第五章植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)

1、 第第 十十 章章 植物細(xì)胞及原生質(zhì)體培養(yǎng)植物細(xì)胞及原生質(zhì)體培養(yǎng)一、植物細(xì)胞培養(yǎng)一、植物細(xì)胞培養(yǎng)： 在一定條件下，通過(guò)人工供給營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及生長(zhǎng)在一定條件下，通過(guò)人工供給營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及生長(zhǎng)因子，使離體植物細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的方法。因子，使離體植物細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的方法。 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)主要用于研究細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)主要用于研究細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育與分化等理論以及用于植物次生代謝物質(zhì)生產(chǎn)。分化等理論以及用于植物次生代謝物質(zhì)生產(chǎn)。（一）細(xì)胞培養(yǎng)（一）細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)的特性：的特性： 1. 植物細(xì)胞較微生物細(xì)胞大，具有纖維素細(xì)植物細(xì)胞較微生物細(xì)胞大，具有纖維素細(xì)胞壁，抗剪切力差；胞壁，抗剪切力差

2、； 2. 細(xì)胞生長(zhǎng)速度慢，易受微生物污染，有時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)速度慢，易受微生物污染，有時(shí)需用抗生素；需用抗生素； 3. 細(xì)胞生長(zhǎng)的中期及對(duì)數(shù)期，易凝聚為直徑細(xì)胞生長(zhǎng)的中期及對(duì)數(shù)期，易凝聚為直徑達(dá)達(dá)350 um一一400 um 的團(tuán)塊，懸浮培養(yǎng)較困難；的團(tuán)塊，懸浮培養(yǎng)較困難； 4. 培養(yǎng)時(shí)需供氧，培養(yǎng)液粘度大，不能耐受培養(yǎng)時(shí)需供氧，培養(yǎng)液粘度大，不能耐受強(qiáng)力通風(fēng)攪拌；并具有群體效應(yīng)強(qiáng)力通風(fēng)攪拌；并具有群體效應(yīng) 5. 培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物滯留于細(xì)胞內(nèi)，且產(chǎn)量較低，培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物滯留于細(xì)胞內(nèi)，且產(chǎn)量較低，培養(yǎng)過(guò)程具有結(jié)構(gòu)與功能全能性。培養(yǎng)過(guò)程具有結(jié)構(gòu)與功能全能性。1 1(二二) 植物細(xì)胞培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求及培養(yǎng)基植物細(xì)

3、胞培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求及培養(yǎng)基. 營(yíng)養(yǎng)需求：營(yíng)養(yǎng)需求： 植物細(xì)胞生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)較微生物細(xì)胞復(fù)雜，植物細(xì)胞生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)較微生物細(xì)胞復(fù)雜，除水分外，其它營(yíng)養(yǎng)成分可分為如下幾類(lèi)除水分外，其它營(yíng)養(yǎng)成分可分為如下幾類(lèi)： (1) 無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng): 如如n、 p、k、ca、mg、fe、cu、mn、zn、b、mo、i等；等； (2)維生素維生素：如維生素：如維生素b1、b6、煙酸、肌醇、生物素、泛酸鈣及葉酸等；、煙酸、肌醇、生物素、泛酸鈣及葉酸等； (3) 碳源碳源: 如蔗糖、葡萄糖、木糖、甘露糖及山梨醇等；如蔗糖、葡萄糖、木糖、甘露糖及山梨醇等； (4)天然物天然物: 如水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰乳、酵母提取液、

4、香蕉汁、如水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰乳、酵母提取液、香蕉汁、荸薺汁、生梨汁及蘋(píng)果汁等；荸薺汁、生梨汁及蘋(píng)果汁等； (5) 植物激素植物激素: 如生長(zhǎng)素如生長(zhǎng)素 、赤霉素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、細(xì)胞分裂素 、脫落酸；其它有油、脫落酸；其它有油菜素內(nèi)酯、三十烷醇、肽類(lèi)、半支蓮醇、月光花素、石蒜素、玉米素菜素內(nèi)酯、三十烷醇、肽類(lèi)、半支蓮醇、月光花素、石蒜素、玉米素等；等；(6)氨基酸類(lèi)氨基酸類(lèi): 如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、絲氨酸、賴氨酸、亮如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、絲氨酸、賴氨酸、亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、組氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氯酸、蘇氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、組氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、蘇

5、氯酸、蘇氨酸、酪氨釀、精氨酸、丙氨酸及半胱氨酸等；氨酸、酪氨釀、精氨酸、丙氨酸及半胱氨酸等；(7) 核酸及其水解物核酸及其水解物: 如如dna、rna、黃嘌呤、次黃嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤、腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤及胸腺嘧啶等；鳥(niǎo)嘌呤及胸腺嘧啶等；(8) 其它成分其它成分: 如氯化膽堿、膽質(zhì)素、膠氨酸、蘋(píng)果酸及反丁烯二酸等如氯化膽堿、膽質(zhì)素、膠氨酸、蘋(píng)果酸及反丁烯二酸等. 2. 培養(yǎng)基：培養(yǎng)基： (1)固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基：添加瓊脂等：添加瓊脂等 (2) 液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基：不加瓊脂等：不加瓊脂等(三三) 植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 實(shí)驗(yàn)室中有懸浮培養(yǎng)、固相化培養(yǎng)、單細(xì)胞培實(shí)驗(yàn)室中有懸浮培

6、養(yǎng)、固相化培養(yǎng)、單細(xì)胞培養(yǎng)（微室培養(yǎng)、平板培養(yǎng)、看護(hù)培養(yǎng)、懸滴培養(yǎng)、養(yǎng)（微室培養(yǎng)、平板培養(yǎng)、看護(hù)培養(yǎng)、懸滴培養(yǎng)、微滴培養(yǎng)）等多種培養(yǎng)方式。微滴培養(yǎng)）等多種培養(yǎng)方式。1. 懸浮培養(yǎng)法：懸浮培養(yǎng)法： 植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)(cell suspension culture) 即植物細(xì)胞或小的細(xì)胞聚集體在液即植物細(xì)胞或小的細(xì)胞聚集體在液體培養(yǎng)基中于搖床體培養(yǎng)基中于搖床 上進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，這些上進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，這些細(xì)胞和小的聚集體來(lái)自愈傷組織，某個(gè)器官細(xì)胞和小的聚集體來(lái)自愈傷組織，某個(gè)器官或組織，甚至幼嫩的植株，通過(guò)物理或化學(xué)或組織，甚至幼嫩的植株，通過(guò)物理或化學(xué)的方法進(jìn)行分離而獲得。的方法進(jìn)行分

7、離而獲得。 (1) 優(yōu)良的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系必需滿足：優(yōu)良的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系必需滿足： a. 懸浮培養(yǎng)物分散性好，細(xì)胞團(tuán)較小，一般由幾十懸浮培養(yǎng)物分散性好，細(xì)胞團(tuán)較小，一般由幾十個(gè)以下的細(xì)胞組成。個(gè)以下的細(xì)胞組成。 b. 均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同。均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同。 c. 生長(zhǎng)迅速，懸浮細(xì)胞的量一般生長(zhǎng)迅速，懸浮細(xì)胞的量一般23天甚至更短時(shí)天甚至更短時(shí)間便可增加一間便可增加一。(2) 培養(yǎng)過(guò)程：培養(yǎng)過(guò)程：將愈傷組織、無(wú)菌苗、吸漲胚胎或外植體芽尖、根將愈傷組織、無(wú)菌苗、吸漲胚胎或外植體芽尖、根尖及葉肉組織，經(jīng)勻漿器破碎、紗布或不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾，尖及葉肉組織，經(jīng)勻漿器

8、破碎、紗布或不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾，單細(xì)胞濾液作為按種材料，接種于液體培養(yǎng)基中振蕩培單細(xì)胞濾液作為按種材料，接種于液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。養(yǎng)。(3) 懸浮培養(yǎng)特點(diǎn)：懸浮培養(yǎng)特點(diǎn)：培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞總數(shù)不斷增加，一定時(shí)間后產(chǎn)量達(dá)培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞總數(shù)不斷增加，一定時(shí)間后產(chǎn)量達(dá)最高點(diǎn)，生長(zhǎng)趨于停止。然后進(jìn)行移植繼代培養(yǎng)，其過(guò)最高點(diǎn)，生長(zhǎng)趨于停止。然后進(jìn)行移植繼代培養(yǎng)，其過(guò)程表現(xiàn)出嚴(yán)格可重復(fù)周期性變化，細(xì)胞增長(zhǎng)規(guī)律與微生程表現(xiàn)出嚴(yán)格可重復(fù)周期性變化，細(xì)胞增長(zhǎng)規(guī)律與微生物相同，有延遲期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、減慢期及靜止期等階物相同，有延遲期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、減慢期及靜止期等階段。植物細(xì)胞接種時(shí)要達(dá)到一定細(xì)胞濃度，通常為段。植物細(xì)胞接

9、種時(shí)要達(dá)到一定細(xì)胞濃度，通常為0. 25 x l0細(xì)胞細(xì)胞ml 一一0. 5 x 10細(xì)胞細(xì)胞m1。 (4)懸浮培養(yǎng)類(lèi)型：懸浮培養(yǎng)類(lèi)型： a. 成批培養(yǎng)成批培養(yǎng)(batch culture)： 成批培養(yǎng)是在一個(gè)封閉的系統(tǒng)中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)成批培養(yǎng)是在一個(gè)封閉的系統(tǒng)中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞材料生長(zhǎng)在已固定體積的培養(yǎng)基中。隨著細(xì)胞數(shù)量的胞材料生長(zhǎng)在已固定體積的培養(yǎng)基中。隨著細(xì)胞數(shù)量的增加，培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)的消耗及某些其他因子的積累會(huì)使細(xì)增加，培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)的消耗及某些其他因子的積累會(huì)使細(xì)胞停止生長(zhǎng)。胞停止生長(zhǎng)。 繼代培養(yǎng)需取出少量培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于新鮮培養(yǎng)液中。生繼代培養(yǎng)需取出少量培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于新鮮培養(yǎng)液中。生長(zhǎng)過(guò)程包

10、括延遲期、指數(shù)期、靜止期等。長(zhǎng)過(guò)程包括延遲期、指數(shù)期、靜止期等。 分緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)（分緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)（1-2rpm）、震蕩培養(yǎng)（）、震蕩培養(yǎng)（100rpm）、）、快速轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)（快速轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)（80-120rpm）和攪拌培養(yǎng)。）和攪拌培養(yǎng)。b. 連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)(continuous culture): 是用一定容積的非密閉系統(tǒng)進(jìn)行是用一定容積的非密閉系統(tǒng)進(jìn)行 細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)的方法，在培養(yǎng)過(guò)程中不斷注入新鮮培養(yǎng)基，而使方法，在培養(yǎng)過(guò)程中不斷注入新鮮培養(yǎng)基，而使?fàn)I養(yǎng)物連續(xù)得到補(bǔ)充，細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖連續(xù)進(jìn)行，營(yíng)養(yǎng)物連續(xù)得到補(bǔ)充，細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖連續(xù)進(jìn)行，同時(shí)有等體積的培養(yǎng)物排除系統(tǒng)。同時(shí)有等體積的培養(yǎng)物排

11、除系統(tǒng)。 最大特點(diǎn)是細(xì)胞生長(zhǎng)速率標(biāo)準(zhǔn)一致，新形成最大特點(diǎn)是細(xì)胞生長(zhǎng)速率標(biāo)準(zhǔn)一致，新形成的細(xì)胞補(bǔ)償了被排出的細(xì)胞，系統(tǒng)內(nèi)細(xì)胞密度、的細(xì)胞補(bǔ)償了被排出的細(xì)胞，系統(tǒng)內(nèi)細(xì)胞密度、生長(zhǎng)速度、化學(xué)成分、細(xì)胞代謝活性都維持恒定。生長(zhǎng)速度、化學(xué)成分、細(xì)胞代謝活性都維持恒定。可通過(guò)改變培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件建立恒定系統(tǒng)?？赏ㄟ^(guò)改變培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件建立恒定系統(tǒng)。 恒化控制：通過(guò)營(yíng)養(yǎng)液或某一成分恒化控制：通過(guò)營(yíng)養(yǎng)液或某一成分 恒濁控制：比濁計(jì)測(cè)定渾濁度而進(jìn)行流量控恒濁控制：比濁計(jì)測(cè)定渾濁度而進(jìn)行流量控制。制。2. 固相化培養(yǎng)技術(shù)：固相化培養(yǎng)技術(shù)： 細(xì)胞固定在一定的惰性基質(zhì)中，如瓊脂、海藻酸細(xì)胞固定在一定的惰性基質(zhì)中，如瓊

12、脂、海藻酸鹽、聚丙烯酰氨纖維膜上，細(xì)胞不能運(yùn)動(dòng)，但營(yíng)養(yǎng)液鹽、聚丙烯酰氨纖維膜上，細(xì)胞不能運(yùn)動(dòng)，但營(yíng)養(yǎng)液可以在基質(zhì)中流動(dòng)。可以在基質(zhì)中流動(dòng)。（1）固相化培養(yǎng)的特點(diǎn)：）固相化培養(yǎng)的特點(diǎn)： a. 消除剪切力；消除剪切力； b. 細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，促進(jìn)次生代謝過(guò)程細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，促進(jìn)次生代謝過(guò)程； c. 細(xì)胞之間緊密接觸，形成梯度，利于產(chǎn)物積細(xì)胞之間緊密接觸，形成梯度，利于產(chǎn)物積累；累； d. 便于操作，不易污染。便于操作，不易污染。 e. 便于產(chǎn)物收集。便于產(chǎn)物收集。(2) 固相化培養(yǎng)系統(tǒng)：固相化培養(yǎng)系統(tǒng)： a. 平床培養(yǎng)：平床培養(yǎng)：生長(zhǎng)慢，代謝產(chǎn)物多，但不易放大。生長(zhǎng)慢，代謝產(chǎn)物多，但不易放大。 b.

13、填充床培養(yǎng)：填充床培養(yǎng)：條件控制困難。條件控制困難。 c. 膜生物反應(yīng)器：膜生物反應(yīng)器：采用一定孔徑和選擇透性膜來(lái)采用一定孔徑和選擇透性膜來(lái)固定營(yíng)養(yǎng)物，營(yíng)養(yǎng)物可以通過(guò)膜滲透到細(xì)胞中固定營(yíng)養(yǎng)物，營(yíng)養(yǎng)物可以通過(guò)膜滲透到細(xì)胞中。3.單細(xì)胞培養(yǎng)：對(duì)單離的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的方單細(xì)胞培養(yǎng)：對(duì)單離的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的方法。法。（1）平板培養(yǎng)法：分散的植物細(xì)胞接種于含薄層固）平板培養(yǎng)法：分散的植物細(xì)胞接種于含薄層固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)過(guò)程稱為平板培養(yǎng)法。體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)過(guò)程稱為平板培養(yǎng)法。 方法是將經(jīng)機(jī)械破碎過(guò)篩或酶方法是將經(jīng)機(jī)械破碎過(guò)篩或酶(纖維素酶及果膠酶纖維素酶及果膠酶等等)消化分散的細(xì)胞，洗滌離心

14、除酶，細(xì)胞濃縮物經(jīng)消化分散的細(xì)胞，洗滌離心除酶，細(xì)胞濃縮物經(jīng)計(jì)數(shù)及稀釋?zhuān)臃N到加熱熔化而剛冷卻至計(jì)數(shù)及稀釋?zhuān)臃N到加熱熔化而剛冷卻至35左有左有的固體培養(yǎng)基中充分混勻，傾入培養(yǎng)皿中，石蠟密的固體培養(yǎng)基中充分混勻，傾入培養(yǎng)皿中，石蠟密封，于封，于25含含5co2空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞即空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞即可生長(zhǎng)成團(tuán)。可生長(zhǎng)成團(tuán)。（2）看護(hù)培養(yǎng)法：從懸浮培養(yǎng)物或脆弱愈傷組織上）看護(hù)培養(yǎng)法：從懸浮培養(yǎng)物或脆弱愈傷組織上用針或玻璃毛細(xì)管分離單細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞放在一個(gè)用針或玻璃毛細(xì)管分離單細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞放在一個(gè)方形濾紙片的上表面，而濾紙片放在活躍生長(zhǎng)的愈方形濾紙片的上表面，而濾紙片放在活躍生長(zhǎng)的愈

15、傷組織上進(jìn)行培養(yǎng)的方法。傷組織上進(jìn)行培養(yǎng)的方法。（3）微室培養(yǎng)法：懸）微室培養(yǎng)法：懸浮單細(xì)胞接種于凹玻浮單細(xì)胞接種于凹玻片或玻璃環(huán)與蓋玻片片或玻璃環(huán)與蓋玻片組成的微室內(nèi)的固體組成的微室內(nèi)的固體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)方法。培養(yǎng)基中的培養(yǎng)方法。（四）細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程：（四）細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程： 1. 擇適宜的外植體；擇適宜的外植體； 2. 誘導(dǎo)疏松愈傷組織；誘導(dǎo)疏松愈傷組織； 3. 選擇適宜的培養(yǎng)基；選擇適宜的培養(yǎng)基； 4. 懸浮培養(yǎng)；懸浮培養(yǎng)； 5. 懸浮細(xì)胞的繼代與選擇；懸浮細(xì)胞的繼代與選擇； 6. 懸浮細(xì)胞的同步化；懸浮細(xì)胞的同步化； 7. 懸浮愈傷組織形成及植株再生。懸浮愈傷組織形成及植株再生。 水稻細(xì)胞懸

16、浮培養(yǎng)及植株再生：水稻細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及植株再生： 1.愈傷組織的誘導(dǎo)：愈傷組織的誘導(dǎo)： (1)取水稻種子，人工去皮后用取水稻種子，人工去皮后用70酒精表面消毒酒精表面消毒2分鐘，再用分鐘，再用25次氯酸鈉水溶液浸泡并輕輕攪動(dòng)次氯酸鈉水溶液浸泡并輕輕攪動(dòng)30分鐘。分鐘。 (2)將種子用無(wú)菌蒸餾水沖洗將種子用無(wú)菌蒸餾水沖洗3次，按每瓶次，按每瓶3粒接入粒接入附加附加2mgl 2，4d、3蔗糖、蔗糖、03酵母提取酵母提取物的物的ms固體培養(yǎng)基中，固體培養(yǎng)基中，25黑暗下培養(yǎng)、誘導(dǎo)愈傷黑暗下培養(yǎng)、誘導(dǎo)愈傷組織。組織。 (3) 3周后，將從胚部長(zhǎng)出的愈傷組織切割，并轉(zhuǎn)移周后，將從胚部長(zhǎng)出的愈傷組織切割，并

17、轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，每到新鮮培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，每2周繼代周繼代1次。次。 (4)挑選疏松、易碎的愈傷組織進(jìn)行繼代、增殖挑選疏松、易碎的愈傷組織進(jìn)行繼代、增殖 2單細(xì)胞分離單細(xì)胞分離 (1)愈傷組織的細(xì)胞計(jì)數(shù)：取愈傷組織的細(xì)胞計(jì)數(shù)：取1g幼嫩、新鮮的愈傷組織幼嫩、新鮮的愈傷組織以以1：10(wv)加入加入o1(wv)的果膠酶的果膠酶(溶于培養(yǎng)液或溶于培養(yǎng)液或06 mol/l 的甘露醇溶液中，的甘露醇溶液中，ph35)。25， 黑暗下靜置黑暗下靜置1216小時(shí)，再用電磁攪拌器低速攪拌幾分鐘即可獲的細(xì)小時(shí)，再用電磁攪拌器低速攪拌幾分鐘即可獲的細(xì)胞懸浮液，然后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。胞懸浮液，然后用

18、血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。 (2)單細(xì)胞的機(jī)械分離。稱取適量的愈傷組織，放入適量液?jiǎn)渭?xì)胞的機(jī)械分離。稱取適量的愈傷組織，放入適量液體培養(yǎng)基的三角瓶在體培養(yǎng)基的三角瓶在120 r分、分、25，黑暗下懸浮培養(yǎng)。，黑暗下懸浮培養(yǎng)。 (3)懸浮液過(guò)濾：愈傷組織塊在液體培養(yǎng)基中連續(xù)振蕩培懸浮液過(guò)濾：愈傷組織塊在液體培養(yǎng)基中連續(xù)振蕩培養(yǎng)養(yǎng)3周后，用大約周后，用大約10 0目的尼龍網(wǎng)過(guò)濾，經(jīng)過(guò)濾后可獲得目的尼龍網(wǎng)過(guò)濾，經(jīng)過(guò)濾后可獲得95左右的單細(xì)胞。左右的單細(xì)胞。 (4)單細(xì)胞收集。過(guò)濾液用單細(xì)胞收集。過(guò)濾液用150r分離心分離心5分鐘鐘，分鐘鐘， 收集單收集單細(xì)胞及小細(xì)胞團(tuán)。細(xì)胞及小細(xì)胞團(tuán)。3. 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)：細(xì)胞

19、懸浮培養(yǎng)： (1)計(jì)算細(xì)胞起始密度：離心后將計(jì)算細(xì)胞起始密度：離心后將23的上清液例掉，的上清液例掉，將剩余部分輕輕搖動(dòng)，使細(xì)胞均勻懸浮，取將剩余部分輕輕搖動(dòng)，使細(xì)胞均勻懸浮，取1滴懸浮滴懸浮液滴于血球計(jì)數(shù)板上，以游離單細(xì)胞為基數(shù)，計(jì)算液滴于血球計(jì)數(shù)板上，以游離單細(xì)胞為基數(shù)，計(jì)算細(xì)胞密度。細(xì)胞密度。 (2)測(cè)定細(xì)胞活力。測(cè)定細(xì)胞活力。 酚藏花紅染色法和二醋酸熒光素染色法：酚藏花紅染色法和二醋酸熒光素染色法： 先配制先配制o1酚藏花紅水溶液，溶劑為培養(yǎng)液，二醋酸熒酚藏花紅水溶液，溶劑為培養(yǎng)液，二醋酸熒光素則先用丙酮配成光素則先用丙酮配成5 mgml貯藏備用，使用時(shí)用貯藏備用，使用時(shí)用培養(yǎng)液稀釋為

20、培養(yǎng)液稀釋為0.01%的溶液的溶液.將培養(yǎng)物和二醋酸熒光將培養(yǎng)物和二醋酸熒光素溶液在載玻片上混合，再用素溶液在載玻片上混合，再用o1酚藏花紅水溶酚藏花紅水溶液作染料，滴一滴于載玻片上，與上述溶液混合，液作染料，滴一滴于載玻片上，與上述溶液混合，蓋上蓋玻片。酚藏花紅能將死細(xì)胞染成紅色，很快蓋上蓋玻片。酚藏花紅能將死細(xì)胞染成紅色，很快可在顯微鏡下觀察，可在顯微鏡下觀察，530分鐘后改用相差和熒光顯分鐘后改用相差和熒光顯微鏡，活細(xì)胞顯示較強(qiáng)的熒光反應(yīng)。微鏡，活細(xì)胞顯示較強(qiáng)的熒光反應(yīng)。(3)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的誘導(dǎo)：將離心管中近細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的誘導(dǎo)：將離心管中近l3的懸浮細(xì)胞的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物倒入三角瓶中，并根

21、據(jù)所需要的起始密度補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)物倒入三角瓶中，并根據(jù)所需要的起始密度補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，懸浮細(xì)胞在培養(yǎng)基，懸浮細(xì)胞在120轉(zhuǎn)分，轉(zhuǎn)分，25黑暗下培養(yǎng)。并定黑暗下培養(yǎng)。并定期計(jì)數(shù)細(xì)胞密度，計(jì)錄并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線期計(jì)數(shù)細(xì)胞密度，計(jì)錄并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 4細(xì)胞團(tuán)和愈傷組織的再形成及植核再生細(xì)胞團(tuán)和愈傷組織的再形成及植核再生 大約在懸浮培養(yǎng)大約在懸浮培養(yǎng)2周后，將細(xì)胞分裂形成的小愈傷組織周后，將細(xì)胞分裂形成的小愈傷組織團(tuán)塊團(tuán)塊(直徑約直徑約1525mm)及時(shí)轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上及時(shí)轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上(ms基本成分，附加基本成分，附加03酵母提取物，酵母提取物，03水解酪蛋白，水解酪蛋白，10mgl kt04

22、mgl naa及及70蔗糖蔗糖)。連續(xù)光照，。連續(xù)光照，空溫空溫25。3周后即可分化出試管苗。如果不及時(shí)轉(zhuǎn)移，周后即可分化出試管苗。如果不及時(shí)轉(zhuǎn)移，愈傷組織團(tuán)塊很快失去分化能力，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基后即停愈傷組織團(tuán)塊很快失去分化能力，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基后即停止生長(zhǎng)，變褐，死亡。止生長(zhǎng)，變褐，死亡。 三七細(xì)胞培養(yǎng)工藝：三七細(xì)胞培養(yǎng)工藝： 1. 工藝流程：工藝流程：2. 工藝過(guò)程：工藝過(guò)程： （1）培養(yǎng)基）培養(yǎng)基 植物愈傷組織誘導(dǎo)及培養(yǎng)所用培養(yǎng)植物愈傷組織誘導(dǎo)及培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為基為ms培養(yǎng)基，煙酸培養(yǎng)基，煙酸0. 5mg/l，肌醇，肌醇100 mg/l ，甘氨酸甘氨酸2.0mg/l及蔗糖及蔗糖30g/l ，

23、ph56ph58。 （2）三七種質(zhì)材料選擇與處理）三七種質(zhì)材料選擇與處理 取取34年生三七年生三七植株粗根，用自來(lái)水充分洗凈再用植株粗根，用自來(lái)水充分洗凈再用70乙醇沖乙醇沖洗表面后切成小塊，在洗表面后切成小塊，在70乙醇中浸泡乙醇中浸泡2min再轉(zhuǎn)再轉(zhuǎn)移至移至01升汞溶液中浸泡升汞溶液中浸泡20min然后用無(wú)菌水然后用無(wú)菌水沖洗沖洗45次，備用。次，備用。 （3）愈傷組織誘導(dǎo)與培養(yǎng)）愈傷組織誘導(dǎo)與培養(yǎng) ：將上述無(wú)菌三七粗：將上述無(wú)菌三七粗根小塊組織接種于含根小塊組織接種于含2mg/l的的2，4d、0.5mg/l kt 及及10椰子乳的椰子乳的ms固體培養(yǎng)基中，于固體培養(yǎng)基中，于25的的培養(yǎng)箱

24、中培養(yǎng)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40天，即可形成小的愈傷組織塊，天，即可形成小的愈傷組織塊，然后每隔然后每隔30天進(jìn)行一次繼代培養(yǎng)。每次繼代培養(yǎng)天進(jìn)行一次繼代培養(yǎng)。每次繼代培養(yǎng)均取一塊愈傷組織，如此多次繼代培養(yǎng)即可獲得均取一塊愈傷組織，如此多次繼代培養(yǎng)即可獲得多個(gè)愈傷組織無(wú)性系。多個(gè)愈傷組織無(wú)性系。 （4）細(xì)胞懸浮培養(yǎng)）細(xì)胞懸浮培養(yǎng): 培養(yǎng)基為含培養(yǎng)基為含l mg/l 2,4-d、0.05mg/l kt及及l(fā)0椰乳的椰乳的ms培養(yǎng)基培養(yǎng)基ph5.8。l00ml三角瓶的培養(yǎng)基裝量為三角瓶的培養(yǎng)基裝量為25ml，高壓滅菌，高壓滅菌20min冷卻后按冷卻后按1-2g/l干重接種愈傷組織愈干重接種愈傷組織愈傷組織切

25、成干重傷組織切成干重1mg 小塊。于小塊。于25搖床中以搖床中以120轉(zhuǎn)分鐘轉(zhuǎn)分鐘振蕩培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)30天，即得三七懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物。天，即得三七懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物。 （5）三七細(xì)胞大量培養(yǎng)：培養(yǎng)基與懸浮細(xì)胞培養(yǎng)相同。在）三七細(xì)胞大量培養(yǎng)：培養(yǎng)基與懸浮細(xì)胞培養(yǎng)相同。在l0l攪拌反應(yīng)器中加入培養(yǎng)液，培養(yǎng)液充滿系數(shù)為攪拌反應(yīng)器中加入培養(yǎng)液，培養(yǎng)液充滿系數(shù)為0.75一一0.80，滅菌后冷卻至室溫接種已培養(yǎng)滅菌后冷卻至室溫接種已培養(yǎng)2530天的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，接天的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，接種量按干細(xì)胞計(jì)為種量按干細(xì)胞計(jì)為12g/l，在，在2526下，以下，以60轉(zhuǎn)分鐘攪轉(zhuǎn)分鐘攪拌速度及拌速度及06vvmo8vvm(vv

26、m為每分鐘單位體積培養(yǎng)液中為每分鐘單位體積培養(yǎng)液中通入空氣的體積數(shù)通入空氣的體積數(shù))速度通氣，并維持速度通氣，并維持ph5.55.8培養(yǎng)培養(yǎng)30天，天，收獲細(xì)胞。收獲細(xì)胞。 （6）細(xì)胞收集及干燥：）細(xì)胞收集及干燥： 每批細(xì)胞培養(yǎng)每批細(xì)胞培養(yǎng)30天后，離心或過(guò)濾天后，離心或過(guò)濾收集細(xì)胞，用去離子水洗滌收集細(xì)胞，用去離子水洗滌3次，每次抽干，然后于次，每次抽干，然后于30一一40低溫下真空干燥或凍干，即得三七培養(yǎng)細(xì)胞成品。低溫下真空干燥或凍干，即得三七培養(yǎng)細(xì)胞成品。二、原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)：二、原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)： 通過(guò)一定方法除去細(xì)胞壁，而得到一個(gè)裸露通過(guò)一定方法除去細(xì)胞壁，而得到一個(gè)裸露的植物細(xì)胞，

27、即為原生質(zhì)體的植物細(xì)胞，即為原生質(zhì)體(protoplast)。游離。游離的原生質(zhì)體在一定條件下培養(yǎng)可以重新形成細(xì)胞的原生質(zhì)體在一定條件下培養(yǎng)可以重新形成細(xì)胞壁，并像正常的植物細(xì)胞那樣具有全能性，經(jīng)過(guò)壁，并像正常的植物細(xì)胞那樣具有全能性，經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)可以再生出完整植株。適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)可以再生出完整植株。a-e, 培養(yǎng)的歐當(dāng)歸培養(yǎng)的歐當(dāng)歸(levisticum officinale koch)原生質(zhì)體分裂再生成植株的過(guò)程原生質(zhì)體分裂再生成植株的過(guò)程 f-l, 培養(yǎng)過(guò)程的核變化；培養(yǎng)過(guò)程的核變化；f.多核，多核，g.核穿壁，核穿壁，h.無(wú)絲分裂，無(wú)絲分裂，i.染色體橋，染色體橋，j. 2n=22，k.

28、l.多倍體多倍體. a-d當(dāng)歸當(dāng)歸(angelica sinensis(oliv) diels)原生質(zhì)體培養(yǎng)成再生苗原生質(zhì)體培養(yǎng)成再生苗 e-h,紅豆草紅豆草(onobrychis vicaefolia scop) )原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株 原生質(zhì)體培養(yǎng)的目的：原生質(zhì)體培養(yǎng)的目的： （1）利用原生質(zhì)體不具細(xì)胞壁的特性可以）利用原生質(zhì)體不具細(xì)胞壁的特性可以進(jìn)行細(xì)胞器移植和外源物的攝取進(jìn)行細(xì)胞器移植和外源物的攝取(病毒、微生病毒、微生物、外源遺傳物質(zhì)物、外源遺傳物質(zhì))，原生質(zhì)體之間可以進(jìn)行，原生質(zhì)體之間可以進(jìn)行融合而產(chǎn)生雜種細(xì)胞融合而產(chǎn)生雜種細(xì)胞(即體細(xì)胞雜交）。即體細(xì)胞雜交）。

29、（2）是植物基因工程的理想受體，用外源遺）是植物基因工程的理想受體，用外源遺傳物質(zhì)對(duì)植物原生質(zhì)體進(jìn)行改造和轉(zhuǎn)化，然傳物質(zhì)對(duì)植物原生質(zhì)體進(jìn)行改造和轉(zhuǎn)化，然后誘導(dǎo)分裂、分化再生出能育的完整基因工后誘導(dǎo)分裂、分化再生出能育的完整基因工程植株。程植株。（3）也是研究細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、體）也是研究細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、體細(xì)胞無(wú)性系變異和植物病理學(xué)研究的有用工細(xì)胞無(wú)性系變異和植物病理學(xué)研究的有用工具。具。 自自1970年首次獲得原生質(zhì)體再生植株成功年首次獲得原生質(zhì)體再生植株成功以來(lái)，通過(guò)原生質(zhì)體獲得再生植株的植物約以來(lái)，通過(guò)原生質(zhì)體獲得再生植株的植物約有有280余種，其中有余種，其中有20種為我國(guó)

30、首先報(bào)道。種為我國(guó)首先報(bào)道。 原生質(zhì)體培養(yǎng)包括原生質(zhì)體的分離、培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)包括原生質(zhì)體的分離、培養(yǎng)、植株再生等過(guò)程。植株再生等過(guò)程。(一一) 原生質(zhì)體的制備：原生質(zhì)體的制備：1、材料來(lái)源與預(yù)處理：、材料來(lái)源與預(yù)處理：（1）材料來(lái)源：）材料來(lái)源： 可以用各種組織和器官，但多應(yīng)用葉片、愈傷可以用各種組織和器官，但多應(yīng)用葉片、愈傷組織及懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。以及莖尖、根尖、子葉和組織及懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。以及莖尖、根尖、子葉和胚性組織。胚性組織。 （2）預(yù)處理：預(yù)處理： a.預(yù)質(zhì)壁分離預(yù)質(zhì)壁分離：17-20 酶液中靜置半小時(shí)，再于酶液中靜置半小時(shí)，再于2834保溫，或?qū)⒉牧现糜谂c酶液中糖濃度相同的溶液中預(yù)培

31、養(yǎng)保溫，或?qū)⒉牧现糜谂c酶液中糖濃度相同的溶液中預(yù)培養(yǎng)1h左右，再浸于酶液中消化即可達(dá)到質(zhì)壁分離目的；左右，再浸于酶液中消化即可達(dá)到質(zhì)壁分離目的； b. 預(yù)培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng): 將除去下表皮的葉片于誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上將除去下表皮的葉片于誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上培養(yǎng)培養(yǎng)7天，再用酶消化去壁，所得原生質(zhì)體分裂頻率較高；天，再用酶消化去壁，所得原生質(zhì)體分裂頻率較高； c. 暗處理暗處理: 將室溫下生長(zhǎng)將室溫下生長(zhǎng)57個(gè)星期的植物材料在黑暗中個(gè)星期的植物材料在黑暗中放置放置30h以上，取其葉片制備的原生質(zhì)體有活力；以上，取其葉片制備的原生質(zhì)體有活力； d.d.光處理光處理: 將葉片于日光或燈光下照射將葉片于日光或

32、燈光下照射26h令其萎蔫，利令其萎蔫，利于撕除下表皮及原生質(zhì)體分離；于撕除下表皮及原生質(zhì)體分離； e.e.低溫處理低溫處理: 夏季應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)材料其萌動(dòng)種子應(yīng)于夏季應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)材料其萌動(dòng)種子應(yīng)于4過(guò)夜過(guò)夜后再播種，從其植株葉片上分離的原生質(zhì)體培養(yǎng)效果較佳。后再播種，從其植株葉片上分離的原生質(zhì)體培養(yǎng)效果較佳。2. 制備原生質(zhì)體的酶類(lèi)：制備原生質(zhì)體的酶類(lèi)： 高等植物細(xì)胞壁主要成分為高等植物細(xì)胞壁主要成分為a-纖維素，其次為半纖維纖維素，其次為半纖維素、果膠質(zhì)及蛋白質(zhì)素、果膠質(zhì)及蛋白質(zhì)。細(xì)胞生長(zhǎng)的不同階段及不同物種。細(xì)胞生長(zhǎng)的不同階段及不同物種的細(xì)胞壁組成與結(jié)構(gòu)不同，木質(zhì)化及次生加厚的細(xì)胞壁的細(xì)胞壁組成

33、與結(jié)構(gòu)不同，木質(zhì)化及次生加厚的細(xì)胞壁不被酶消化，故選擇消化細(xì)胞壁的酶類(lèi)是制備原生質(zhì)體不被酶消化，故選擇消化細(xì)胞壁的酶類(lèi)是制備原生質(zhì)體關(guān)鍵。關(guān)鍵。常用的酶類(lèi)有：常用的酶類(lèi)有：a. 纖維素酶纖維素酶，如，如onozuka r10及及rs，國(guó)內(nèi)常用的為，國(guó)內(nèi)常用的為ea3867，其中含少量果膠酶；，其中含少量果膠酶；b. 果膠酶果膠酶，如，如macerozyme r10 又叫離析酶，主要含又叫離析酶，主要含果膠酶，活力較高，其含雜酶較多，用量不超過(guò)果膠酶，活力較高，其含雜酶較多，用量不超過(guò)2，作，作用時(shí)間長(zhǎng)有毒害作用；此外亦用用時(shí)間長(zhǎng)有毒害作用；此外亦用pectalyase y23，也叫，也叫離析軟

34、化酶，活力極高，葉片用量一般為離析軟化酶，活力極高，葉片用量一般為01，懸浮，懸浮細(xì)胞為細(xì)胞為005；c. 崩潰酶崩潰酶（driselase)，為一種粗酶制劑，具有纖維素酶，為一種粗酶制劑，具有纖維素酶及果膠酶活性；及果膠酶活性；d. 半纖維素酶半纖維素酶，如，如rhozyme hp150，用于懸浮細(xì)胞、豆，用于懸浮細(xì)胞、豆科根瘤、幼苗子葉及根細(xì)胞原生質(zhì)體的分離科根瘤、幼苗子葉及根細(xì)胞原生質(zhì)體的分離;e 蝸牛酶蝸牛酶，主要用于體細(xì)胞原生質(zhì)體分離。，主要用于體細(xì)胞原生質(zhì)體分離。 酶液配制：酶液配制： 需加入甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、葡萄糖硫酸酯、需加入甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、葡萄糖硫酸

35、酯、cacl22h20(0. 1mmol/l一一10mo1l)及及kh2po4 (0. 75mmol/l)等滲透穩(wěn)定劑，以維持原生質(zhì)體完整性。等滲透穩(wěn)定劑，以維持原生質(zhì)體完整性。 酶液酶液ph值相當(dāng)重要，纖維素酶及果膠酶單獨(dú)使用時(shí)，其值相當(dāng)重要，纖維素酶及果膠酶單獨(dú)使用時(shí)，其ph分別以分別以5.4及及5.8為宜；混合使用時(shí)為宜；混合使用時(shí)ph5.4-ph5.6為宜，降為宜，降至至48以下則原生質(zhì)體破裂。酶液配制后需以以下則原生質(zhì)體破裂。酶液配制后需以0.45 um微孔微孔膜過(guò)濾除菌，而不可采用加熱滅菌法。膜過(guò)濾除菌，而不可采用加熱滅菌法。 3原生質(zhì)體分離及純化原生質(zhì)體分離及純化（1）分離：）分

36、離： 原生質(zhì)體分離有機(jī)械法及酶消化法，原生質(zhì)體分離有機(jī)械法及酶消化法，前者產(chǎn)量極低而不多用、后者又分前者產(chǎn)量極低而不多用、后者又分步法及二步法。步法及二步法。 一步法是將材料在一步法是將材料在2l一一28用纖維素酶及果膠酶用纖維素酶及果膠酶混合液一次性處理混合液一次性處理224h。 二步法是將材料先用果膠酶降解胞間膠層得到單二步法是將材料先用果膠酶降解胞間膠層得到單細(xì)胞，再用纖維素酶脫壁而釋放原生質(zhì)體。細(xì)胞，再用纖維素酶脫壁而釋放原生質(zhì)體。（3）純化）純化 需用不銹鋼網(wǎng)或尼龍網(wǎng)需用不銹鋼網(wǎng)或尼龍網(wǎng)(100目一目一400目目)濾除較大濾除較大雜物后再洗滌純化。雜物后再洗滌純化。 a. 離心法離心

37、法: 原生質(zhì)體混合物于原生質(zhì)體混合物于500l000 rpm離心離心5min,吸去吸去上層液，沉淀再用與酶液具有相同糖濃度溶液反復(fù)洗滌上層液，沉淀再用與酶液具有相同糖濃度溶液反復(fù)洗滌3一一4次，次，最后用原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗滌備用；最后用原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗滌備用； b. 飄浮法飄浮法: 離心法純化的原生質(zhì)體若含較多碎片及少量老細(xì)離心法純化的原生質(zhì)體若含較多碎片及少量老細(xì)胞時(shí)可用胞時(shí)可用20蔗糖離心，原生質(zhì)體浮于液面碎片及老細(xì)胞蔗糖離心，原生質(zhì)體浮于液面碎片及老細(xì)胞沉降而得以純化，但產(chǎn)量低，有時(shí)對(duì)原生質(zhì)體造成損傷；沉降而得以純化，但產(chǎn)量低，有時(shí)對(duì)原生質(zhì)體造成損傷； c. 界面法界面法: 利用高分子聚合

38、物混合液產(chǎn)生兩相水溶液的原理，利用高分子聚合物混合液產(chǎn)生兩相水溶液的原理，將原生質(zhì)體混合物置于葡聚糖及將原生質(zhì)體混合物置于葡聚糖及peg混合液中離心，即可從兩混合液中離心，即可從兩相界面獲得高純度原生質(zhì)體；相界面獲得高純度原生質(zhì)體； d. 滴洗法滴洗法: 原生質(zhì)體混合物置于孔徑原生質(zhì)體混合物置于孔徑8um濾器中，用洗液以濾器中，用洗液以l-2滴秒速度自然過(guò)濾洗滌，其過(guò)程勿使濾干，洗至一定程度后，滴秒速度自然過(guò)濾洗滌，其過(guò)程勿使濾干，洗至一定程度后，用原生質(zhì)體培養(yǎng)液混合備用。此法原生質(zhì)體破碎少。用原生質(zhì)體培養(yǎng)液混合備用。此法原生質(zhì)體破碎少。 4原生質(zhì)體活力測(cè)定原生質(zhì)體活力測(cè)定 純化的原生質(zhì)體需經(jīng)

39、活力測(cè)定后方可用于培養(yǎng)測(cè)定方法有；純化的原生質(zhì)體需經(jīng)活力測(cè)定后方可用于培養(yǎng)測(cè)定方法有；（1）根據(jù)形態(tài)待征判斷其活力）根據(jù)形態(tài)待征判斷其活力：來(lái)源于葉片的原生質(zhì)體，：來(lái)源于葉片的原生質(zhì)體，呈綠色及圓而鼓者為活原生質(zhì)體；來(lái)源于愈傷組織及懸浮細(xì)胞呈綠色及圓而鼓者為活原生質(zhì)體；來(lái)源于愈傷組織及懸浮細(xì)胞者，胞質(zhì)內(nèi)原生質(zhì)環(huán)流及布朗運(yùn)動(dòng)活躍者活力較高；者，胞質(zhì)內(nèi)原生質(zhì)環(huán)流及布朗運(yùn)動(dòng)活躍者活力較高；（2）活體染色法）活體染色法：用：用0. 1酚番紅或伊文思藍(lán)染色、不著色酚番紅或伊文思藍(lán)染色、不著色者為活原生質(zhì)體，染色者為無(wú)活力原生質(zhì)體；者為活原生質(zhì)體，染色者為無(wú)活力原生質(zhì)體；（3）熒光染料活休染色法）熒光染料

40、活休染色法：用雙醋酸熒光素染色，染料可：用雙醋酸熒光素染色，染料可自由透過(guò)細(xì)胞膜，在細(xì)胞內(nèi)被酯酶水解為熒光素，后者不能自自由透過(guò)細(xì)胞膜，在細(xì)胞內(nèi)被酯酶水解為熒光素，后者不能自由透過(guò)細(xì)胞膜而滯留于細(xì)胞內(nèi)，在熒光顯微鏡下根據(jù)熒光強(qiáng)度由透過(guò)細(xì)胞膜而滯留于細(xì)胞內(nèi)，在熒光顯微鏡下根據(jù)熒光強(qiáng)度即可判斷原生質(zhì)體死活。即可判斷原生質(zhì)體死活。（二）原生質(zhì)體培養(yǎng)：（二）原生質(zhì)體培養(yǎng)： 1. 培養(yǎng)方法：培養(yǎng)方法：（1）固體培養(yǎng)）固體培養(yǎng)：平板培養(yǎng)法，：平板培養(yǎng)法，1. 2%瓊脂瓊脂, 45 oc.（2）液體培養(yǎng)）液體培養(yǎng)： a. 淺層培養(yǎng)法淺層培養(yǎng)法: 其過(guò)程是將其過(guò)程是將1m1原生質(zhì)體懸液置于直徑原生質(zhì)體懸液置于

41、直徑4cm培養(yǎng)皿或培養(yǎng)皿或25m1三角瓶中使成薄層后于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)初期振搖三角瓶中使成薄層后于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)初期振搖12次，防止粘壁；次，防止粘壁； b. 懸滴培養(yǎng)法懸滴培養(yǎng)法:其過(guò)程系將原生質(zhì)體懸液滴入培養(yǎng)皿蓋內(nèi)，其過(guò)程系將原生質(zhì)體懸液滴入培養(yǎng)皿蓋內(nèi)，其量分別為其量分別為5一一10、50100及及100一一200 ul等，保持一定滴等，保持一定滴距每皿由幾滴至十幾滴不等，培養(yǎng)皿加入濃度低于培養(yǎng)液的距每皿由幾滴至十幾滴不等，培養(yǎng)皿加入濃度低于培養(yǎng)液的液體，再將皿蓋翻蓋于皿上并置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；液體，再將皿蓋翻蓋于皿上并置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； c. 雙層培養(yǎng)法雙層培養(yǎng)法: 先將固體培養(yǎng)基傾入培養(yǎng)皿內(nèi)冷卻成

42、層，再先將固體培養(yǎng)基傾入培養(yǎng)皿內(nèi)冷卻成層，再將原生質(zhì)體懸浮液置于已固化培養(yǎng)基上培養(yǎng)；將原生質(zhì)體懸浮液置于已固化培養(yǎng)基上培養(yǎng)； d. 看護(hù)培養(yǎng)法看護(hù)培養(yǎng)法: 在培養(yǎng)皿底層鋪一層正常密度且經(jīng)射線處理在培養(yǎng)皿底層鋪一層正常密度且經(jīng)射線處理已失去分裂能力而有代謝活力的原生質(zhì)體瓊脂混合物作飼養(yǎng)層，已失去分裂能力而有代謝活力的原生質(zhì)體瓊脂混合物作飼養(yǎng)層，再于其上接種一層低密度再于其上接種一層低密度(5一一lo個(gè)細(xì)胞個(gè)細(xì)胞m1)懸浮原生質(zhì)體培懸浮原生質(zhì)體培養(yǎng)。養(yǎng)。2. 培養(yǎng)條件：培養(yǎng)條件： 密度密度： 平板培養(yǎng)平板培養(yǎng)103104個(gè)個(gè)/ml, 液體培養(yǎng)液體培養(yǎng)104105個(gè)個(gè)/ml溫度溫度： 多數(shù)為多數(shù)為2

43、5-28 oc, 少數(shù)少數(shù)1637 oc光照：光照：500 lx,18h 或或2800 lx 連續(xù)光照連續(xù)光照 多數(shù)要求多數(shù)要求 黑黑 暗或弱光暗或弱光3. 細(xì)胞壁再生及細(xì)胞分裂：細(xì)胞壁再生及細(xì)胞分裂： l一一3天即再生新細(xì)胞壁，表現(xiàn)為體積增加、膨大，再由圓變橢天即再生新細(xì)胞壁，表現(xiàn)為體積增加、膨大，再由圓變橢圓?？捎觅|(zhì)壁分離法或在稍微低滲溶液中出芽現(xiàn)象證實(shí)。也可用圓?？捎觅|(zhì)壁分離法或在稍微低滲溶液中出芽現(xiàn)象證實(shí)。也可用0. 1% st型或型或wbl型熒光增白劑染色，經(jīng)前者染色，有細(xì)胞壁者在型熒光增白劑染色，經(jīng)前者染色，有細(xì)胞壁者在熒光顯微鏡下呈藍(lán)色熒光。經(jīng)后者染色，有細(xì)胞壁者發(fā)射綠色熒光。熒

44、光顯微鏡下呈藍(lán)色熒光。經(jīng)后者染色，有細(xì)胞壁者發(fā)射綠色熒光。 在原生質(zhì)培養(yǎng)過(guò)程中，在原生質(zhì)培養(yǎng)過(guò)程中，胞質(zhì)增加，液泡減少，葉綠體或顆粒內(nèi)胞質(zhì)增加，液泡減少，葉綠體或顆粒內(nèi)含物分散于泡質(zhì)中或圍繞于細(xì)胞核周?chē)锓稚⒂谂葙|(zhì)中或圍繞于細(xì)胞核周?chē)Ｔ诔Ｔ?一一2周內(nèi)發(fā)生第一次周內(nèi)發(fā)生第一次分裂。不同細(xì)胞分裂頻率不同，常在分裂。不同細(xì)胞分裂頻率不同，常在190之間。之間。（4）愈傷組織形成及胚狀體形成）愈傷組織形成及胚狀體形成 原生質(zhì)體再生的細(xì)胞一旦開(kāi)始分裂，就可能繼續(xù)生長(zhǎng)：原生質(zhì)體再生的細(xì)胞一旦開(kāi)始分裂，就可能繼續(xù)生長(zhǎng)： a 形成細(xì)胞團(tuán)，發(fā)育成愈傷組織；形成細(xì)胞團(tuán)，發(fā)育成愈傷組織； b. 形成胚狀體，再

45、產(chǎn)生植株；形成胚狀體，再產(chǎn)生植株； c. 形成愈傷組織，再形成胚狀體形成愈傷組織，再形成胚狀體。 隨著細(xì)胞分裂及細(xì)胞團(tuán)形成，已與常規(guī)細(xì)胞和組織培養(yǎng)隨著細(xì)胞分裂及細(xì)胞團(tuán)形成，已與常規(guī)細(xì)胞和組織培養(yǎng)相同，故培養(yǎng)相同，故培養(yǎng)34周需添加含一定量低滲穩(wěn)定劑的新培養(yǎng)基，周需添加含一定量低滲穩(wěn)定劑的新培養(yǎng)基，以滿足細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)，亦利于細(xì)胞團(tuán)及小愈傷組織的生長(zhǎng)。以滿足細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)，亦利于細(xì)胞團(tuán)及小愈傷組織的生長(zhǎng)。 5. 植株再生植株再生 除少數(shù)植物通過(guò)胚狀體直接發(fā)育成完整植株外，大多經(jīng)愈傷組除少數(shù)植物通過(guò)胚狀體直接發(fā)育成完整植株外，大多經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)分化形成芽及根再生為完整植株。當(dāng)愈傷組織達(dá)到織誘導(dǎo)分化形成芽及

46、根再生為完整植株。當(dāng)愈傷組織達(dá)到12mm時(shí)，轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)器官分化。分化培養(yǎng)基與原生質(zhì)體培時(shí)，轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)器官分化。分化培養(yǎng)基與原生質(zhì)體培養(yǎng)基差別在于：養(yǎng)基差別在于： (1) 只用蔗糖為碳源，不加滲透穩(wěn)定劑；只用蔗糖為碳源，不加滲透穩(wěn)定劑； (2) 與原生質(zhì)體培養(yǎng)基相反，細(xì)胞分裂素濃度高于生長(zhǎng)素與原生質(zhì)體培養(yǎng)基相反，細(xì)胞分裂素濃度高于生長(zhǎng)素; (3) 在誘導(dǎo)器官分化過(guò)程中，一般采用在誘導(dǎo)器官分化過(guò)程中，一般采用15001x左右的高光強(qiáng)。誘導(dǎo)左右的高光強(qiáng)。誘導(dǎo)器官分化的溫度與原生質(zhì)體培養(yǎng)基本相同。器官分化的溫度與原生質(zhì)體培養(yǎng)基本相同。 無(wú)根苗轉(zhuǎn)移至誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基上培養(yǎng)生根，其

47、只含低濃度生長(zhǎng)無(wú)根苗轉(zhuǎn)移至誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基上培養(yǎng)生根，其只含低濃度生長(zhǎng)素，而不含細(xì)胞分裂素，無(wú)根苗一旦生根即可發(fā)育成完整植株。素，而不含細(xì)胞分裂素，無(wú)根苗一旦生根即可發(fā)育成完整植株。 在外界因素作用下，兩個(gè)或兩個(gè)以上植物細(xì)在外界因素作用下，兩個(gè)或兩個(gè)以上植物細(xì)胞合并成一個(gè)多核細(xì)胞的過(guò)程稱為植物細(xì)胞融合，胞合并成一個(gè)多核細(xì)胞的過(guò)程稱為植物細(xì)胞融合，或植物體細(xì)胞雜交?；蛑参矬w細(xì)胞雜交。但由于植物細(xì)胞具有堅(jiān)硬的細(xì)但由于植物細(xì)胞具有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，不能直接融合，需經(jīng)酶消化除去細(xì)胞壁釋放胞壁，不能直接融合，需經(jīng)酶消化除去細(xì)胞壁釋放出原生質(zhì)體，后者生理、生化及遺傳學(xué)特性與完整出原生質(zhì)體，后者生理、生化及遺傳學(xué)特性與完整細(xì)胞基本相同。在適當(dāng)條件下來(lái)源不同的植物原生細(xì)胞基本相同。在適當(dāng)條件下來(lái)源不同的植物原生質(zhì)體可產(chǎn)生融合作用