分子生物學(xué)第六章基因的表達(dá)與調(diào)控上

1、 6 基因的表達(dá)與調(diào)控基因的表達(dá)與調(diào)控(上上) 原核基因表達(dá)調(diào)控模式原核基因表達(dá)調(diào)控模式v 原核生物細(xì)胞:v v 基因和蛋白質(zhì)種類較少v v 如大腸桿菌基因組約為4.60 x106bp共有4288個(gè)可讀框。 v 據(jù)估計(jì)，一個(gè)細(xì)胞中總共含有107個(gè)蛋白質(zhì)分子，如果每個(gè)基因等同翻譯的話，任何一個(gè)多肽應(yīng)有2500個(gè)拷貝。v 但是，這些蛋白質(zhì)并不是以相同拷貝數(shù)存在于每個(gè)細(xì)胞中的，有些蛋白質(zhì)的數(shù)目相當(dāng)固定，另一些則變化很大。v 每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞可以有約15000個(gè)核糖體，與其結(jié)合的約50種核糖體蛋白，數(shù)量也是十分穩(wěn)定的。糖酵解體系的酶含量很大，其數(shù)目也極恒定。v 如dna聚合酶、rna聚合酶等都是代謝過

2、程中十分必需的酶或蛋白質(zhì)，其合成速率不受環(huán)境變化或代謝狀態(tài)的影響，這一類蛋白質(zhì)被稱為組成型(constitutive)合成蛋白質(zhì)。v 另一種類型的蛋白質(zhì)的合成速率明顯地受環(huán)境的影響而改變，被稱為適應(yīng)型或調(diào)節(jié)型（adaptive or regulated)蛋白質(zhì)。 v 一般情況下，一個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中只有15個(gè)分子的-半乳糖苷酶，但若將細(xì)胞培養(yǎng)在只含乳糖的培養(yǎng)基中，每細(xì)胞中這個(gè)酶的量可高達(dá)幾萬個(gè)分子。v 其他參與糖代謝的酶，氨基酸、核苷酸合成系統(tǒng)的酶類，其合成速度和總量都隨培養(yǎng)條件的變化而改變。v 細(xì)菌中所利用的大多數(shù)基本調(diào)控機(jī)制一般執(zhí)行如下規(guī)律：v 一個(gè)體系在需要時(shí)被打開，不需要時(shí)被關(guān)閉。是通過

3、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄來建立的，也就是說在mrna的合成水平上調(diào)節(jié)。v 實(shí)際上，當(dāng)我們說一個(gè)系統(tǒng)處于關(guān)閉狀態(tài)時(shí)，也可能有本底水平的基因表達(dá)，常常是每世代每個(gè)細(xì)胞只合成1或2個(gè)mrna分子和極少量的蛋白質(zhì)分子。表示是基因表達(dá)量特別低，很難甚至無法檢測。6 61 1 原核基因表達(dá)調(diào)控總論原核基因表達(dá)調(diào)控總論v 基因表達(dá)：v 從dna到蛋白質(zhì)的過程稱為基因表達(dá)(gene expression）v 對這個(gè)過程的調(diào)節(jié)就稱為基因表達(dá)調(diào)控(gene regulation或gene control)。v 基因調(diào)控是現(xiàn)階段分子生物學(xué)研究的中心課題。 組成性表達(dá)(constitutive expression) 適應(yīng)性表達(dá)(a

4、daptive expression） 基因表達(dá)的方式基因表達(dá)的方式 1 1、組成性表達(dá)：、組成性表達(dá)：指不大受環(huán)境變動(dòng)而變化的一類基因表達(dá)。指不大受環(huán)境變動(dòng)而變化的一類基因表達(dá)。 某些基因在一個(gè)個(gè)體的幾乎所有細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，某些基因在一個(gè)個(gè)體的幾乎所有細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，通常被稱為通常被稱為管家基因管家基因(housekeeping gene)(housekeeping gene)。 2 2、適應(yīng)性表達(dá)、適應(yīng)性表達(dá) 指環(huán)境的變化容易使其表達(dá)水平變動(dòng)的一類基因表指環(huán)境的變化容易使其表達(dá)水平變動(dòng)的一類基因表達(dá)。達(dá)。v 應(yīng)環(huán)境條件變化基因表達(dá)水平增高的現(xiàn)象稱為誘導(dǎo)應(yīng)環(huán)境條件變化基因表達(dá)水平增高的現(xiàn)象稱

5、為誘導(dǎo)(induction)，這類基因被稱為這類基因被稱為可誘導(dǎo)的基因可誘導(dǎo)的基因(inducible gene)；v 相反，隨環(huán)境條件變化而基因表達(dá)水平降低的現(xiàn)象相反，隨環(huán)境條件變化而基因表達(dá)水平降低的現(xiàn)象稱為阻遏稱為阻遏(repression)，相應(yīng)的基因被稱為相應(yīng)的基因被稱為可阻遏的基因可阻遏的基因(repressible gene)。 基因表達(dá)的規(guī)律基因表達(dá)的規(guī)律 時(shí)間性和空間性時(shí)間性和空間性1、時(shí)間特異性（、時(shí)間特異性（temporal specificity）按功能需要，某一特定基因的表達(dá)嚴(yán)格按特定按功能需要，某一特定基因的表達(dá)嚴(yán)格按特定的時(shí)間順序發(fā)生，稱之為基因表達(dá)的的時(shí)間順序發(fā)

6、生，稱之為基因表達(dá)的時(shí)間特異性時(shí)間特異性。多細(xì)胞生物基因表達(dá)的時(shí)間特異性又稱多細(xì)胞生物基因表達(dá)的時(shí)間特異性又稱階段特階段特異性異性( (stage specificity) )。 2、空間特異性、空間特異性(spatial specificity)基因表達(dá)伴隨時(shí)間順序所表現(xiàn)出的這種分布基因表達(dá)伴隨時(shí)間順序所表現(xiàn)出的這種分布差異，實(shí)際上是由細(xì)胞在器官的分布決定的，所差異，實(shí)際上是由細(xì)胞在器官的分布決定的，所以空間特異性又稱以空間特異性又稱細(xì)胞或組織特異性細(xì)胞或組織特異性(cell or tissue specificity)。在個(gè)體生長全過程，某種基因產(chǎn)物在個(gè)體按在個(gè)體生長全過程，某種基因產(chǎn)物在

7、個(gè)體按不同組織空間順序出現(xiàn)，不同組織空間順序出現(xiàn)，稱之為基因表達(dá)的稱之為基因表達(dá)的空間空間特異性特異性。 基因表達(dá)調(diào)控的生物學(xué)意義基因表達(dá)調(diào)控的生物學(xué)意義v 適應(yīng)環(huán)境、維持生長和增殖（原核、真核） 維持個(gè)體發(fā)育與分化（真核）v基因表達(dá)調(diào)控主要表現(xiàn)：基因表達(dá)調(diào)控主要表現(xiàn)：v (1)轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控v (transcriptional regulation)；v (2)轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控v (post transcriptional regulation) v轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控包括:v mrna加工成熟水平上的調(diào)控v (differential processing of rna transcri

8、pt)； v 翻譯水平上的調(diào)控v (differential translation of mrna)。v原核生物中v 營養(yǎng)狀況(nutritional status)v 環(huán)境因素(environmental factor) v 對基因表達(dá)起著舉足輕重的影響。v真核生物尤其是高等真核生物中v 激素水平(hormone level)v 發(fā)育階段(developmental stage)v 是基因表達(dá)調(diào)控的最主要手段，營養(yǎng)和環(huán)境因素的影響力大為下降。v原核:v 轉(zhuǎn)錄與翻譯過程幾乎發(fā)生在同一時(shí)間間隔內(nèi)，轉(zhuǎn)錄與翻譯相偶聯(lián)。v真核生物:v 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物只有從核內(nèi)運(yùn)轉(zhuǎn)到核外，才能被核糖體翻譯成蛋白質(zhì)。 6.1

9、.1 原核基因調(diào)控機(jī)制的類型與特點(diǎn)v原核生物的基因調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上。v根據(jù)調(diào)控機(jī)制的不同可分為：v 負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控(negative transcription regulation)v 正轉(zhuǎn)錄調(diào)控(positive transcription regulation)v 在負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是阻遏蛋白(repressor)，起著阻止結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的作用。v 根據(jù)其作用特征又可分為:v 負(fù)控誘導(dǎo)v 負(fù)控阻遏v 二大類。v 在負(fù)控誘導(dǎo)系統(tǒng)中，阻遏蛋白不與效應(yīng)物(誘導(dǎo)物)結(jié)合時(shí)，結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄；v 在負(fù)控阻遏系統(tǒng)中，阻遏蛋白與效應(yīng)物結(jié)合時(shí)，結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄。v 阻遏蛋白作用的部位是操縱

10、區(qū)。v 在正轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是激活蛋白(activator)。v根據(jù)激活蛋白的作用性質(zhì)分為:v 正控誘導(dǎo)系統(tǒng)v 正控阻遏系統(tǒng)。v 在正控誘導(dǎo)系統(tǒng)中，效應(yīng)物分子(誘導(dǎo)物)的存在使激活蛋白處于活性狀態(tài)；v 在正控阻遏系統(tǒng)中，效應(yīng)物分子的存在使激活蛋白處于非活性狀態(tài)。轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控的其他形式轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控的其他形式1. 因子的更換 在e.coli中,當(dāng)細(xì)胞從基本的轉(zhuǎn)錄機(jī)制轉(zhuǎn)入各種特定基因表達(dá)時(shí)，需要不同的因子指導(dǎo)rna聚合酶與各種啟動(dòng)子結(jié)合。參與大腸桿菌基因表達(dá)調(diào)控最常見的蛋白質(zhì)是因子。v溫度較高,誘導(dǎo)產(chǎn)生各種熱休克蛋白 由32參與構(gòu)成的rna聚合酶與熱休克應(yīng)答基因啟動(dòng)子結(jié)合,誘導(dǎo)產(chǎn)生

11、大量的熱休克蛋白,適應(yīng)環(huán)境需要 枯草芽孢桿菌芽孢形成 有序的因子的替換,rna聚合酶識別不同基因的啟動(dòng)子,使芽孢形成有關(guān)的基因有序地表達(dá)v 除參與氮代謝的54以外，其它5種因子在結(jié)構(gòu)上具有同源性，所以統(tǒng)稱70家族。v 所有因子都含有4個(gè)保守區(qū)，其中第2個(gè)和第4個(gè)保守區(qū)參與結(jié)合啟動(dòng)區(qū)dna，第2個(gè)保守區(qū)的另一部分還參與雙鏈dna解開成單鏈的過程。v 大多數(shù)因子特異性結(jié)合dna上的-35區(qū)和-10區(qū)，而54因子識別并與dna上的-24和-12區(qū)相結(jié)合。v在與啟動(dòng)子結(jié)合的順序上:v 70類啟動(dòng)子在核心酶結(jié)合到dna鏈上之后才能與啟動(dòng)子區(qū)相結(jié)合v 54則類似于真核生物的tata區(qū)結(jié)合蛋白(tbp)，可

12、以在無核心酶時(shí)獨(dú)立結(jié)合到啟動(dòng)子上。v 通過特殊代謝物調(diào)節(jié)的基因活性主要有兩大類：v 可誘導(dǎo)v 可阻遏v (1)可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)： v 是指一些基因在特殊的代謝物或化合物的作用下，由原來關(guān)閉的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣ぷ鳡顟B(tài)，即在某些物質(zhì)的誘導(dǎo)下使基因活化。 v 大腸桿菌在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中生長良好，在只含乳糖的培養(yǎng)基中開始時(shí)生長不好，直到合成了利用乳糖的一系列酶，具備了利用乳糖作為碳源的能力才開始生長。v 細(xì)菌在誘導(dǎo)物乳糖的誘導(dǎo)下開動(dòng)了乳糖操縱子，表達(dá)它所編碼的3個(gè)酶：v -半乳糖苷酶(使乳糖水解為半乳糖和葡萄糖)v -半乳糖苷透過酶(使乳糖進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi))v -半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶(使-半乳糖第六位碳原子乙酰

13、化)。v 在葡萄糖培養(yǎng)基中生長時(shí)，每個(gè)細(xì)胞只有幾個(gè)-半乳糖苷酶分子，但若轉(zhuǎn)移到乳糖培養(yǎng)基中，幾分鐘后，每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)可產(chǎn)生3000個(gè)酶分子。v 因此，這類基因被稱為可誘導(dǎo)基因v 這類酶被稱為誘導(dǎo)酶v 這個(gè)生化過程被稱為酶的誘導(dǎo)合成。v (2)可阻遏調(diào)節(jié)： v 這類基因平時(shí)都是開啟的，處在產(chǎn)生蛋白質(zhì)或酶的工作過程中，由于一些特殊代謝物或化合物的積累而將其關(guān)閉，阻遏了基因的表達(dá)。 v 大腸桿菌生活中必須有色氨酸，一般情況下，色氨酸操縱子是開啟的。v 如果在細(xì)菌培養(yǎng)基中加入色氨酸，使之能利用培養(yǎng)基中的色氨酸來維持生活而不需要再費(fèi)力去合成，細(xì)菌往往能在2-3 min內(nèi)完全關(guān)閉該操縱子。v 某一代謝途徑

14、最終產(chǎn)物合成酶的基因可以被這個(gè)產(chǎn)物本身所關(guān)閉。v 這種基因被稱為可阻遏基因v 這些酶被稱為可阻遏酶v 這個(gè)現(xiàn)象被稱為可阻遏現(xiàn)象v 這些起阻遏作用的小分子被稱為阻遏物。 v一般規(guī)律：v 可誘導(dǎo)的操縱子總是一些編碼糖和氨基酸分解代謝蛋白的基因，這些糖和氨基酸平時(shí)含量很少，細(xì)菌總是利用更一般的能源物質(zhì)葡萄糖的水解來提供能源，因此，這些操縱子常常是關(guān)閉的。v 一旦生存條件發(fā)生變化，如葡萄糖缺乏而必須利用乳糖作為能源時(shí)，就要打開這些基因。v 可阻遏基因是一些合成各種細(xì)胞代謝過程中所必須的小分子物質(zhì)(如氨基酸、嘌呤和嘧啶等)的基因，由于這類物質(zhì)在生命過程中的重要地位，這些基因總是打開著的。v 只有當(dāng)細(xì)菌生

15、活環(huán)境中有充分供應(yīng)時(shí)，才關(guān)閉這些基因，停止其合成。6 61 12 2 弱化子對基因活性的影響弱化子對基因活性的影響v 大腸桿菌中色氨酸操縱子、苯丙氨酸操縱子等的調(diào)節(jié)方式是通過弱化子調(diào)節(jié)的。v 在這種調(diào)節(jié)方式中，起信號作用的是有特殊負(fù)載的氨酰-trna的濃度，在色氨酸操縱子中就是色氨酰-trna的濃度。v 當(dāng)操縱子被阻遏，rna合成被終止時(shí)。 v 起終止轉(zhuǎn)錄信號作用的那一段核苷酸起終止轉(zhuǎn)錄信號作用的那一段核苷酸被稱為弱化子。v 因?yàn)楹颂求w在基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上的不同位置，決定了rna可以形成哪一種形式的二級結(jié)構(gòu)、并由此決定基因能否繼續(xù)轉(zhuǎn)錄。v 起調(diào)節(jié)作用的信號分子是細(xì)胞中某一氨基酸或嘧啶的濃度濃度，因

16、此是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中的微調(diào)整，只要稍加變動(dòng)就可影響整個(gè)體系的功能。v 屬于這種調(diào)節(jié)方式的有:v 大腸桿菌中的色氨酸操縱子v 苯丙氨酸操縱子v 蘇氨酸操縱子v 異亮氨酸操縱子v 纈氨酸操縱子v 沙門氏菌的組氨酸操縱子和亮氨酸操縱子、嘧啶合成操縱子等。6 61 13 3 降解物對基因活性的調(diào)節(jié)降解物對基因活性的調(diào)節(jié)v 操縱子學(xué)說的核心是使基因從表達(dá)抑制狀態(tài)中解脫出來進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，是從負(fù)調(diào)節(jié)的角度來考慮基因表達(dá)調(diào)控的。v 如何通過正調(diào)節(jié)以提高基因的轉(zhuǎn)錄水平，使它由原來的低水平表達(dá)變成高水平表達(dá)，這就是降解物抑制作用的調(diào)節(jié)。 v 有葡萄糖存在的情況下，即使在細(xì)菌培養(yǎng)基中加入乳糖、半乳糖、阿拉伯糖或麥芽糖等誘導(dǎo)物

17、，與其相對應(yīng)的操縱子也不會(huì)啟動(dòng)，不會(huì)產(chǎn)生出代謝這些糖的酶來，這種現(xiàn)象稱為葡萄糖效應(yīng)或稱為降解物抑制作用。 因?yàn)樘砑悠咸烟呛螅?xì)菌所需要的能量便可從葡萄糖得到滿足，細(xì)菌無需開動(dòng)一些不常用的基因去利用那些稀有的糖類。v 葡萄糖的存在會(huì)抑制細(xì)菌的腺苷酸環(huán)化酶活性，減少camp的合成v 與它相結(jié)合的蛋白質(zhì)環(huán)腺苷酸受體蛋白crp（又稱分解代謝物激活蛋白cap）因找不到配體而不能形成復(fù)合物。v 降解物抑制作用是通過提高轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度來調(diào)節(jié)基因表達(dá)的，是一種積極的調(diào)節(jié)方式。6 61 14 4 細(xì)菌的應(yīng)急反應(yīng)細(xì)菌的應(yīng)急反應(yīng)v 在所謂“正?！保舶ㄉ瞽h(huán)境中缺少某一種或兩種能源，細(xì)菌能找到其他代用物，進(jìn)行正常生活條

18、件下的基因表達(dá)調(diào)節(jié)。v 可是，細(xì)菌有時(shí)會(huì)碰到緊急狀況，比如氨基酸饑餓時(shí)，就不是缺少一二種氨基酸，而是氨基酸的全面匱乏。為了緊縮開支，渡過難關(guān)，細(xì)菌將會(huì)產(chǎn)生一個(gè)應(yīng)急反應(yīng)，包括生產(chǎn)各種rna、糖、脂肪和蛋白質(zhì)在內(nèi)的幾乎全部生物化學(xué)反應(yīng)過程均被停止。v 實(shí)施這一應(yīng)急反應(yīng)的信號是鳥苷四磷酸(ppgpp)和鳥苷五磷酸(pppgpp)。v 產(chǎn)生這兩種物質(zhì)的誘導(dǎo)物是空載trna。v 當(dāng)氨基酸饑餓時(shí)，細(xì)胞中便存在大量的不帶氨基酸的trna，這種空載的trna會(huì)激活焦磷酸轉(zhuǎn)移酶，使ppgpp大量合成，其濃度可增加10倍以上。v ppgpp的出現(xiàn)會(huì)關(guān)閉許多基因，當(dāng)然也會(huì)打開一些合成氨基酸的基因，以應(yīng)付這種緊急狀況

19、。v 關(guān)于ppgpp的作用原理還不大清楚。v 一般認(rèn)為rna聚合酶有不同的構(gòu)象，這些構(gòu)象可以識別不同的啟動(dòng)子區(qū)，ppgpp與rna聚合酶結(jié)合會(huì)使它的某些構(gòu)象穩(wěn)定下來，從而改變了基因轉(zhuǎn)錄的效率。v 也有人認(rèn)為基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近有一些保守序列，它們可能是ppgpp或有關(guān)調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)這些序列與ppgpp結(jié)合后，就不能與rna聚合酶相結(jié)合，使基因被關(guān)閉。v ppgpp與pppgpp的作用范圍十分廣泛，它們不是只影響一個(gè)或幾個(gè)操縱子，而是影響一大批，所以它們是超級調(diào)控因子。1 1、操縱子模型的提出、操縱子模型的提出 1961 1961年，年，monodmonod和和jacobjacob提出提

20、出 獲獲19651965年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)6 62 2 乳糖操縱子與負(fù)控誘導(dǎo)系統(tǒng)乳糖操縱子與負(fù)控誘導(dǎo)系統(tǒng)jacob and monod2、操縱子的定義、操縱子的定義操縱子操縱子： 是基因表達(dá)的協(xié)調(diào)單位，由是基因表達(dá)的協(xié)調(diào)單位，由啟動(dòng)子啟動(dòng)子、操縱基操縱基因因及其所控制的一組功能上相關(guān)的及其所控制的一組功能上相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因所組所組成。成。 操縱基因受調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物的控制。操縱基因受調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物的控制。v 大腸桿菌乳糖操縱子包括3個(gè)結(jié)構(gòu)基因：z、y和a，以及啟動(dòng)子、控制子（基因）和阻遏子等。v 轉(zhuǎn)錄時(shí)，rna聚合酶首先與啟動(dòng)區(qū)(promoter，p)結(jié)合，通過操縱區(qū)

21、(operator，o)向右轉(zhuǎn)錄。v 轉(zhuǎn)錄從o區(qū)中間開始，按z-y-a方向進(jìn)行，每次轉(zhuǎn)錄出來的一條mrna上都帶有這3個(gè)基因。v 轉(zhuǎn)錄的調(diào)控是在啟動(dòng)區(qū)和操縱區(qū)進(jìn)行的。v3 3個(gè)結(jié)構(gòu)基因各決定一種酶：個(gè)結(jié)構(gòu)基因各決定一種酶：v z 編碼-半乳糖苷酶：v y 編碼-半乳糖苷透過酶：v a 編碼-半乳糖苷乙酰基轉(zhuǎn)移酶：v -半乳糖苷酶是一種-半乳糖苷鍵的專一性酶，除能將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外，還能水解其他-半乳糖苷。v -半乳糖苷透過酶的作用是使外界的-半乳糖苷(如乳糖)透過大腸桿菌細(xì)胞壁和原生質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，所以，如果用乳糖為大腸桿菌生長的惟一碳源和能源，這兩種酶是必需的。v -半乳糖苷乙?；?/p>

22、轉(zhuǎn)移酶的作用是把乙酰輔酶a上的乙?；D(zhuǎn)移到-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖，它在乳糖的利用中并非必需。 6 62 21 1 酶的誘導(dǎo)酶的誘導(dǎo)laclac體系受調(diào)控的證據(jù)體系受調(diào)控的證據(jù)v 在不含乳糖及-半乳糖苷的培養(yǎng)基中，lac+基因型大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)-半乳糖苷酶和透過酶的濃度很低，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)大約只有1-2個(gè)酶分子。v 但是，如果在培養(yǎng)基中加入乳糖，酶的濃度很快達(dá)到細(xì)胞總蛋白量的6或7，每個(gè)細(xì)胞中可有超過105個(gè)酶分子。 v 當(dāng)有乳糖供應(yīng)時(shí)，在無葡萄糖培養(yǎng)基中生長的lac+細(xì)菌中將同時(shí)合成-半乳糖苷酶和透過酶。v 培養(yǎng)基中加入乳糖1-2min后，編碼-半乳糖苷酶和透過酶的lac mrna量就迅速增加

23、。v 去掉乳糖后，lac mrna量立即下降到幾乎無法檢測到，表明乳糖確實(shí)能激發(fā)lac mrna的合成。v 研究誘導(dǎo)作用時(shí)很少使用乳糖，因?yàn)榕囵B(yǎng)基中的乳糖會(huì)被誘導(dǎo)合成的-半乳糖苷酶所催化降解，從而使其濃度不斷發(fā)生變化。v v實(shí)驗(yàn)室里常常使用兩種含硫的乳糖類似物:v 異丙基巰基半乳糖苷(iptg)v 巰甲基半乳糖苷(tmg)。 v 另外，在酶活性分析中常用，發(fā)色底物o-硝基半乳糖苷(onpg)，它們都是高效誘導(dǎo)物。因?yàn)樗鼈兌疾皇前肴樘擒彰傅牡孜?，所以又稱為安慰性誘導(dǎo)物(gratuitous inducer)。v 如果某種物質(zhì)能夠促使細(xì)菌產(chǎn)生酶而本身又不被分解，這種物質(zhì)被稱為安慰誘導(dǎo)物.v 同位素

24、實(shí)驗(yàn)證明，酶的合成不是由前體轉(zhuǎn)化而來的，而是加入誘導(dǎo)物后新合成的。v 已經(jīng)分離在有誘導(dǎo)物或沒有誘導(dǎo)物的情況下都能產(chǎn)生lac mrna的突變體，這種失去調(diào)節(jié)能力的突變體稱為永久型突變體，為分兩類：i型和o型。v i型：野生型為i+，突變型為i- o型：野生型為o+，突變型為oc。v i+ i-或o+ oc后，z、y、a結(jié)構(gòu)基因均表現(xiàn)為永久表達(dá)，所以i基因被稱為調(diào)節(jié)基因(regulatory gene)。v i基因是一個(gè)產(chǎn)生阻遏物的調(diào)節(jié)基因，其產(chǎn)物使體系關(guān)閉。 i-突變體由于不能產(chǎn)生阻遏物，使細(xì)胞成為lac永久表達(dá)型。 i- / i+局部二倍體由于帶有一個(gè)正常阻遏物，使細(xì)胞中的lac仍然被抑制。v

25、 遺傳學(xué)圖譜分析指出， oc突變位于i與z之間，所以，lac體系的4個(gè)基因的序列為iozy。v 通過這些觀察，jacob和monod推斷oc突變代表dna鏈上的一個(gè)位點(diǎn)或一個(gè)非編碼區(qū)域，而不是一個(gè)基因，因?yàn)榭删幋a的基因具有互補(bǔ)性，而oc沒有這一特性。v o決定相鄰z基因的產(chǎn)物是誘導(dǎo)型合成還是永久型合成，o區(qū)域稱為操縱基因。6 62 22 2 操縱子模型及其影響因子操縱子模型及其影響因子v 1961年jacob和monod發(fā)表lac操縱子負(fù)控誘導(dǎo)模式，建立了乳糖操縱子的控制模型，其主要內(nèi)容如下：v (1) z、y、a基因的產(chǎn)物由同一條多順反子的mrna分子所編碼；v (2)該mrna分子的啟動(dòng)區(qū)

26、(p)位于阻遏基因(i)與操縱區(qū)(o)之間，不能單獨(dú)起始半乳糖苷酶和透過酶基因的高效表達(dá)；v (3)操縱區(qū)是dna上的一小段序列（長26bp?,35bp)，是阻遏物的結(jié)合位點(diǎn)； (4)當(dāng)阻遏物與操縱區(qū)相結(jié)合時(shí)，lac mrna的轉(zhuǎn)錄起始受到抑制； (5)誘導(dǎo)物通過與阻遏物結(jié)合，改變它的三維構(gòu)象，使之不能與操縱區(qū)相結(jié)合，從而激發(fā)lac mrna的合成。 這就是說，有誘導(dǎo)物存在時(shí)，操縱區(qū)沒有被阻遏物占據(jù)，所以啟動(dòng)子能夠順利起始mrna的轉(zhuǎn)錄。v 首先，誘導(dǎo)物需要穿過細(xì)胞膜才能與阻遏物結(jié)合v 而轉(zhuǎn)運(yùn)誘導(dǎo)物需要透過酶v 透過酶的合成又需要誘導(dǎo)。v 第一個(gè)誘導(dǎo)物是如何達(dá)到細(xì)胞內(nèi)的？1lac操縱子的本底水

27、平表達(dá)影響因子影響因子v兩種可能：v 一些誘導(dǎo)物可以在透過酶不存在時(shí)進(jìn)入細(xì)胞；v 一些透過酶可以在沒有誘導(dǎo)物的情況下合成。v v 研究表明，第二種解釋是正確的。 v 其次，人們發(fā)現(xiàn)乳糖(葡萄糖-1，4-半乳糖)并不與阻遏物相結(jié)合，真正的誘導(dǎo)物是乳糖的異構(gòu)體異構(gòu)乳糖(葡萄糖-1，6-半乳糖).v 而異構(gòu)乳糖是在-半乳糖苷酶的催化下由乳糖形成的。v 因此，乳糖誘導(dǎo)-半乳糖苷酶的合成需要有-半乳糖苷酶的預(yù)先存在。v解釋：v 在非誘導(dǎo)狀態(tài)下有少量的lac mrna合成(大約每個(gè)世代中有1-5個(gè)mrna分子)，這種合成被稱之為本底水平的組成型合成(background level constitutiv

28、e synthesis)。v v 由于阻遏物的結(jié)合并不是絕對緊密的，即使在它與操縱基因緊密結(jié)合時(shí)，也會(huì)偶爾掉下來；這時(shí)啟動(dòng)子的障礙被解除，rna聚合酶開始轉(zhuǎn)錄。這種現(xiàn)象以每個(gè)細(xì)胞周期1-2次的概率發(fā)生。v 細(xì)菌生長在以甘油為碳源的培養(yǎng)基中，按照lac操縱子本底水平的表達(dá)，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)可有幾個(gè)分子的-半乳糖苷酶和乳糖透過酶。v 現(xiàn)在加入乳糖，在單個(gè)透過酶分子作用下，少量乳糖分子進(jìn)入細(xì)胞，又在單個(gè)-半乳糖苷酶分子的作用下轉(zhuǎn)變成異構(gòu)乳糖。v 某個(gè)異構(gòu)乳糖與結(jié)合在操縱區(qū)上的阻遏物相結(jié)合并使后者失活而離開操縱區(qū)，開始lac mrna的生物合成。v 這些mrna分子編碼了大量的-半乳糖苷酶和乳糖透過酶，其結(jié)

29、果導(dǎo)致乳糖大量涌入細(xì)胞。2 2大腸桿菌對乳糖的反應(yīng)大腸桿菌對乳糖的反應(yīng)v 多數(shù)乳糖被降解成為葡萄糖和半乳糖，但還有許多乳糖被轉(zhuǎn)變成異構(gòu)乳糖，然后與細(xì)胞內(nèi)的阻遏物結(jié)合(雖然合成速度低，但是阻遏物仍繼續(xù)合成，因此必須有足夠的異構(gòu)乳糖才能使細(xì)胞維持去阻遏狀態(tài))，阻遏物的失活促使mrna高速合成，進(jìn)一步提高了透過酶和-半乳糖苷酶的濃度。v 降解產(chǎn)生的葡萄糖被細(xì)胞用作碳源和能源，降解產(chǎn)生的半乳糖則被另一套酶體系轉(zhuǎn)變成葡萄糖，這些酶的合成也是可誘導(dǎo)的。v 一旦培養(yǎng)基和細(xì)胞中的所有乳糖都被消耗完畢，由于阻遏物仍在不斷地被合成，有活性的阻遏物濃度將超過異構(gòu)乳糖的濃度，使細(xì)胞重新建立起阻遏狀態(tài)，導(dǎo)致lac mr

30、na合成被抑制。 v 在細(xì)菌中，多數(shù)mrna的半衰期只有幾分鐘，所以在不到一個(gè)世代的生長期內(nèi)，lac mrna幾乎從細(xì)胞內(nèi)消失。-半乳糖苷酶及透過酶的合成也趨向停止，這些蛋白質(zhì)雖然很穩(wěn)定，但其濃度隨著細(xì)胞的分裂而不斷被稀釋。v 如果在原有的乳糖被撤去之后的一個(gè)世代中再加入乳糖，這時(shí)乳糖可以立即開始降解，因?yàn)榇藭r(shí)細(xì)胞內(nèi)仍有一定濃度的透過酶和-半乳糖苷酶。v lac操縱子阻遏物mrna是由弱啟動(dòng)子控制下組成型合成的，該阻遏蛋白有4個(gè)相同的亞基，每個(gè)亞基均含有347個(gè)氨基酸殘基，并能與1分子iptg結(jié)合。v 未經(jīng)分級分離的細(xì)胞提取物的結(jié)合能力大約為每細(xì)胞結(jié)合20-40個(gè)iptg分子，因此推測每個(gè)細(xì)胞

31、中有5-10個(gè)阻遏物分子。觀察發(fā)現(xiàn)在i i- -突變株細(xì)胞提取物中缺少阻遏物，從而證明與iptg結(jié)合的物質(zhì)確實(shí)是蛋白質(zhì)。v 當(dāng)i基因由弱啟動(dòng)子突變成強(qiáng)啟動(dòng)子，細(xì)胞內(nèi)就不可能產(chǎn)生足夠的誘導(dǎo)物來克服阻遏狀態(tài)，整個(gè)lac操縱子在這些突變體中就不可誘導(dǎo)。3阻遏物lac i基因產(chǎn)物及功能v -半乳糖苷酶在乳糖代謝中的作用是把乳糖分解成葡萄糖及半乳糖(半乳糖在gal操縱子的作用下再轉(zhuǎn)化成葡萄糖)。如果將葡萄糖和乳糖同時(shí)加入培養(yǎng)基中，大腸桿菌在耗盡外源葡萄糖之前不會(huì)誘發(fā)lac操縱子。v 研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖對lac操縱子表達(dá)的抑制是間接的。v 如在一個(gè)大腸桿菌突變體，它在糖酵解途徑中不能將葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為

32、下一步代謝中間物，這些細(xì)菌的lac基因能在葡萄糖存在時(shí)被誘導(dǎo)合成。所以，我們說不是葡萄糖而是它的某些降解產(chǎn)物抑制lac mrna的合成，科學(xué)上把葡萄糖的這種效應(yīng)稱之為代謝物阻遏效應(yīng)(catabolite repression)。4葡萄糖對lac操縱子的影響v 在大腸桿菌中，camp的濃度受到葡萄糖代謝的調(diào)節(jié)。v 如果將細(xì)菌放在缺乏碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞內(nèi)camp濃度就高；v 如果在含葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，camp的濃度就低；v 如果培養(yǎng)基中只有甘油或乳糖等不進(jìn)行糖酵解途徑的碳源，camp的濃度也會(huì)很高。v 因此推測糖酵解途徑中位于葡萄糖-6-磷酸與甘油之間的某些代謝產(chǎn)物是腺苷酸環(huán)化酶活性的抑

33、制劑。5camp與代謝物激活蛋白zyaopdna 調(diào)控區(qū)調(diào)控區(qū)cap結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)序列啟動(dòng)序列操縱序列操縱序列 結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因z： -半乳糖苷酶半乳糖苷酶y： 透酶透酶a：乙?；D(zhuǎn)移酶乙?；D(zhuǎn)移酶campcap復(fù)合物v 大腸桿菌中的代謝物激活蛋白v 由crp基因編碼，能與camp形成復(fù)合物。v 凡crp及腺苷酸環(huán)化酶基因突變的細(xì)菌都不能合成lac mrna，crp和camp都是合成lac mrna所必需的。 v camp-crp復(fù)合物是激活lac的重要組成部分，細(xì)菌對于此復(fù)合物的需要是獨(dú)立的，與阻遏體系無關(guān)，轉(zhuǎn)錄必須有camp-crp復(fù)合物結(jié)合在dna的啟動(dòng)子區(qū)域上。v crp基因和環(huán)

34、化酶基因的突變細(xì)菌即使同時(shí)也是i-或oc突變，都不能合成出lac mrna。v 所以，camp-crp是一個(gè)不同于阻遏物的正調(diào)控因子，而lac操縱子的功能是在這兩個(gè)相互獨(dú)立的調(diào)控體系作用下實(shí)現(xiàn)的。v 半乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖、山梨醇等在降解過程中均轉(zhuǎn)化生成葡萄糖或糖酵解途徑中的其他中間產(chǎn)物，所以，這些糖代謝中有關(guān)的酶都是由可誘導(dǎo)的操縱子控制的。只要有葡萄糖存在，這些操縱子就不表達(dá)，被稱為降解物敏感型操縱子(catabolite sensitive operon)。v 實(shí)驗(yàn)證明這些操縱子都是由camp-crp調(diào)節(jié)的。對大量操縱子啟動(dòng)區(qū)的研究表明，crp-camp結(jié)合位點(diǎn)存在序列特異性。v cam

35、p-crp復(fù)合物與啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合是lac mrna合成起始所必需的。v 該復(fù)合物結(jié)合于啟動(dòng)子上游，能使dna雙螺旋發(fā)生彎曲，有利于形成穩(wěn)定的開放型啟動(dòng)子-rna聚合酶結(jié)構(gòu)。v 而阻遏物則是一個(gè)抗解鏈蛋白(antimelting protein)，阻止形成開放結(jié)構(gòu)，從而抑制rna聚合酶的功能。623 lac操縱子操縱子dna的調(diào)控區(qū)的調(diào)控區(qū)p、o區(qū)區(qū)v 已經(jīng)分離得到含有l(wèi)ac操縱子的dna片段，發(fā)現(xiàn)p區(qū)(即啟動(dòng)子區(qū))一般是從i基因結(jié)束到mrna轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游5-10bpv 而o區(qū)(即阻遏物結(jié)合區(qū))位于-7+28位，該區(qū)的堿基序列有對稱性，其對稱軸在+11位堿基對。v 實(shí)驗(yàn)表明，阻遏物與o區(qū)的結(jié)

36、合影響了rna聚合酶與啟動(dòng)區(qū)結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的效率。 6 62 24 4 laclac操縱子中的其他問題操縱子中的其他問題v1a基因及其生理功能 v a基因存在于lac操縱子中，編碼了-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶。v 雖然乳糖本身不能被乙?；?，但這個(gè)酶能夠把乙酰基從供體上轉(zhuǎn)移到半乳糖苷分子上。v 自然界中存在著許多種能被-半乳糖苷酶降解的半乳糖苷分子，它們的分解產(chǎn)物往往不能被進(jìn)一步代謝，很容易在體內(nèi)積累。這是非常有害的，因?yàn)椴簧侔肴樘擒昭苌镌诟邼舛葧r(shí)是細(xì)胞正常生長的抑制物。v 當(dāng)有iptg存在時(shí),i-oca-大腸桿菌的生長速度顯著慢于相應(yīng)的a+株系，兩組細(xì)胞的差異僅僅在于后者能將iptg乙酰

37、化，而乙?；膇ptg不能被-半乳糖苷酶所分解。v 所以，a基因雖然不在乳糖降解中起作用，但它抑制了-半乳糖苷酶產(chǎn)物的有害性衍生物在細(xì)胞內(nèi)積累，在生物進(jìn)化中是有意義的。v 在一個(gè)完全被誘導(dǎo)的細(xì)胞中，-半乳糖苷酶、透過酶及乙?；D(zhuǎn)移酶的拷貝數(shù)比例為1:0.5:0.2。這個(gè)比例在一定程度上反映了以-半乳糖苷作為惟一碳源時(shí)細(xì)胞的需要。v 不同的酶在數(shù)量上的差異是由于在翻譯水平上受到調(diào)節(jié)所致。v 這種調(diào)節(jié)有以下兩種方式：2 2laclac基因產(chǎn)物數(shù)量上的比較基因產(chǎn)物數(shù)量上的比較v(1)lac mrna可能與翻譯過程中的核糖體相脫離，從而終止蛋白質(zhì)鏈的翻譯。v 這種現(xiàn)象發(fā)生的頻率取決于每一個(gè)后續(xù)的aug

38、密碼子再度起始翻譯的概率。因此，就存在著一個(gè)從mrna的5末端到3末端的蛋白質(zhì)合成梯度。v 對于大多數(shù)多順反子mrna分子來說，這種現(xiàn)象具有普遍性。 v(2)在lac mrna分子內(nèi)部，a基因比z基因更易受內(nèi)切酶作用發(fā)生降解，因此，在任何時(shí)候z基因的完整拷貝數(shù)要比a基因多。v 事實(shí)上，對于某個(gè)活躍表達(dá)的多順反子操縱子，該mrna所編碼的各種蛋白質(zhì)的相對濃度都由每一個(gè)順反子的翻譯頻率所決定。c aba: rna polymeraseb: lac repressor c: crp-camp6 63 3 色氨酸操縱子與負(fù)控阻遏系統(tǒng)色氨酸操縱子與負(fù)控阻遏系統(tǒng)v 由于trp體系參與生物合成不受葡萄糖或c

39、amp-crp的調(diào)控。v 色氨酸的合成主要分5步完成，每個(gè)環(huán)節(jié)需要一種酶，編碼這5種酶的基因緊密連鎖在一起，被轉(zhuǎn)錄在一條多順反子mrna上，分別以trpe、trpd、trpc、trpb、trpa代表，編碼了鄰氨基苯甲酸合成酶、鄰氨基苯甲酸焦磷酸轉(zhuǎn)移酶、鄰氨基苯甲酸異構(gòu)酶、色氨酸合成酶和吲哚甘油-3-磷酶合成酶。一、色氨酸操縱子的結(jié)構(gòu)一、色氨酸操縱子的結(jié)構(gòu) 調(diào)控基因調(diào)控基因 結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因 催化分枝酸轉(zhuǎn)變?yōu)樯彼岬拿复呋种λ徂D(zhuǎn)變?yōu)樯彼岬拿竧rprtrpv共有7個(gè)基因參與了色氨酸合成過程，編碼了與色氨酸合成有關(guān)的5個(gè)酶：v trpe和trpg編碼鄰氨基苯甲酸合酶v trpd編碼鄰氨基苯甲酸磷

40、酸核糖轉(zhuǎn)移酶v trpf編碼異構(gòu)酶v trpc編碼吲哚甘油磷酸合酶v trpa和trpb則分別編碼色氨酸合酶的和亞基。v 在大腸桿菌等許多細(xì)菌中，trpe和trpg融合成一個(gè)功能基因，trpc和trpb也融合成一個(gè)基因，產(chǎn)生具有雙重功能的蛋白質(zhì)。v 除上述7個(gè)基因之外，細(xì)菌中還有： v paba，pabb基因分別編碼adc合酶的兩個(gè)亞基v pabc基因編碼adc裂解酶v ubic基因編碼分枝酸裂解酶v entc基因編碼異構(gòu)分枝酸合酶v 這些基因產(chǎn)物都在不同程度上參與了分枝酸代謝，與色氨酸合成有一定關(guān)系。v trpe基因是第一個(gè)被翻譯的基因，和trpe緊鄰的是啟動(dòng)子區(qū)和操縱區(qū)。v 另外，前導(dǎo)區(qū)和

41、弱化子區(qū)分別定名為trpl和trpa(不是trpa)。v trp操縱子中產(chǎn)生阻遏物的基因是trpr，該基因距trp基因簇很遠(yuǎn)。后者位于大腸桿菌染色體圖上25 min處，而前者則位于90 min處。v 在位于65 min處還有一個(gè)trps(色氨酸t(yī)rna合成酶)，它與攜帶有色氨酸的trnatrp共同參與trp操縱子的調(diào)控作用。trp操縱子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控除了阻遏系統(tǒng)以外，還有弱化系統(tǒng)。 l區(qū)編碼了前導(dǎo)肽，當(dāng)有高濃度trp存在時(shí)，由于弱化子a的作用，轉(zhuǎn)錄迅速減弱停止，生成140核苷酸的前導(dǎo)rna； 當(dāng)trp濃度較低時(shí)，弱化子不起作用，轉(zhuǎn)錄得以正常進(jìn)行，生成長約7kb的mrna，操縱子中第一個(gè)結(jié)構(gòu)基因的起

42、始密碼子aug在+162處。 v特點(diǎn): (1) trpr和trpabcde不連鎖； (2) 操縱基因在啟動(dòng)子內(nèi) (3) 有衰減子(attenuator)/弱化子 (4) 啟動(dòng)子和結(jié)構(gòu)基因不直接相連，二者被 前導(dǎo)序列(leader)所隔開 631 trp操縱子的阻遏系統(tǒng)操縱子的阻遏系統(tǒng)v trpr基因突變常引起trp mrna的組成型合成，該基因產(chǎn)物因此被稱為輔阻遏蛋白(aporepressor)。除非培養(yǎng)基中有色氨酸，否則這個(gè)輔阻遏蛋白不會(huì)與操縱區(qū)結(jié)合。v 輔阻遏蛋白與色氨酸相結(jié)合形成有活性的阻遏物，與操縱區(qū)結(jié)合開關(guān)閉trp mrna轉(zhuǎn)錄。v 這個(gè)系統(tǒng)中的效應(yīng)物分子是色氨酸，是由trp操縱子所

43、編碼的生物合成途徑的末端終產(chǎn)物。v 當(dāng)培養(yǎng)基中色氨酸含量較高時(shí)，它與游離的輔阻遏蛋白相結(jié)合，并使之與操縱區(qū)dna緊密結(jié)合；v 當(dāng)培養(yǎng)基中色氨酸供應(yīng)不足時(shí)，輔阻遏物失去色氨酸并從操縱區(qū)上解離，trp操縱子去阻遏。色氨酸供應(yīng)短缺時(shí)，基因活化色氨酸供應(yīng)短缺時(shí)，基因活化色氨酸過剩時(shí)，與阻遏因子結(jié)合，抑制基因轉(zhuǎn)錄色氨酸過剩時(shí)，與阻遏因子結(jié)合，抑制基因轉(zhuǎn)錄632 弱化子與前導(dǎo)肽弱化子與前導(dǎo)肽v 6. 3. 2. 1 弱化子v 阻遏不是惟一的調(diào)節(jié)機(jī)制。v 在色氨酸高濃度和低濃度下觀察到trp操縱子的表達(dá)水平相差約600倍，然而阻遏作用僅使轉(zhuǎn)錄降低70倍。v 此外，使阻遏物失活突變不能完全消除色氨酸對trp操

44、縱子表達(dá)的影響。v 顯然，trp操縱子的這種調(diào)控與阻遏物的控制無關(guān)，必然還有其他調(diào)控機(jī)制。通過缺失突變株的研究發(fā)現(xiàn)，這種調(diào)控機(jī)制就是弱化作用(attenuation)。 1、弱化子： dna中可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄過早終止的一段核苷酸序列（123-150區(qū)）。123150v 阻遏-操縱機(jī)制對色氨酸來說只是一個(gè)一級開關(guān)，主管轉(zhuǎn)錄是否啟動(dòng)，相當(dāng)于trp操縱子的粗調(diào)開關(guān)。v trp操縱子中對應(yīng)于色氨酸生物合成的還有另一個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)調(diào)控并決定已經(jīng)啟動(dòng)的轉(zhuǎn)錄是否繼續(xù)下去。在這個(gè)系統(tǒng)中，酶的濃度根據(jù)氨基酸濃度的變化而受到調(diào)節(jié)。v 這個(gè)細(xì)微調(diào)控是通過轉(zhuǎn)錄達(dá)到第一個(gè)結(jié)構(gòu)基因之前的過早終止來實(shí)現(xiàn)的，細(xì)胞中色氨酸的濃度是實(shí)現(xiàn)

45、過早終止的根本原因。v 在trp mrna 5端trpe基因的起始密碼前有一個(gè)長162bp的mrna片段被稱為前導(dǎo)區(qū)，其中123-150位堿基序列如果缺失，trp基因表達(dá)可提高6-10倍。v 當(dāng)mrna合成起始以后，除非培養(yǎng)基中完全沒有色氨酸，轉(zhuǎn)錄總是在這個(gè)區(qū)域終止，產(chǎn)生一個(gè)僅有140個(gè)核苷酸的rna分子，終止trp基因轉(zhuǎn)錄，這就是123-150區(qū)序列缺失會(huì)提高trp基因表達(dá)的原因。v 因?yàn)檗D(zhuǎn)錄終止發(fā)生在這一區(qū)域，并且這種終止是被調(diào)節(jié)的，這個(gè)區(qū)域就被稱為弱化子。v 研究引起終止的mrna堿基序列，發(fā)現(xiàn)該區(qū)mrna通過自我配對可以形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，有典型的終止子特點(diǎn)。6322 前導(dǎo)肽前導(dǎo)肽v 實(shí)驗(yàn)

46、表明衰減作用需要負(fù)載trnatrp參與，這意味著前導(dǎo)序列的某些部分被翻譯了。v 分析前導(dǎo)序列發(fā)現(xiàn)，它包括起始密碼子aug和終止密碼子uga；如果翻譯起始于aug，應(yīng)該產(chǎn)生一個(gè)含有14個(gè)氨基酸的多肽。這個(gè)假設(shè)的多肽被稱為前導(dǎo)肽。v 有證據(jù)表明事實(shí)上可能存在這個(gè)多肽，因?yàn)樵谠揳ug位點(diǎn)5上游端有一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)，而前導(dǎo)肽編碼區(qū)與trpe基因5端融合可產(chǎn)生一種融合蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有與前導(dǎo)肽同樣的n末端序列。v前導(dǎo)序列具有一個(gè)非常有意義的特點(diǎn):v在其第10和第11位上有相鄰的兩個(gè)色氨酸密碼子。 在組氨酸操縱子中，也具有弱化子，也具有一個(gè)類似的能編碼前導(dǎo)肽的堿基序列，此序列中含有7個(gè)相鄰的組氨酸密碼

47、子。 苯丙氨酸操縱子中同樣存在弱化子結(jié)構(gòu)，其前導(dǎo)序列中也有7個(gè)苯內(nèi)氨酸密碼子。 這些密碼子參與了trp及其他操縱子中的轉(zhuǎn)錄弱化機(jī)制。6323 mrna前導(dǎo)區(qū)的序列分析前導(dǎo)區(qū)的序列分析v trp前導(dǎo)區(qū)的堿基序列的4個(gè)分別以1、2、3和4表示的片段能以兩種不同的方式進(jìn)行堿基配對，有時(shí)以1-2和3-4配對，有時(shí)只以2-3方式互補(bǔ)配對。v rnase t1降解實(shí)驗(yàn) (此酶不能水解配對的rna)表明，純化的trp前導(dǎo)序列中確有1-2和3-4的配對方式;v 由此定位的3-4配對區(qū)正好位于終止密碼子的識別區(qū)，當(dāng)這個(gè)區(qū)域發(fā)生破壞自我配對的堿基突變時(shí)有利于轉(zhuǎn)錄的繼續(xù)進(jìn)行。6324 轉(zhuǎn)錄弱化作用轉(zhuǎn)錄弱化作用v 轉(zhuǎn)

48、錄的弱化理論認(rèn)為:mrna轉(zhuǎn)錄的終止是通過前導(dǎo)肽基因的翻譯來調(diào)節(jié)的。v 因?yàn)樵谇皩?dǎo)肽基因中有兩個(gè)相鄰的色氨酸密碼子，所以這個(gè)前導(dǎo)肽的翻譯必定對trnatrp的濃度敏感。v 當(dāng)培養(yǎng)基中色氨酸的濃度很低時(shí)，負(fù)載有色氨酸的trnatrp也就少，這樣翻譯通過兩個(gè)相鄰色氨酸密碼子的速度就會(huì)很慢，當(dāng)4區(qū)被轉(zhuǎn)錄完成時(shí)，核糖體才進(jìn)行到1區(qū)(或停留在兩個(gè)相鄰的trp密碼子處)，這時(shí)的前導(dǎo)區(qū)結(jié)構(gòu)是2-3配對，不形成3-4配對的終止結(jié)構(gòu)，所以轉(zhuǎn)錄可繼續(xù)進(jìn)行，直到將trp操縱子中的結(jié)構(gòu)基因全部轉(zhuǎn)錄。the trp attenuator:3、弱化機(jī)制、弱化機(jī)制v 而當(dāng)培養(yǎng)基中色氨酸濃度高時(shí)，核糖體可順利通過兩個(gè)相鄰的色

49、氨酸密碼子，在4區(qū)被轉(zhuǎn)錄之前，核糖體就到達(dá)2區(qū)，這樣使2-3不能配對，3-4區(qū)可以自由配對形成莖-環(huán)狀終止子結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停止，trp操縱子中的結(jié)構(gòu)基因被關(guān)閉而不再合成色氨酸。v 所以，弱化子對rna聚合酶的影響依賴于前導(dǎo)肽翻譯中核糖體所處的位置。v 已從大腸桿菌和沙門氏菌中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了不少具有弱化作用的操縱子，它們都具有前導(dǎo)肽，并且前導(dǎo)肽中都富含該操縱子所合成的那種氨基酸。633 trp操縱子弱化機(jī)制的實(shí)驗(yàn)依據(jù)操縱子弱化機(jī)制的實(shí)驗(yàn)依據(jù)v 在含有較高濃度色氨酸的培養(yǎng)基中，色氨酰-trna合成酶缺陷型大腸桿菌中trp操縱子結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)卻并沒有完全受到抑制。v 進(jìn)一步研究溫度敏感突變株trps5證實(shí)，

50、它所編碼的trp-trna合成酶只在30時(shí)有活性，能使色氨酸活化生成trnatrp，在42時(shí)該酶沒有活性。v 比較野生型和突變型在42和30條件下有色氨酸供應(yīng)時(shí)鄰氨基苯甲酸合酶(trpe)的活性發(fā)現(xiàn):v 30時(shí)，色氨酰-trna合成酶有活性，可生成trnatrp，trp操縱子結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)受抑制；v 在42時(shí)，色氨酰-trna合成酶失去活性，不能生成trnatrp，trp結(jié)構(gòu)基因表達(dá)受抑制的程度就不明顯。v 野生型大腸桿菌色氨酰-trna合成酶不受溫度控制，所以trp基因表達(dá)基本不受溫度影響。v 研究另一個(gè)前導(dǎo)區(qū)及研究另一個(gè)前導(dǎo)區(qū)及d基因缺失的基因缺失的trp操縱子突變體操縱子突變體(trpl

51、d102)還發(fā)現(xiàn)，該細(xì)菌在補(bǔ)充了過量色氨酸的培養(yǎng)基還發(fā)現(xiàn)，該細(xì)菌在補(bǔ)充了過量色氨酸的培養(yǎng)基中有高于野生型親本株系中有高于野生型親本株系8-10倍的色氨酸合成酶活性，這倍的色氨酸合成酶活性，這種去阻遏作用不論在種去阻遏作用不論在trpr+或或trpr-菌株中都存在。菌株中都存在。 trped53trped53的的l l區(qū)中不缺失弱化子，而區(qū)中不缺失弱化子，而trpld102ltrpld102l區(qū)中缺失弱化子。區(qū)中缺失弱化子。缺失前導(dǎo)區(qū)后的表達(dá)比有前導(dǎo)區(qū)的表達(dá)要高得多，充分說明缺失前導(dǎo)區(qū)后的表達(dá)比有前導(dǎo)區(qū)的表達(dá)要高得多，充分說明trptrp操縱子操縱子的表達(dá)調(diào)控除阻遏作用外，還受到前導(dǎo)區(qū)的影響，失

52、去了這個(gè)因素就失的表達(dá)調(diào)控除阻遏作用外，還受到前導(dǎo)區(qū)的影響，失去了這個(gè)因素就失去了一個(gè)調(diào)控機(jī)制。去了一個(gè)調(diào)控機(jī)制。v trpl29是增強(qiáng)終止的突變型，它的前導(dǎo)序列第29位核苷酸由原來的g變?yōu)閍，aug aua,aug是前導(dǎo)肽的起始密碼，變?yōu)閍ua后便不能起始蛋白質(zhì)合成，有利于trp mrna形成12、34穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)終止。v 這一突變型的鄰氨基苯甲酸合成酶活性很低，并且對色氨酸不敏感。因?yàn)榍皩?dǎo)肽根本不能翻譯下去，即使在色氨酸饑餓條件下仍然不能作出解除終止的反應(yīng)。v 另一個(gè)增強(qiáng)終止的突變型是trpl75，其75位上的g變成了a。野生型75位上的g在2區(qū)內(nèi)，它可以與3區(qū)內(nèi)118位上的c

53、形成氫鍵，當(dāng)g變?yōu)閍后，減弱了2區(qū)和3區(qū)形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的能力，導(dǎo)致終止增強(qiáng)，trpl75對色氨酸饑餓不能作出反應(yīng)。v 此外，缺失了3端4個(gè)u的突變株atrplc1419，也導(dǎo)致終止解除，說明3端u對轉(zhuǎn)錄終止起作用。v細(xì)菌中為什么需要有弱化子系統(tǒng)？v 一般認(rèn)為:v 阻遏物從有活性向無活性的轉(zhuǎn)變速度較慢，需要有一個(gè)能更快地做出反應(yīng)的系統(tǒng)，以保持培養(yǎng)基中適當(dāng)?shù)纳彼崴?。v 弱化子能較快地通過抗終止的方法來增加trp基因表達(dá)，迅速提高內(nèi)源色氨酸濃度。v為什么還要有阻遏體系呢?v 沒有阻遏體系，似乎只有弱化也可以調(diào)節(jié)色氨酸酶系的合成。v 目前認(rèn)為阻遏物的作用是在有大量外源色氨酸存在時(shí)，阻止非必需的先導(dǎo)

54、mrna的合成，它使這個(gè)合成系統(tǒng)更加經(jīng)濟(jì)。v 事實(shí)上，自然界中存在著不同類型的合成體系。組氨酸操縱子擁有在功能上與trp操縱子完全相同的弱化子結(jié)構(gòu)，但沒有阻遏物，它的表達(dá)完全受弱化子調(diào)節(jié)。 細(xì)菌通過弱化作用彌補(bǔ)阻遏作用的不足，因?yàn)榧?xì)菌通過弱化作用彌補(bǔ)阻遏作用的不足，因?yàn)樽瓒糇饔弥荒苁棺瓒糇饔弥荒苁罐D(zhuǎn)錄不起始轉(zhuǎn)錄不起始，對于已經(jīng)起始的轉(zhuǎn)錄，對于已經(jīng)起始的轉(zhuǎn)錄，只能通過弱化作用使之中途停下來。只能通過弱化作用使之中途停下來。 阻遏作用的信號是阻遏作用的信號是細(xì)胞內(nèi)色氨酸的多少細(xì)胞內(nèi)色氨酸的多少； 弱化作用的信號則是弱化作用的信號則是細(xì)胞內(nèi)載有色氨酸的細(xì)胞內(nèi)載有色氨酸的trnatrna的多少的多少。

55、它通過前導(dǎo)肽的翻譯來控制轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行。它通過前導(dǎo)肽的翻譯來控制轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行. . 在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)這兩種作用相輔相成，體現(xiàn)著生在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)這兩種作用相輔相成，體現(xiàn)著生物體內(nèi)周密的調(diào)控作用。物體內(nèi)周密的調(diào)控作用。v 什么是操縱子（operon)?試說明色氨酸操縱子（trp operon)在原核基因表達(dá)調(diào)控中的調(diào)控機(jī)制和重要作用。 2003年武漢大學(xué)分子生物學(xué)試題6.4 其他操縱子(選學(xué)，不做要求）v 半乳糖操縱子v 阿拉伯糖操縱子v 阻遏蛋白lexa的降解與細(xì)菌中的sos應(yīng)答v 二組分調(diào)控系統(tǒng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)v 多啟動(dòng)子調(diào)控的操縱子半乳糖操縱子v大腸桿菌半乳糖操縱子包括大腸桿菌半乳糖操縱子包括3 3個(gè)結(jié)構(gòu)基因

56、：個(gè)結(jié)構(gòu)基因：v gal e: 異構(gòu)酶（udp-galactose-4-epimerase)v gal t: 半乳糖-磷酸尿嘧啶轉(zhuǎn)移酶（galactose transferase)v gal k:半乳糖激酶（galactose kinase)v作用：使半乳糖變?yōu)槠咸烟?1-p。v 半乳糖半乳糖 v 半乳糖激酶（半乳糖激酶（k)v 半乳糖半乳糖-1-p v udp轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移酶v udp-半乳糖半乳糖v 差向異構(gòu)酶差向異構(gòu)酶v udpgv g v半乳糖操縱子的調(diào)節(jié)基因是半乳糖操縱子的調(diào)節(jié)基因是galrgalr，位于遺傳圖上，位于遺傳圖上55min55min處。處。vgalgal操縱子中操縱子中g(shù)a

57、lrgalr與與galegale、t t、k k及操縱區(qū)及操縱區(qū)o o等的距離都很遠(yuǎn)，等的距離都很遠(yuǎn)，而而galrgalr產(chǎn)物對產(chǎn)物對galgalo o的作用與的作用與laci-laclaci-laco o的作用相同。的作用相同。v在在galrgalr- -和和galogaloc c突變體中，突變體中，e e、t t、k k基因得到組成性表達(dá)?；虻玫浇M成性表達(dá)。galgal操縱子的誘導(dǎo)物主要是半乳糖。操縱子的誘導(dǎo)物主要是半乳糖。gal操縱子的特點(diǎn)：操縱子的特點(diǎn)： 它有兩個(gè)啟動(dòng)子，其它有兩個(gè)啟動(dòng)子，其mrna可從兩個(gè)不可從兩個(gè)不同的起始點(diǎn)開始轉(zhuǎn)錄；同的起始點(diǎn)開始轉(zhuǎn)錄； 它有兩個(gè)它有兩個(gè)o區(qū)，一

58、個(gè)在區(qū)，一個(gè)在p區(qū)上游，另一個(gè)區(qū)上游，另一個(gè)在結(jié)構(gòu)基因在結(jié)構(gòu)基因gale內(nèi)部。內(nèi)部。camp-crp對對gal啟動(dòng)子的作用啟動(dòng)子的作用v 因?yàn)榘肴樘堑睦眯时绕咸烟堑?，人們猜想葡萄糖存在時(shí)半乳糖操縱子不被誘導(dǎo)。v 但實(shí)際上有葡萄糖存在時(shí)，gal操縱子仍可被誘導(dǎo)。v 現(xiàn)已分離到一些突變株:v 其中一類突變株能在不含葡萄糖的培養(yǎng)基中高水平合成半乳糖代謝酶類(gal結(jié)構(gòu)基因高效表達(dá))；v 另一類突變株中，gal基因的表達(dá)完全依賴于葡萄糖。培養(yǎng)基中如無葡萄糖存在，這些細(xì)菌的gal基因不表達(dá)，不合成半乳糖代謝酶類。 v 分析gal操縱子p-o區(qū)的堿基序列發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)相距僅為5bp的啟動(dòng)子，gal操縱子可

59、以從兩個(gè)啟動(dòng)子分別起始基因轉(zhuǎn)錄，每個(gè)啟動(dòng)子擁有各自的rna聚合酶結(jié)合位點(diǎn)s1和s2。v campcamp-crp-crp對從對從s s1 1和和s s2 2起始的轉(zhuǎn)錄有不同的作用。起始的轉(zhuǎn)錄有不同的作用。v 從s1起始的轉(zhuǎn)錄只有在培養(yǎng)基中無葡萄糖時(shí)才能順利進(jìn)行，rna聚合酶與s1的結(jié)合需要半乳糖、crp和較高濃度的camp。v 當(dāng)腺苷環(huán)化酶突變(cya-)或camp受體蛋白突變(crp-)時(shí)，gal操縱子不能從s1起始轉(zhuǎn)錄，此時(shí)如在體外系統(tǒng)中加入camp-crp，就能夠誘發(fā)從s1起始的轉(zhuǎn)錄。 v 體外轉(zhuǎn)錄的實(shí)驗(yàn)證明，camp-crp能夠刺激gal操縱子轉(zhuǎn)錄。v 用含有g(shù)al操縱子調(diào)節(jié)區(qū)的dna

60、片段作模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄時(shí)，發(fā)現(xiàn)camp-crp抑制從s2的轉(zhuǎn)錄而刺激從s1的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)有camp-crp時(shí)，轉(zhuǎn)錄從s1開始，當(dāng)無camp-crp時(shí)，轉(zhuǎn)錄從s2開始。v 從s2起始的轉(zhuǎn)錄則完全依賴于葡萄糖，高水平的camp-crp能抑制由這個(gè)啟動(dòng)子起始的轉(zhuǎn)錄，因此，camp-crp在gal操縱子中所起的調(diào)節(jié)作用比在lac操縱子中更為復(fù)雜。v 大腸桿菌的cya-或crp-突變型不能利用乳糖，但可以利用半乳糖作為惟一碳源。v 有一個(gè)gal啟動(dòng)子突變株，不能利用培養(yǎng)基中的半乳糖，若將此突變株再行突變?yōu)閏ya-或crp-，細(xì)胞就恢復(fù)了利用半乳糖的能力。v 因?yàn)榈谝淮瓮蛔兪チ藦膕1起始轉(zhuǎn)錄的能力，卻不影響