復(fù)件微生物檢測第5章2

1、第二節(jié)第二節(jié) 沙門菌檢查法沙門菌檢查法n美國細(xì)菌學(xué)家美國細(xì)菌學(xué)家salmonsalmon與與smithsmith于于18851885年分離出豬霍亂年分離出豬霍亂沙門菌。沙門菌。19901990年為紀(jì)念年為紀(jì)念salmonsalmon，定名這類細(xì)菌為沙定名這類細(xì)菌為沙門菌屬。門菌屬。n沙門菌是腸桿菌科的重要致病菌。包括傷寒、副傷沙門菌是腸桿菌科的重要致病菌。包括傷寒、副傷寒甲、乙、丙型，腸炎，鼠傷寒等沙門菌，現(xiàn)今已寒甲、乙、丙型，腸炎，鼠傷寒等沙門菌，現(xiàn)今已發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)2 2324324個血清型。個血清型。n在世界各地的食物中毒中，沙門菌食物中毒常占首在世界各地的食物中毒中，沙門菌食物中毒常占首位或

2、第二位。規(guī)定在藥品和食品中不得檢出沙門菌。位或第二位。規(guī)定在藥品和食品中不得檢出沙門菌。美國每年報道病例美國每年報道病例45 00045 000個左右，實際數(shù)量可能多個左右，實際數(shù)量可能多達(dá)達(dá)200-300200-300萬。傷寒每年萬。傷寒每年400-500400-500例。例。一、生物學(xué)特性一、生物學(xué)特性1 1. .形態(tài)形態(tài) 兩端鈍圓的革蘭氏陰性桿菌，兩端鈍圓的革蘭氏陰性桿菌，（0.4-0.90.4-0.9）m m (1-3)(1-3)m m，無無芽孢，周生鞭毛，一般無莢膜，芽孢，周生鞭毛，一般無莢膜，少數(shù)有包膜。少數(shù)有包膜。 光滑型的細(xì)菌大小均勻，粗光滑型的細(xì)菌大小均勻，粗糙型則大小不一，

3、長短不一。糙型則大小不一，長短不一。2 2. . 培養(yǎng)特性培養(yǎng)特性n在營養(yǎng)瓊脂平板上在營養(yǎng)瓊脂平板上18-2418-24h h培養(yǎng)形成無色半透明，表培養(yǎng)形成無色半透明，表面面光滑、濕潤、隆起光滑、濕潤、隆起的菌落，直徑的菌落，直徑2-32-3mmmm。有些菌株有些菌株在營養(yǎng)瓊脂平板上生長不良，形成在營養(yǎng)瓊脂平板上生長不良，形成 “ “侏儒侏儒”菌落，菌落，加葡萄糖或甘油，生長良好，但易使菌株粗糙加葡萄糖或甘油，生長良好，但易使菌株粗糙, , 呈呈干燥、無光澤、邊緣不整齊干燥、無光澤、邊緣不整齊。n光滑型菌在肉湯中無菌膜、無沉淀；粗糙型則產(chǎn)生光滑型菌在肉湯中無菌膜、無沉淀；粗糙型則產(chǎn)生沉淀，上層

4、液透明。沉淀，上層液透明。n生長溫度在生長溫度在10-4210-42，最適，最適3838；ph4.5-9ph4.5-9，最適最適phph6.8-7.86.8-7.8；需氧或兼性厭氧。；需氧或兼性厭氧。3 3. . 生化特性生化特性n靛基質(zhì)靛基質(zhì)- -，甲基紅，甲基紅+ +，v-p -v-p -，檸檬酸鹽反檸檬酸鹽反應(yīng)應(yīng)d d，產(chǎn)硫化氫，尿素酶反應(yīng)產(chǎn)硫化氫，尿素酶反應(yīng)- -，還原硝，還原硝酸鹽，酸鹽， - -葡萄糖醛酸苷酶葡萄糖醛酸苷酶d d，不能發(fā)酵不能發(fā)酵乳糖，可以被噬菌體裂解。乳糖，可以被噬菌體裂解。4 4. . 抗原結(jié)構(gòu)抗原結(jié)構(gòu)（1 1）抗原構(gòu)造）抗原構(gòu)造n菌體抗原（菌體抗原（o o）：

5、不被乙醇、不被乙醇、0.1%0.1%石炭酸所破石炭酸所破壞。與特異性抗血清呈顆粒狀凝集，形成慢，壞。與特異性抗血清呈顆粒狀凝集，形成慢，不易搖散?，F(xiàn)已知有不易搖散?，F(xiàn)已知有5050多種，多數(shù)沙門菌含有多種，多數(shù)沙門菌含有兩種以上的兩種以上的o o抗原，有的抗原，有的o o抗原是一種菌獨有的，抗原是一種菌獨有的，有的是幾種菌共有的，凡含有共同特異性抗原有的是幾種菌共有的，凡含有共同特異性抗原成分的血清型歸為一個群，可將沙門菌化分為成分的血清型歸為一個群，可將沙門菌化分為4242群，按群，按a-za-z排列，排列，z z以后的順序以以后的順序以o o5151-o-o6767表示。表示。引起人類沙門

6、菌病的引起人類沙門菌病的95%95%以上都在以上都在a-f 6a-f 6個群內(nèi)。個群內(nèi)。n表面抗原（表面抗原（k k抗原）：沙門菌中有三種抗原）：沙門菌中有三種k k抗原，抗原，即即vivi抗原、抗原、m m抗原和抗原和5 5抗原?？乖?。q可阻止可阻止o o抗原被抗抗原被抗o o血清所凝集，具有血清所凝集，具有o o不凝集不凝集性。常用于菌型鑒定。性。常用于菌型鑒定。qm m抗原：粘液抗原，在菌型鑒定上無特殊意義。抗原：粘液抗原，在菌型鑒定上無特殊意義。q5 5抗原：抗原：n鞭毛抗原（鞭毛抗原（h h抗原）：經(jīng)乙醇或酸抗原）：經(jīng)乙醇或酸處理后失去與特異性抗體的結(jié)合處理后失去與特異性抗體的結(jié)合力

7、。制備時，應(yīng)用具有豐滿鞭毛力。制備時，應(yīng)用具有豐滿鞭毛的菌種的菌種18-2418-24h h的培養(yǎng)物，加甲醛的培養(yǎng)物，加甲醛固定或固定或6060以下加熱后即成以下加熱后即成h h抗原。抗原。h h抗原與抗抗原與抗h h血清血清562562h h后，可出后，可出現(xiàn)疏松易于搖散的絮狀凝集。現(xiàn)疏松易于搖散的絮狀凝集。 沙門菌的沙門菌的h h抗原有兩相，特異性高的抗原有兩相，特異性高的稱為第稱為第1 1相（特異相）抗原；特異性低的相（特異相）抗原；特異性低的稱為第稱為第2 2相（非特異相）抗原；多數(shù)沙門相（非特異相）抗原；多數(shù)沙門菌同一菌株，常可分離出兩種菌同一菌株，常可分離出兩種h h抗原的菌抗原的

8、菌落，菌落的外觀性狀完全一樣，但與相落，菌落的外觀性狀完全一樣，但與相應(yīng)抗體作凝集反應(yīng)時則明顯不同。具有應(yīng)抗體作凝集反應(yīng)時則明顯不同。具有兩相抗原的稱為雙相菌，僅有一相抗原兩相抗原的稱為雙相菌，僅有一相抗原的則稱為單相菌。的則稱為單相菌。（2 2）抗原變異）抗原變異smooth-transient-roughsmooth-transient-rough變異：為避免變異：為避免r r型的出現(xiàn)，型的出現(xiàn)，保存培養(yǎng)基內(nèi)不應(yīng)含有糖類，不要多次移種傳代。保存培養(yǎng)基內(nèi)不應(yīng)含有糖類，不要多次移種傳代。v-wv-w（vi-ovi-o）變異：具有變異：具有vivi抗原的菌株稱為抗原的菌株稱為v v型菌，型菌，失

9、去失去vivi抗原的菌株稱為抗原的菌株稱為w w型菌。型菌。w w型菌只能同其相應(yīng)型菌只能同其相應(yīng)的的o o型血清發(fā)生凝集，而不與型血清發(fā)生凝集，而不與vivi血清凝集。血清凝集。ho-oho-o變異：有鞭毛抗原的變異：有鞭毛抗原的hoho型菌變?yōu)闊o鞭毛的型菌變?yōu)闊o鞭毛的o o型菌。型菌。位相變異：有雙相鞭毛抗原的沙門菌兩個相可以互位相變異：有雙相鞭毛抗原的沙門菌兩個相可以互變。通常在一個培養(yǎng)物內(nèi)二相并存，在平板上各占變。通常在一個培養(yǎng)物內(nèi)二相并存，在平板上各占半數(shù)，但挑取單菌落，經(jīng)多次移接后，又出現(xiàn)兩相半數(shù)，但挑取單菌落，經(jīng)多次移接后，又出現(xiàn)兩相各半現(xiàn)象，這種由一相變?yōu)榱硪幌嗟淖儺?，稱為位各

10、半現(xiàn)象，這種由一相變?yōu)榱硪幌嗟淖儺?，稱為位相變異，單相菌不產(chǎn)生位相變異。相變異，單相菌不產(chǎn)生位相變異。5、 發(fā)病機(jī)理和癥狀發(fā)病機(jī)理和癥狀n菌量大菌量大n活菌和菌體內(nèi)毒素協(xié)同作用活菌和菌體內(nèi)毒素協(xié)同作用n小腸和結(jié)腸里繁殖，侵入粘膜小腸和結(jié)腸里繁殖，侵入粘膜 ，由淋巴，由淋巴系統(tǒng)進(jìn)入血液系統(tǒng)進(jìn)入血液n潛伏期潛伏期8-48hn急性期，每克糞便中沙門菌多至急性期，每克糞便中沙門菌多至10億個億個食物中毒的特征性癥狀食物中毒的特征性癥狀n腹瀉腹瀉n惡心惡心n腹痛腹痛n低燒低燒和寒顫寒顫n有時嘔吐嘔吐、頭痛頭痛、倦怠倦怠傷寒的典型癥狀傷寒的典型癥狀n持續(xù)發(fā)熱發(fā)熱39-40n昏睡昏睡癥n劇烈腹痛腹痛（腹部痙

11、攣痙攣）n頭痛頭痛n食欲不振n出現(xiàn)扁平的玫瑰紅色點狀紅疹紅疹（一）（一） 檢驗程序檢驗程序供試品供試品供試液供試液預(yù)增菌預(yù)增菌增菌增菌dhls.sembembmaccmacctsi（三糖鐵瓊脂）三糖鐵瓊脂）氰化鉀氰化鉀賴氨酸脫羧酶試驗賴氨酸脫羧酶試驗?zāi)蛩孛冈囼災(zāi)蛩孛冈囼炦胚嵩囼炦胚嵩囼炑鍖W(xué)試驗血清學(xué)試驗半固體營養(yǎng)瓊脂半固體營養(yǎng)瓊脂革蘭染色、鏡檢革蘭染色、鏡檢報報告告二、沙門菌常規(guī)檢查法二、沙門菌常規(guī)檢查法1.1.預(yù)增菌預(yù)增菌: :u將供試液接種在無選擇性增菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將供試液接種在無選擇性增菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使受損傷的細(xì)菌得以修復(fù)，然后再轉(zhuǎn)接至增菌使受損傷的細(xì)菌得以修復(fù)，然后再轉(zhuǎn)接至增菌培

12、養(yǎng)基中。培養(yǎng)基中。u一般在營養(yǎng)肉湯中。但美、英、日、歐均選用一般在營養(yǎng)肉湯中。但美、英、日、歐均選用乳糖肉湯作預(yù)增菌液。以乳糖肉湯作預(yù)增菌液。以1 1：1010的比例接種，的比例接種，18-2418-24h,35-37h,35-37。預(yù)增菌培養(yǎng)基的選擇預(yù)增菌培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)基商品商品緩沖蛋白胨水（緩沖蛋白胨水（bpw）使用于所有商品使用于所有商品bpw+酪蛋白酪蛋白巧克力巧克力乳糖肉湯乳糖肉湯蛋和蛋制品，火腿，蛋和蛋制品，火腿，ph6的著的著色食品色食品乳糖肉湯乳糖肉湯+表面活性劑表面活性劑7或曲拉通或曲拉通x-100椰肉，肉，干燥或加工過的動椰肉，肉，干燥或加工過的動物食品物食品乳糖肉

13、湯乳糖肉湯+ 0.5%凝膠酶凝膠酶凝膠凝膠脫脂乳脫脂乳+亮綠亮綠巧克力，糖，糖衣巧克力，糖，糖衣胰蛋白胨大豆肉湯胰蛋白胨大豆肉湯香料、香草、干酵母香料、香草、干酵母胰蛋白胨大豆肉湯胰蛋白胨大豆肉湯+ 0.5%硫酸鉀硫酸鉀洋蔥和蒜粉等洋蔥和蒜粉等水水+亮綠亮綠奶粉奶粉2.選擇性增菌選擇性增菌n取取1 1mlml預(yù)增菌液轉(zhuǎn)種至增菌培養(yǎng)基預(yù)增菌液轉(zhuǎn)種至增菌培養(yǎng)基1010mlml。37372424h h，培養(yǎng)基可采用亞硒酸鹽胱氨酸培養(yǎng)基可采用亞硒酸鹽胱氨酸肉湯培養(yǎng)基或四硫磺酸鹽煌綠肉湯培養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或四硫磺酸鹽煌綠肉湯培養(yǎng)基，我國與英國相同采用后者。美、日基，我國與英國相同采用后者。美、日采用二者聯(lián)用

14、有助于提高沙門菌的檢出采用二者聯(lián)用有助于提高沙門菌的檢出率。率。轉(zhuǎn)接到選擇性轉(zhuǎn)接到選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)基免疫免疫 磁性分離技術(shù)磁性分離技術(shù)（immunomagnetic separation，ims）3.分離培養(yǎng)分離培養(yǎng)選擇性培養(yǎng)基：選擇性培養(yǎng)基：ndhldhl：無色半透明，產(chǎn)硫化氫的菌落中心黑色無色半透明，產(chǎn)硫化氫的菌落中心黑色或全黑，乳糖陽性菌株粉紅色、中心黑色或全黑，乳糖陽性菌株粉紅色、中心黑色nhehe：藍(lán)綠或藍(lán)色，產(chǎn)硫化氫的菌落中心黑色藍(lán)綠或藍(lán)色，產(chǎn)硫化氫的菌落中心黑色或全黑，乳糖陽性菌株黃色、中心黑色或全黑，乳糖陽性菌株黃色、中心黑色nssss：無色半透明，產(chǎn)硫化氫的菌落中心黑色無色半

15、透明，產(chǎn)硫化氫的菌落中心黑色或全黑，乳糖陽性菌株粉紅色、中心黑色或全黑，乳糖陽性菌株粉紅色、中心黑色n分離沙門菌應(yīng)以出現(xiàn)分離沙門菌應(yīng)以出現(xiàn)單個菌落單個菌落為準(zhǔn)，否則應(yīng)重為準(zhǔn)，否則應(yīng)重新分離。新分離。n由于平板用前未烘干，或因分離不良菌落連片由于平板用前未烘干，或因分離不良菌落連片均須重新分離。均須重新分離。n致病菌菌落一般在經(jīng)致病菌菌落一般在經(jīng)36243624h h培養(yǎng)后，再放置培養(yǎng)后，再放置室溫室溫2-32-3天后不發(fā)生變化，而非致病菌則繼續(xù)天后不發(fā)生變化，而非致病菌則繼續(xù)增生、增厚，并帶黃灰色，并產(chǎn)生臭味。增生、增厚，并帶黃灰色，并產(chǎn)生臭味。n對可疑菌落可放置室溫觀察幾天，再決定取舍對可疑

16、菌落可放置室溫觀察幾天，再決定取舍(1)(1)初步鑒別試驗：初步鑒別試驗：三糖鐵瓊脂三糖鐵瓊脂 |乳糖乳糖:蔗糖蔗糖:葡萄糖葡萄糖=10 : 10 : 1|以酚紅作指示劑以酚紅作指示劑|當(dāng)待檢菌發(fā)酵乳糖或蔗糖時，產(chǎn)酸量多，使整個培養(yǎng)基均呈黃色；當(dāng)待檢菌發(fā)酵乳糖或蔗糖時，產(chǎn)酸量多，使整個培養(yǎng)基均呈黃色；如僅發(fā)酵葡萄糖，則產(chǎn)酸少，斜面由于細(xì)菌生長分解蛋白胨而釋如僅發(fā)酵葡萄糖，則產(chǎn)酸少，斜面由于細(xì)菌生長分解蛋白胨而釋放氨，酚紅顯堿性紅色、而底層黃色放氨，酚紅顯堿性紅色、而底層黃色|細(xì)菌對培養(yǎng)基中硫代硫酸鈉或硫酸鈉、亞硫酸鈉的還原作用，生細(xì)菌對培養(yǎng)基中硫代硫酸鈉或硫酸鈉、亞硫酸鈉的還原作用，生成硫化氫

17、。硫化氫遇硫酸亞鐵或檸檬酸鐵銨產(chǎn)生不溶性黑色硫化成硫化氫。硫化氫遇硫酸亞鐵或檸檬酸鐵銨產(chǎn)生不溶性黑色硫化亞鐵。亞鐵。4.生化試驗生化試驗斜面紅色、底層黃色，出現(xiàn)部分黑色或全部黑色斜面紅色、底層黃色，出現(xiàn)部分黑色或全部黑色斜面紅色、底層黃色，無黑色斜面紅色、底層黃色，無黑色斜面、底層均黃色，出現(xiàn)部分黑色或全部黑色斜面、底層均黃色，出現(xiàn)部分黑色或全部黑色 除沙門菌外，變形桿菌、檸檬酸鹽菌、志賀菌等也可除沙門菌外，變形桿菌、檸檬酸鹽菌、志賀菌等也可出現(xiàn)上述反應(yīng)。出現(xiàn)上述反應(yīng)。n 吲哚試驗：陰性吲哚試驗：陰性n志賀氏菌都能分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，大多不發(fā)酵乳糖，不產(chǎn)志賀氏菌都能分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，

18、大多不發(fā)酵乳糖，不產(chǎn)生生h h2 2s s。n大腸桿菌，能分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，大多數(shù)能分解乳糖，不產(chǎn)生大腸桿菌，能分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，大多數(shù)能分解乳糖，不產(chǎn)生h h2 2s s 。n沙門氏菌，能分解葡萄糖，不發(fā)酵乳糖、蔗糖，大多數(shù)產(chǎn)生沙門氏菌，能分解葡萄糖，不發(fā)酵乳糖、蔗糖，大多數(shù)產(chǎn)生h h2 2s s ，多數(shù)產(chǎn)氣。多數(shù)產(chǎn)氣。n下面照片所示下面照片所示2-3-42-3-4，可能是大腸桿菌、沙門氏菌還是志賀氏菌？，可能是大腸桿菌、沙門氏菌還是志賀氏菌？賴氨酸脫羧酶試驗賴氨酸脫羧酶試驗純培養(yǎng)菌落純培養(yǎng)菌落賴氨酸脫羧酶賴氨酸脫羧酶 產(chǎn)酸產(chǎn)酸含糖蛋白胨培養(yǎng)基含糖蛋白胨培養(yǎng)基溴甲酚紫溴甲酚紫產(chǎn)堿產(chǎn)堿(尸

19、胺尸胺) co2對照為黃色,陽性為紫色培養(yǎng)時間不超過四天傷寒和雞沙門菌除外，均為陽性含糖蛋白胨培養(yǎng)基含糖蛋白胨培養(yǎng)基紫色紫色(3)尿素酶試驗?zāi)蛩孛冈囼瀗區(qū)別變形桿菌區(qū)別變形桿菌n具有尿素酶的細(xì)菌分解培養(yǎng)基中的尿具有尿素酶的細(xì)菌分解培養(yǎng)基中的尿素，產(chǎn)生氨，培養(yǎng)基堿性，使酚紅變素，產(chǎn)生氨，培養(yǎng)基堿性，使酚紅變紅。沙門菌反應(yīng)紅。沙門菌反應(yīng)陰性陰性 注意注意：用無尿素的培養(yǎng)基作對照：用無尿素的培養(yǎng)基作對照 (4)氰化鉀試驗氰化鉀試驗n沙門菌、志賀菌和埃希菌的沙門菌、志賀菌和埃希菌的生長受生長受kcn抑制。抑制。nkcn 濃度為濃度為1：13300或或1：10000。n沙門菌此反應(yīng)沙門菌此反應(yīng)陰性陰性。

20、待檢菌新鮮培養(yǎng)物待檢菌新鮮培養(yǎng)物kcn培養(yǎng)基培養(yǎng)基3648h不生長不生長鐵卟啉鐵卟啉呼吸酶失活呼吸酶失活注意注意：u氰化鉀的濃度氰化鉀的濃度u控制接種量控制接種量u試管封口嚴(yán)密試管封口嚴(yán)密u操作謹(jǐn)慎操作謹(jǐn)慎u用后的培養(yǎng)管加硫酸亞鐵和氫用后的培養(yǎng)管加硫酸亞鐵和氫氧化鉀去毒氧化鉀去毒u對照不加對照不加 kcn（5）動力檢查）動力檢查l沙門菌周生鞭毛，能運動。沙門菌周生鞭毛，能運動。l豬霍亂沙門氏菌（豬霍亂沙門氏菌（s.gallinarums.gallinarum）和雞白痢沙門氏）和雞白痢沙門氏菌（菌（ s.pullorums.pullorum）沒有運動性）沒有運動性5.血清學(xué)凝集試驗血清學(xué)凝集試驗

21、（1 1）沙門菌屬診斷血清）沙門菌屬診斷血清診斷血清規(guī)格：診斷血清規(guī)格：1010種種1 1套套：主要供傷寒、副傷寒沙門菌初步：主要供傷寒、副傷寒沙門菌初步診斷用。包括診斷用。包括vivi及及a-fa-f群多價血清各群多價血清各1 1種；種；o o因子血清因子血清4 4種；種；h h 因子血清因子血清4 4種種2626種種1 1套套：主要供沙門菌常見菌型定群和初：主要供沙門菌常見菌型定群和初步定型用。包括步定型用。包括vivi及及a-fa-f群多價血清各群多價血清各1 1種；種；o o因子血清因子血清9 9種；種；h h 因子血清因子血清1515種種5757種種1 1套套：主要供沙門菌常見菌型定

22、型用。：主要供沙門菌常見菌型定型用。包括包括vivi及及a-fa-f群多價血清各群多價血清各1 1種；種；o o因子血因子血清清1616種；種； o o復(fù)合因子血清各復(fù)合因子血清各1 1種；種；h h 因子因子血清血清3131種；種； h h復(fù)合因子血清復(fù)合因子血清3 3種種144144種全套種全套：供各型沙門菌診斷用。包括診供各型沙門菌診斷用。包括診斷各型沙門菌用的各種多價斷各型沙門菌用的各種多價o o、多價多價h h血血清和單因子及復(fù)合因子血清清和單因子及復(fù)合因子血清 群別群別菌種名稱菌種名稱o抗原成分抗原成分a甲型副傷寒杜雷佐變種甲型副傷寒杜雷佐變種(s. para typhi a)2,

23、12b里丁沙門菌里丁沙門菌(s. reading)4,12c1豬霍亂沙門菌豬霍亂沙門菌1350(s. cholerae-suis)6,7c2新港新港(紐波特紐波特)沙門菌沙門菌(s. newport)6,8d1傷寒沙門菌傷寒沙門菌0901(s. typhi)9,12e倫敦沙門菌倫敦沙門菌(s. london)3,10f阿伯丁沙門菌阿伯丁沙門菌 (s. aberdeen)11a-f群o多價血清的代表菌株n根據(jù)沙門菌菌型調(diào)查結(jié)果，根據(jù)沙門菌菌型調(diào)查結(jié)果，95%95%以上的沙門菌都屬于以上的沙門菌都屬于a-fa-f六六個個o o群，群，常見菌型不過常見菌型不過2020個左右，因此沙門菌檢驗，主要是個

24、左右，因此沙門菌檢驗，主要是對對a-fa-f群沙門菌做出初步鑒定。按常規(guī)方法選用群沙門菌做出初步鑒定。按常規(guī)方法選用a-fa-f群多價群多價o o血清。血清。凝集試驗方法凝集試驗方法n二者比例適當(dāng)，菌量過多過二者比例適當(dāng)，菌量過多過少均不易觀察到正確結(jié)果。少均不易觀察到正確結(jié)果。n 陽性反應(yīng)通常在陽性反應(yīng)通常在3 3minmin內(nèi)發(fā)生。內(nèi)發(fā)生。n血清效價低反應(yīng)遲緩時，應(yīng)血清效價低反應(yīng)遲緩時，應(yīng)將玻片置培養(yǎng)皿內(nèi)，放一個將玻片置培養(yǎng)皿內(nèi)，放一個濕棉球，蓋上皿蓋，經(jīng)約濕棉球，蓋上皿蓋，經(jīng)約2020minmin再觀察結(jié)果。再觀察結(jié)果。n出現(xiàn)凝集現(xiàn)象的待檢菌培養(yǎng)出現(xiàn)凝集現(xiàn)象的待檢菌培養(yǎng)物，應(yīng)以滅菌的生理

25、鹽水溶物，應(yīng)以滅菌的生理鹽水溶液代替液代替a-fa-f多價多價o o血清，與培血清，與培養(yǎng)物混勻做對照試驗，對照養(yǎng)物混勻做對照試驗，對照應(yīng)無凝集現(xiàn)象，方可判為陽應(yīng)無凝集現(xiàn)象，方可判為陽性反應(yīng)。性反應(yīng)。a-f多價多價o血清血清稀釋稀釋接種環(huán)沾取接種環(huán)沾取2-3環(huán)環(huán)1.5cm0.5cm條形涂抹條形涂抹待檢菌待檢菌36 18-24h接種環(huán)刮取少許接種環(huán)刮取少許混勻 待檢菌在生理鹽水溶液中產(chǎn)生凝集，稱待檢菌在生理鹽水溶液中產(chǎn)生凝集，稱自家凝集現(xiàn)象，這種現(xiàn)象多為自家凝集現(xiàn)象，這種現(xiàn)象多為s-rs-r所致。所致。 當(dāng)當(dāng)a-fa-f多價多價o o血清凝集試驗為陰性時，還血清凝集試驗為陰性時，還應(yīng)當(dāng)考慮是否因

26、為待檢菌含有應(yīng)當(dāng)考慮是否因為待檢菌含有vivi抗原所致?？乖隆?、結(jié)果判斷及報告、結(jié)果判斷及報告（1）生化試驗符合沙門菌屬反應(yīng)，沙門菌屬）生化試驗符合沙門菌屬反應(yīng)，沙門菌屬a-f多價多價o血清凝集試驗陽性反應(yīng)，做出供試品檢出沙門菌血清凝集試驗陽性反應(yīng)，做出供試品檢出沙門菌報告。報告。（2）生化試驗不符合沙門菌屬反應(yīng)，沙門菌屬）生化試驗不符合沙門菌屬反應(yīng)，沙門菌屬a-f多多價價o血清凝集試驗陰性反應(yīng)，做出供試品未檢出沙血清凝集試驗陰性反應(yīng)，做出供試品未檢出沙門菌報告。門菌報告。（3）生化試驗符合沙門菌屬反應(yīng)，沙門菌屬）生化試驗符合沙門菌屬反應(yīng)，沙門菌屬a-f多價多價o血清凝集試驗陰性反應(yīng)；或

27、生化試驗不符合沙門血清凝集試驗陰性反應(yīng)；或生化試驗不符合沙門菌屬反應(yīng)，沙門菌屬菌屬反應(yīng)，沙門菌屬a-f多價多價o血清凝集試驗陽性血清凝集試驗陽性反應(yīng)；均應(yīng)進(jìn)一步鑒定后再做結(jié)論報告。反應(yīng)；均應(yīng)進(jìn)一步鑒定后再做結(jié)論報告。n對于疑似菌株或須進(jìn)一步鑒定的菌株，根據(jù)待對于疑似菌株或須進(jìn)一步鑒定的菌株，根據(jù)待檢菌已測試的特性，可選擇增添一些必要的生檢菌已測試的特性，可選擇增添一些必要的生化試驗?；囼?。糖醇發(fā)酵試驗糖醇發(fā)酵試驗明膠液化試驗明膠液化試驗硝酸鹽還原試驗硝酸鹽還原試驗甲基紅試驗甲基紅試驗vpvp試驗試驗檸檬酸鹽利用試驗檸檬酸鹽利用試驗半乳糖苷酶試驗半乳糖苷酶試驗苯丙氨酸脫氨酶試驗苯丙氨酸脫氨酶試

28、驗丙二酸鈉試驗丙二酸鈉試驗有機(jī)酸鹽利用試驗有機(jī)酸鹽利用試驗甘油品紅試驗甘油品紅試驗明膠液化試驗明膠液化試驗被膠原酶分解被膠原酶分解判斷結(jié)果前，冰箱冷卻。判斷結(jié)果前，冰箱冷卻。明膠的用量與質(zhì)量明膠的用量與質(zhì)量腸桿菌科一般為陰性反應(yīng)腸桿菌科一般為陰性反應(yīng)假單胞菌一般為陽性假單胞菌一般為陽性硝酸鹽還原試驗硝酸鹽還原試驗待檢菌硝酸鹽瓊脂斜面30s培養(yǎng)物培養(yǎng)物-萘胺1ml對氨基苯磺酸1ml陽性3618-24h陰性亞硝酸鹽存在u硝酸鹽沒有被還原（真陰性反應(yīng)）硝酸鹽沒有被還原（真陰性反應(yīng)）u假陰性結(jié)果假陰性結(jié)果:硝酸鹽還原成非亞硝酸鹽的其他產(chǎn)物，硝酸鹽還原成非亞硝酸鹽的其他產(chǎn)物，如如nh3、n2、no或或n

29、2o和和羥胺。羥胺。u需要加少量鋅粉于陰性反應(yīng)中，鋅離子還原硝酸需要加少量鋅粉于陰性反應(yīng)中，鋅離子還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，加入鋅粉后變成紅色，表示有剩余鹽為亞硝酸鹽，加入鋅粉后變成紅色，表示有剩余的硝酸鹽存在，證明是真正的陰性反應(yīng)。的硝酸鹽存在，證明是真正的陰性反應(yīng)。u腸桿菌科細(xì)菌皆為陽性反應(yīng)腸桿菌科細(xì)菌皆為陽性反應(yīng)苯丙氨酸脫氨酶試驗苯丙氨酸脫氨酶試驗待檢菌新鮮培養(yǎng)物待檢菌新鮮培養(yǎng)物10%三氯化鐵三氯化鐵4-5滴滴苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基3618-24h苯丙酮酸苯丙酮酸陽性苯丙氨酸脫氨酶苯丙氨酸脫氨酶接種培養(yǎng)物要多避免假陰性立即觀察，5min之內(nèi)變形桿菌陽性，腸桿菌科陰性半乳糖苷酶試

30、驗半乳糖苷酶試驗待檢菌新鮮培養(yǎng)物待檢菌新鮮培養(yǎng)物制成濃菌液制成濃菌液36 5min振搖使酶釋放振搖使酶釋放陽性生理鹽水生理鹽水甲苯甲苯1 1滴滴onpg0.25mlonpg0.25ml37 20min、3h、18h、24huonpg=onpg=鄰硝基酚鄰硝基酚-d-d半乳糖苷半乳糖苷u陰性反應(yīng)不變色陰性反應(yīng)不變色uonpgonpg為無色為無色uph7.0ph7.0，過酸假陰性，過堿假陽過酸假陰性，過堿假陽性性甘油品紅試驗甘油品紅試驗待檢菌新鮮培養(yǎng)物待檢菌新鮮培養(yǎng)物甘油品紅肉湯培養(yǎng)基甘油品紅肉湯培養(yǎng)基368d丙酮酸丙酮酸乙醛乙醛紫紅色醌式化合物紫紅色醌式化合物品紅品紅u未接種培養(yǎng)基做對照未接種培養(yǎng)基做對照u復(fù)紅復(fù)紅=品紅品紅u培養(yǎng)時間長培養(yǎng)時間長u用于沙門菌屬種間鑒別用于沙門菌屬種間鑒別常見沙門菌陰性，乙型副常見沙門菌陰性，乙型副傷寒結(jié)果不定傷寒結(jié)果不定有機(jī)酸鹽利用試驗有機(jī)酸鹽利用試驗待檢菌新鮮營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物待檢菌新鮮營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物有機(jī)酸鹽培養(yǎng)基有機(jī)酸鹽培養(yǎng)基3614d酸酸沉淀沉淀藍(lán)色藍(lán)色每天觀察每天觀察酒石酸檸檬酸鈉黏液酸溴香草酚蘭黃綠色黃綠色白色白色 0.5 0.5mlml醋酸鉛飽和水溶液醋酸鉛飽和水溶液 u陰性反應(yīng)一直為藍(lán)色并有大量沉淀u沙門菌對右旋灑石酸鹽多為陽性，志賀菌為陰性，培養(yǎng)時間長；沙門菌對左旋灑石酸鹽反應(yīng)不同，其他屬為陰性u