站mAU是任意毫吸光度，一般儀器自帶的工作站處理軟件都傾向于使用這個單位，而mV則是儀器后方有塊數(shù)據(jù)傳出板，如果使用其他的工作站軟件，需要從這塊板子上引出兩根數(shù)據(jù)線，通過數(shù)據(jù)線傳遞的電信號轉(zhuǎn)化成數(shù)字信號，這也就色譜圖上縱坐標mV的來源。AU= 吸光度單位 = Absorbance Uint1AU=1000mv=1V1AU=1000mv工作站工作站106（三三）凝膠）凝膠層析柱層析柱的裝填的裝填1、凝膠的預處理2、凝膠填裝3、不斷攪拌下使膠粒均勻沉降，使不發(fā)生凝膠分層和膠面傾