DNA的物合成和損傷修復(fù)

1、 dna的合成及重組的合成及重組 dna biosynthesis and recombination第十六章第十六章dna生物合成生物合成dna復(fù)制復(fù)制 （dna指導(dǎo)的指導(dǎo)的dna合成合成）逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄 ( (逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒rna指導(dǎo)的指導(dǎo)的dna合成合成)校正復(fù)制中可能出現(xiàn)的錯誤，并修復(fù)受到損校正復(fù)制中可能出現(xiàn)的錯誤，并修復(fù)受到損傷的傷的dna細(xì)胞中酶促修復(fù)系統(tǒng)細(xì)胞中酶促修復(fù)系統(tǒng)自然界自然界dnadna重組和基因轉(zhuǎn)移的基本方式重組和基因轉(zhuǎn)移的基本方式基因組復(fù)制的主要特點(diǎn)基因組復(fù)制的主要特點(diǎn)the general features of genome replication 第一節(jié)第一

2、節(jié)復(fù)制起點(diǎn)（復(fù)制起點(diǎn)（origin）：指：指dna復(fù)制所必需的一段復(fù)制所必需的一段特殊的特殊的dna序列。序列。雙螺旋雙螺旋dna復(fù)制時，復(fù)制區(qū)生長點(diǎn)的結(jié)構(gòu)復(fù)制時，復(fù)制區(qū)生長點(diǎn)的結(jié)構(gòu)呈呈y形或叉形，稱之為形或叉形，稱之為復(fù)制叉。復(fù)制叉。（二）復(fù)制過程中形成復(fù)制泡和復(fù)制叉（二）復(fù)制過程中形成復(fù)制泡和復(fù)制叉目目 錄錄從一個從一個dna復(fù)制起點(diǎn)起始的復(fù)制起點(diǎn)起始的dna復(fù)制區(qū)域，復(fù)制區(qū)域，它是一個獨(dú)立復(fù)制單位，包括復(fù)制起點(diǎn)和終點(diǎn)。它是一個獨(dú)立復(fù)制單位，包括復(fù)制起點(diǎn)和終點(diǎn)。 復(fù)制子（復(fù)制子（replicon）（三）復(fù)制的基本單位稱為復(fù)制子（三）復(fù)制的基本單位稱為復(fù)制子 （四）半保留復(fù)制方式保證遺傳信息

3、的忠實(shí)傳（四）半保留復(fù)制方式保證遺傳信息的忠實(shí)傳遞遞（1）全保留式（全保留式（conservative），即恢復(fù)原來的，即恢復(fù)原來的dna雙螺旋，并產(chǎn)生一個新的子代雙螺旋，并產(chǎn)生一個新的子代dna雙雙螺旋；螺旋；（2）半保留式（半保留式（semiconservative），即新老搭，即新老搭配，由一條新合成的配，由一條新合成的dna鏈和一條復(fù)制模鏈和一條復(fù)制模板鏈配對產(chǎn)生子代雙螺旋板鏈配對產(chǎn)生子代雙螺旋dna；（3）散布式（散布式（dispersive），），即復(fù)制模板鏈被分即復(fù)制模板鏈被分成許多小片段，散布于子代成許多小片段，散布于子代dna中。中。兩條新合成的兩條新合成的dnadna鏈和兩

4、條原來的復(fù)制模板鏈和兩條原來的復(fù)制模板鏈之間的結(jié)合方式可能性：鏈之間的結(jié)合方式可能性：密度梯度實(shí)驗(yàn)密度梯度實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持半保留復(fù)制半保留復(fù)制方式方式含重氮含重氮-dna的細(xì)菌的細(xì)菌培養(yǎng)于普培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液通培養(yǎng)液 第一代第一代繼續(xù)培養(yǎng)于繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液普通培養(yǎng)液 第二代第二代梯度離心結(jié)果梯度離心結(jié)果前導(dǎo)鏈（前導(dǎo)鏈（leading strand）: dna復(fù)制時，一條鏈復(fù)制時，一條鏈的合成方向和復(fù)制叉前進(jìn)方向相同，可以連續(xù)復(fù)制合的合成方向和復(fù)制叉前進(jìn)方向相同，可以連續(xù)復(fù)制合成的新鏈。成的新鏈。后隨鏈（后隨鏈（lagging strand）:另一條鏈的合成方向另一條鏈的合成方向

5、與復(fù)制叉前進(jìn)方向相反，不能連續(xù)復(fù)制，只能分成若與復(fù)制叉前進(jìn)方向相反，不能連續(xù)復(fù)制，只能分成若干小片段分別合成，然后連接起來形成新鏈。后隨鏈干小片段分別合成，然后連接起來形成新鏈。后隨鏈中的小片段稱為中的小片段稱為岡崎片段（岡崎片段（okazaki fragments) )。（五）半不連續(xù)復(fù)制克服了（五）半不連續(xù)復(fù)制克服了dna空間結(jié)構(gòu)空間結(jié)構(gòu) 對對dna新鏈合成的制約新鏈合成的制約前導(dǎo)鏈連續(xù)復(fù)制而后隨鏈不連續(xù)復(fù)制，即前導(dǎo)鏈連續(xù)復(fù)制而后隨鏈不連續(xù)復(fù)制，即dna半半不連續(xù)不連續(xù)復(fù)制復(fù)制。復(fù)制起點(diǎn)的一般特征復(fù)制起點(diǎn)的一般特征: 由多個獨(dú)特的短重復(fù)序列組成。由多個獨(dú)特的短重復(fù)序列組成。 短重復(fù)序列被多

6、亞基的復(fù)制起始因子所識別并結(jié)合。短重復(fù)序列被多亞基的復(fù)制起始因子所識別并結(jié)合。 一般富含一般富含at，利于雙螺旋，利于雙螺旋dna解旋，以產(chǎn)生單鏈解旋，以產(chǎn)生單鏈dna復(fù)制模板。復(fù)制模板。e.coli 復(fù)制起始點(diǎn)復(fù)制起始點(diǎn) oric gattntttattt gatctnttntatt gatctcttattag 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 tgtggatta-ttatacaca-tttggataa-ttatccaca58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 同向重復(fù)序列同向重復(fù)

7、序列 反向重復(fù)序列反向重復(fù)序列5 3 5 3 酵母復(fù)制起點(diǎn)為酵母復(fù)制起點(diǎn)為自主復(fù)制序列（自主復(fù)制序列（autonomously replicating sequences，ars）： 酵母染色體含有多個復(fù)制起點(diǎn)。酵母染色體含有多個復(fù)制起點(diǎn)。 元件元件a(富含富含a/t的共有序列的共有序列)：結(jié)合一個特異的蛋白質(zhì)：結(jié)合一個特異的蛋白質(zhì)復(fù)合物復(fù)合物復(fù)制起點(diǎn)識別復(fù)合物復(fù)制起點(diǎn)識別復(fù)合物(orc)。 3個序列個序列(b1、b2和和b3)可以增加復(fù)制起點(diǎn)的效率，其可以增加復(fù)制起點(diǎn)的效率，其中中b2的的9個堿基與上述個堿基與上述ars共有序列相同。共有序列相同。酵母復(fù)制起始點(diǎn)酵母復(fù)制起始點(diǎn)dna聚合酶不能

8、從聚合酶不能從游離的核苷酸游離的核苷酸開始合成開始合成dna鏈，必須由引物（鏈，必須由引物（primer）提供自由的）提供自由的3 -oh末端末端，通過加入核苷酸使之不斷延伸。，通過加入核苷酸使之不斷延伸。所有細(xì)胞和多數(shù)病毒的所有細(xì)胞和多數(shù)病毒的dna復(fù)制，首先利用復(fù)制，首先利用模板合成一段模板合成一段rna引物引物，這一過程為，這一過程為引發(fā)引發(fā)（priming）。rna引物引物5 端的第一個核苷酸通常是端的第一個核苷酸通常是pppa（個別為（個別為pppg）。）。1.1.多數(shù)多數(shù)dna復(fù)制使用復(fù)制使用rna引物引物174等噬菌體等噬菌體以雙鏈以雙鏈環(huán)形環(huán)形dna的一條鏈上產(chǎn)的一條鏈上產(chǎn)生切

9、口處的生切口處的3 -oh為引物；為引物；腺病毒及某些線性腺病毒及某些線性dna病毒病毒以結(jié)合于病毒以結(jié)合于病毒dna的的5 端磷酸基團(tuán)的末端蛋白上的端磷酸基團(tuán)的末端蛋白上的dctp的的3 -oh為引物開始復(fù)制。為引物開始復(fù)制。2.個別個別dna復(fù)制以復(fù)制以dna或核苷酸為引物或核苷酸為引物 dna復(fù)制過程復(fù)制過程 process of dna replication第二節(jié)第二節(jié)dnaa、dnab、dnac、hu、促旋酶（促旋酶（gyrase，即拓?fù)洚悩?gòu)酶，即拓?fù)洚悩?gòu)酶）、）、單鏈單鏈dna結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白(single strand binding protein, ssb)dna復(fù)制需要復(fù)

10、制需要6種蛋白因子：種蛋白因子：e.coli dna復(fù)制起始復(fù)制起始 結(jié)合結(jié)合oric的的4個個9bp反向重復(fù)序列形成反向重復(fù)序列形成復(fù)制起復(fù)制起始復(fù)合物始復(fù)合物。作用于作用于oric的的3個個13bp正向重復(fù)序列，正向重復(fù)序列，dna在在這這3個位點(diǎn)解鏈，形成個位點(diǎn)解鏈，形成開放型復(fù)合物（開放型復(fù)合物（open complex）。dnaa蛋白蛋白53 解旋酶作用產(chǎn)生兩條復(fù)制模板鏈解旋酶作用產(chǎn)生兩條復(fù)制模板鏈激活引發(fā)酶激活引發(fā)酶dnag蛋白蛋白dnab蛋白與引發(fā)酶結(jié)合，形成引發(fā)體蛋白與引發(fā)酶結(jié)合，形成引發(fā)體dnab蛋白蛋白使一條使一條dna鏈圍繞著另一條旋轉(zhuǎn)，消除解鏈圍繞著另一條旋轉(zhuǎn)，消除解旋

11、產(chǎn)生的張力。旋產(chǎn)生的張力。促旋酶促旋酶ssbssb蛋白蛋白huhu蛋白蛋白穩(wěn)定解旋后的單鏈穩(wěn)定解旋后的單鏈dna構(gòu)象，有助于解旋。構(gòu)象，有助于解旋。dna結(jié)合蛋白，對復(fù)制起促進(jìn)作用。結(jié)合蛋白，對復(fù)制起促進(jìn)作用。hu蛋白能夠使蛋白能夠使dna發(fā)生折疊。發(fā)生折疊。e.coli 中中dnab結(jié)合引發(fā)酶結(jié)合引發(fā)酶dnag，催化合成，催化合成rna引物，其序列始于引物，其序列始于pppag，模板鏈序列，模板鏈序列3 -gtc-5 ，引物長度一般，引物長度一般1112個堿基。個堿基。（二）引發(fā)酶合成（二）引發(fā)酶合成rna引物引物負(fù)責(zé)切除負(fù)責(zé)切除rna引物。引物。（三）復(fù)制時聚合酶（三）復(fù)制時聚合酶催化催化

12、dna合成而合成而 聚合酶聚合酶切除引物切除引物dna聚合酶聚合酶可利用損傷尚未修復(fù)的可利用損傷尚未修復(fù)的dna鏈鏈作為模板合成作為模板合成dna，但不能修，但不能修復(fù)損傷。復(fù)損傷。負(fù)責(zé)合成負(fù)責(zé)合成dna。dna聚合酶聚合酶dna聚合酶聚合酶tls1 rev 1tls，體細(xì)胞高變，體細(xì)胞高變1pol 相對準(zhǔn)確的相對準(zhǔn)確的tls（穿越環(huán)丁烷二聚體）（穿越環(huán)丁烷二聚體）1pol tls1pol 體細(xì)胞高變（體細(xì)胞高變（somatic hypermutation）1pol 減數(shù)分裂相關(guān)的減數(shù)分裂相關(guān)的dna損傷修復(fù)損傷修復(fù)1pol tls1pol dna交聯(lián)損傷修復(fù)交聯(lián)損傷修復(fù)1pol dna復(fù)制，

13、核苷酸切除修復(fù)，堿基切除修復(fù)復(fù)制，核苷酸切除修復(fù)，堿基切除修復(fù)4pol dna復(fù)制，核苷酸切除修復(fù)，堿基切除修復(fù)復(fù)制，核苷酸切除修復(fù)，堿基切除修復(fù)23pol 線粒體線粒體dna復(fù)制和損傷修復(fù)復(fù)制和損傷修復(fù)3pol 堿基切除修復(fù)堿基切除修復(fù)1pol 合成引物合成引物4pol 功能功能亞基數(shù)目亞基數(shù)目真核生物真核生物tls（translesion synthesis）3pol (umuc, umud)dna損傷修復(fù)，穿越損傷合成（損傷修復(fù)，穿越損傷合成（tls）1pol (din b)染色體染色體dna復(fù)制復(fù)制9pol 全酶全酶染色體染色體dna復(fù)制復(fù)制3pol 核心酶核心酶dna損傷修復(fù)損傷修復(fù)

14、1pol 去除去除rna引物，引物，dna損傷修復(fù)損傷修復(fù)1pol 功能功能亞基數(shù)目亞基數(shù)目原核生物（原核生物（e.coli）原核、真核細(xì)胞原核、真核細(xì)胞dnadna聚合酶的類型和功能聚合酶的類型和功能目目 錄錄個核心酶個核心酶1個個 -復(fù)合物（復(fù)合物（ 、 、 、 、 、 6種亞種亞基）基）可滑動的可滑動的dna夾子夾子（含（含1對對 -亞基）亞基）dna聚合酶聚合酶全酶結(jié)構(gòu)全酶結(jié)構(gòu)全酶結(jié)構(gòu)包括：全酶結(jié)構(gòu)包括： 亞基亞基（130 000）主要功能是合成）主要功能是合成dna 亞基亞基具有具有35 外切酶活性（校正功能）外切酶活性（校正功能） 亞基可增強(qiáng)其活性亞基可增強(qiáng)其活性 亞基亞基可能起組

15、裝作用可能起組裝作用核心酶由核心酶由 、 和和 亞基組成：亞基組成：2個個 -亞基亞基分別和分別和1個核心酶相互作用，其個核心酶相互作用，其柔性連接區(qū)可以確保在復(fù)制叉柔性連接區(qū)可以確保在復(fù)制叉1個全酶分子的個全酶分子的2個核心酶能夠相對獨(dú)立運(yùn)動，分別負(fù)責(zé)合成個核心酶能夠相對獨(dú)立運(yùn)動，分別負(fù)責(zé)合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈。前導(dǎo)鏈和后隨鏈。功能：功能： -復(fù)合物是復(fù)合物是dna夾子加載蛋白，負(fù)責(zé)將夾子加載蛋白，負(fù)責(zé)將可沿可沿dna鏈滑動的一對鏈滑動的一對 -亞基（亞基（dna夾夾子）加載于子）加載于dna，使，使dna聚合酶聚合酶具有具有持續(xù)合成能力。持續(xù)合成能力。 -復(fù)合物由復(fù)合物由6種亞基組成：種亞基組

16、成： 、 、 、 、 、 在復(fù)制叉同時合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈在復(fù)制叉同時合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈3 5 3 5 3 5 3 5 前導(dǎo)鏈前導(dǎo)鏈(leading strand)后隨鏈后隨鏈(lagging strand)解鏈方向解鏈方向?qū)槠螌槠? 5 53 外切酶：外切酶：去除去除rna引物引物35 外切酶：外切酶：起校正作用起校正作用dna聚合酶活性：聚合酶活性：填補(bǔ)兩個岡崎片段之間的缺口填補(bǔ)兩個岡崎片段之間的缺口dna聚合酶聚合酶有有3個酶促活性結(jié)構(gòu)域個酶促活性結(jié)構(gòu)域:323個氨基酸個氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段：大片段：klenow 片段片段 604個氨基酸個氨基酸

17、dna聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性n 端端c 端端枯草桿菌蛋白酶枯草桿菌蛋白酶dna-pol tus蛋白具有蛋白具有反解旋酶（反解旋酶（contra-helicase）活性活性，識別并結(jié)合識別并結(jié)合ter序列中共有序列，阻止序列中共有序列，阻止dna b蛋白的解旋作用，從而蛋白的解旋作用，從而抑制復(fù)制叉前進(jìn)抑制復(fù)制叉前進(jìn)。tus蛋白除了使復(fù)制叉停止運(yùn)動以外，還可蛋白除了使復(fù)制叉停止運(yùn)動以外，還可能造成能造成復(fù)制體解體復(fù)制體解體。(四四) tus蛋白識別復(fù)制終點(diǎn)使復(fù)制終止蛋白識別復(fù)制終點(diǎn)使復(fù)制終止在復(fù)制叉匯合點(diǎn)兩側(cè)約在復(fù)制叉匯合點(diǎn)兩側(cè)約100kb處各有一個處各有一個終止

18、區(qū)（終止區(qū)（ter d/a和和ter c/b）。）。當(dāng)當(dāng)oric處于處于半甲基化狀態(tài)半甲基化狀態(tài)時，時，seqa蛋白迅速結(jié)合蛋白迅速結(jié)合半甲基化的半甲基化的gatc，阻止，阻止dam甲基化酶與之結(jié)合，甲基化酶與之結(jié)合，使復(fù)制起點(diǎn)不能被完全甲基化，同時使復(fù)制起點(diǎn)不能被完全甲基化，同時阻止阻止dnaa蛋蛋白結(jié)合白結(jié)合oric。oric的的gatc被完全甲基化被完全甲基化，dnaa蛋白就能與之蛋白就能與之結(jié)合結(jié)合，開始新的一輪復(fù)制，開始新的一輪復(fù)制。(五五) dna甲基化保證復(fù)制起點(diǎn)在每個復(fù)制周甲基化保證復(fù)制起點(diǎn)在每個復(fù)制周期中僅起一次作用期中僅起一次作用e.coli復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)oric含有含有

19、11個拷貝個拷貝gatc，這一回，這一回文序列中的文序列中的a是是dam甲基化酶的靶位點(diǎn)甲基化酶的靶位點(diǎn)。在復(fù)制過程中，在復(fù)制過程中，dna每復(fù)制每復(fù)制10bp，復(fù)制叉前方的，復(fù)制叉前方的模板模板dna雙螺旋就要繞其長軸旋轉(zhuǎn)一周，產(chǎn)生雙螺旋就要繞其長軸旋轉(zhuǎn)一周，產(chǎn)生正正超螺旋超螺旋。拓?fù)洚悩?gòu)酶是一種可逆的核酸酶。它們可共價結(jié)拓?fù)洚悩?gòu)酶是一種可逆的核酸酶。它們可共價結(jié)合合dna分子上的磷酸基團(tuán)，分子上的磷酸基團(tuán)，切斷磷酸二酯鍵切斷磷酸二酯鍵。(六六) dna復(fù)制需要兩類復(fù)制需要兩類dna拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶消除正超螺旋，使復(fù)制叉能夠順利前進(jìn)。消除正超螺旋，使復(fù)制叉能夠順利前進(jìn)。維持維持e.col

20、i、噬菌體和質(zhì)粒、噬菌體和質(zhì)粒dna復(fù)制起始模板復(fù)制起始模板dna負(fù)超螺旋狀態(tài)。負(fù)超螺旋狀態(tài)。環(huán)形染色體復(fù)制后產(chǎn)生的兩個子染色體連環(huán)體環(huán)形染色體復(fù)制后產(chǎn)生的兩個子染色體連環(huán)體解連環(huán)。解連環(huán)。dna拓?fù)洚悩?gòu)酶功能：拓?fù)洚悩?gòu)酶功能：e.coii的的topo只作只作用于負(fù)超螺旋用于負(fù)超螺旋dna，消除負(fù)超螺旋。消除負(fù)超螺旋。 dna拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶的功能：的功能：e.coli的的topo將將前方產(chǎn)生的正超前方產(chǎn)生的正超螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)超螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)超螺旋。螺旋。dna拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶的功能的功能e.coli 的的topo功能功能是將復(fù)制產(chǎn)生的兩個是將復(fù)制產(chǎn)生的兩個子染色體從連環(huán)體中子染色體從連環(huán)

21、體中分離出來，催化連環(huán)分離出來，催化連環(huán)和去連環(huán)過程和去連環(huán)過程 。真核生物復(fù)制子多、岡崎片段短、復(fù)制叉真核生物復(fù)制子多、岡崎片段短、復(fù)制叉前進(jìn)速度慢等；前進(jìn)速度慢等；dna復(fù)制從引發(fā)進(jìn)入延伸階段發(fā)生復(fù)制從引發(fā)進(jìn)入延伸階段發(fā)生dna聚聚合酶合酶 / 轉(zhuǎn)換；轉(zhuǎn)換；切除岡崎片段切除岡崎片段rna引物的是核酸酶引物的是核酸酶rnase h和和fen1等。等。 二、真核生物二、真核生物dna復(fù)制和原核生物相復(fù)制和原核生物相似但更為復(fù)雜似但更為復(fù)雜真核生物與原核生物真核生物與原核生物dna復(fù)制的差異：復(fù)制的差異：( (一一) )常見的真核細(xì)胞常見的真核細(xì)胞dna聚合酶有聚合酶有5種種a家族家族與大腸桿菌

22、與大腸桿菌pol同源，包括同源，包括pol 和和pol b家族家族與大腸桿菌與大腸桿菌pol 同源，包括同源，包括pol 、 、 和和c家族家族與大腸桿菌與大腸桿菌pol 同源，僅在真菌中發(fā)現(xiàn)同源，僅在真菌中發(fā)現(xiàn)x家族家族與大腸桿菌與大腸桿菌dna聚合酶并無同源性，卻與末聚合酶并無同源性，卻與末端轉(zhuǎn)移酶同源，成員包括端轉(zhuǎn)移酶同源，成員包括pol 、 、 y家族家族（ umuc/dinb超家族），近年發(fā)現(xiàn)一個特殊超家族），近年發(fā)現(xiàn)一個特殊的真核及原核的真核及原核dna聚合酶家族，成員包括聚合酶家族，成員包括pol 、 、 和和rev1pol 負(fù)責(zé)合成引物負(fù)責(zé)合成引物pol 負(fù)責(zé)負(fù)責(zé)dna復(fù)制、核

23、苷酸切除修復(fù)和堿基切除復(fù)制、核苷酸切除修復(fù)和堿基切除修復(fù)修復(fù)pol 的功能與的功能與pol 相似（其確切功能尚待定）相似（其確切功能尚待定）pol 可能和堿基切除修復(fù)有關(guān)可能和堿基切除修復(fù)有關(guān)pol 負(fù)責(zé)線粒體負(fù)責(zé)線粒體dna復(fù)制和損傷修復(fù)復(fù)制和損傷修復(fù)常見的真核常見的真核dna聚合酶有聚合酶有5種：種：拓?fù)洚悩?gòu)酶，去除負(fù)超螺旋（使解旋酶容易解旋），去除復(fù)制叉前方產(chǎn)生的正拓?fù)洚悩?gòu)酶，去除負(fù)超螺旋（使解旋酶容易解旋），去除復(fù)制叉前方產(chǎn)生的正超螺旋超螺旋tol和和toldna雙螺旋解鏈，參與組裝引發(fā)體雙螺旋解鏈，參與組裝引發(fā)體dna解旋酶解旋酶連接岡崎片段連接岡崎片段dna連接酶連接酶核酸酶，切除

24、核酸酶，切除rna引物引物rnase h核酸酶，切除核酸酶，切除rna引物引物fen1dna復(fù)制，核苷酸切除修復(fù)，堿基切除修復(fù)復(fù)制，核苷酸切除修復(fù)，堿基切除修復(fù)pol / 合成合成rna-dna引物引物pol /引發(fā)酶引發(fā)酶有依賴有依賴dna的的atpase活性，結(jié)合于引物活性，結(jié)合于引物-模板鏈，激活模板鏈，激活dna聚合酶，聚合酶， 促使促使pcna結(jié)合于引物結(jié)合于引物-模板鏈模板鏈rfc激活激活dna聚合酶和聚合酶和rfc的的atpase活性活性pcna單鏈單鏈dna結(jié)合蛋白，激活結(jié)合蛋白，激活dna聚合酶，使解旋酶容易結(jié)合聚合酶，使解旋酶容易結(jié)合dnarpa功功 能能蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)真核真

25、核dna復(fù)制叉主要蛋白質(zhì)的功能復(fù)制叉主要蛋白質(zhì)的功能( (二二) )真核真核dnadna復(fù)制叉主要蛋白質(zhì)的類型和功能復(fù)制叉主要蛋白質(zhì)的類型和功能與原核基本相似與原核基本相似dna聚合酶聚合酶 （pol ）分子含有）分子含有4個亞基：個亞基：1. dna聚合酶聚合酶 /引發(fā)酶復(fù)合物合成引發(fā)酶復(fù)合物合成rna-dna引物引物 p180：催化亞基：催化亞基 p48：具有引發(fā)酶活性：具有引發(fā)酶活性 p58：p48的穩(wěn)定性和活性所必需的的穩(wěn)定性和活性所必需的 p70：與組裝引發(fā)體有關(guān)：與組裝引發(fā)體有關(guān)功能：功能：合成合成rna引物引物反應(yīng)過程反應(yīng)過程：調(diào)節(jié)：調(diào)節(jié)：磷酸化的調(diào)節(jié)作用磷酸化的調(diào)節(jié)作用pol

26、/引發(fā)酶復(fù)合物引發(fā)酶復(fù)合物首先，合成首先，合成rna引物；引物；其次，利用其次，利用dna聚合酶活性將引物延伸，產(chǎn)生起始聚合酶活性將引物延伸，產(chǎn)生起始dna（initiator dna，idna）短序列，形成）短序列，形成rna-dna引物；引物；最后，最后，pol /引發(fā)酶脫離模板鏈引發(fā)酶脫離模板鏈dna，發(fā)生，發(fā)生dna聚合聚合酶轉(zhuǎn)換（酶轉(zhuǎn)換（switch）。）。結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)： p70、p34和和p11組成異源三聚體組成異源三聚體功能：功能： 2. rpa的功能與的功能與e.coli的的ssb相似相似復(fù)制蛋白復(fù)制蛋白a（replication protein a，rpa）結(jié)合單鏈結(jié)合單鏈dn

27、a促使雙螺旋促使雙螺旋dna解旋解旋激活激活pol /引發(fā)酶活性引發(fā)酶活性為為pol 依賴復(fù)制因子依賴復(fù)制因子c（rfc）和增殖細(xì)胞核抗原）和增殖細(xì)胞核抗原（pcna）合成）合成dna所必需所必需rpa三聚體與三聚體與sv40 t抗原結(jié)合，組裝引發(fā)體復(fù)合物所必需抗原結(jié)合，組裝引發(fā)體復(fù)合物所必需rpa參與參與dna重組和修復(fù)重組和修復(fù)p140 結(jié)合結(jié)合pcnap40、p37和和p36組成穩(wěn)定的核心復(fù)合物，具有組成穩(wěn)定的核心復(fù)合物，具有依賴依賴dna的的atpase活性活性p38可能在可能在p140和核心復(fù)合物之間起連接作用和核心復(fù)合物之間起連接作用3. rfc與與e.coli dna聚合酶聚合酶

28、的的 -復(fù)合物功能相似復(fù)合物功能相似復(fù)制因子復(fù)制因子c（replication factor c，rfc）結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)：有有p140，p40，p38，p37、p36 5個亞基個亞基促使可滑動的促使可滑動的dna夾子夾子pcna結(jié)合于引物結(jié)合于引物-模板鏈，是模板鏈，是pol 在模板在模板dna鏈上組裝并形成具鏈上組裝并形成具有持續(xù)合成能力全酶所必需的。有持續(xù)合成能力全酶所必需的。rfc的功能：的功能： pcna是是pol 的進(jìn)行性因子，使的進(jìn)行性因子，使pol 獲得持續(xù)合成能力。獲得持續(xù)合成能力。 pcna是協(xié)調(diào)是協(xié)調(diào)dna復(fù)制、損傷修復(fù)、表觀遺傳和細(xì)胞周期復(fù)制、損傷修復(fù)、表觀遺傳和細(xì)胞周期調(diào)控

29、的核心因子。調(diào)控的核心因子。 pcna水平是檢測細(xì)胞增殖的重要指標(biāo)。水平是檢測細(xì)胞增殖的重要指標(biāo)。 pcna能激活能激活pol 。4. pcna是可滑動的是可滑動的dna夾子夾子增殖細(xì)胞核抗原增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，pcna）結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)：功能：功能：同源三聚體，可形成閉合環(huán)形的可滑動同源三聚體，可形成閉合環(huán)形的可滑動dnadna夾子。夾子。p125：催化亞基，具有：催化亞基，具有dna聚合酶活性和聚合酶活性和35 核酸外核酸外切酶活性，其切酶活性，其n端區(qū)與端區(qū)與pcna相互作用相互作用p50：輔助：輔助pcna激活激活p1255.

30、 dna聚合酶聚合酶 合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)：pol 分子是異源二聚體（分子是異源二聚體（p125和和p50）功能：功能：pol 合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈dna聚合酶聚合酶 fen1（flap endonuclease 1）具有核酸內(nèi)切酶和）具有核酸內(nèi)切酶和53 核酸外切酶活性。核酸外切酶活性。fen1參與去除岡崎片段參與去除岡崎片段5 端的端的rna引物。引物。6. fen1和和rnase h切除切除rna引物引物rnase h是是核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶，參與岡崎片段成，參與岡崎片段成熟時熟時切除切除5 端端rna引物引物，底物，底物rna連接在連接在dna

31、鏈鏈的的5 端，切割后在端，切割后在dna鏈的鏈的5 端殘留一個核糖核端殘留一個核糖核苷酸，這個核苷酸再被苷酸，這個核苷酸再被fen1切除。切除。dna復(fù)制需要復(fù)制需要dna解旋酶打開解旋酶打開dna雙螺雙螺旋，使復(fù)制模板鏈得以暴露旋，使復(fù)制模板鏈得以暴露。7. dna解旋酶打開雙螺旋以暴露復(fù)制模板解旋酶打開雙螺旋以暴露復(fù)制模板8. 真核復(fù)制叉有真核復(fù)制叉有1個個pol 和和2個個pol 復(fù)合物復(fù)合物真核真核dna復(fù)制叉模型復(fù)制叉模型pol /引發(fā)酶引發(fā)酶合成合成rna-dna引物引物pol 合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈rfc 識別引物識別引物idna的的3 端并驅(qū)除端并驅(qū)除pol /

32、引發(fā)酶引發(fā)酶pcna 結(jié)合結(jié)合dna并引入并引入pol rnase h i/fen1 切除岡崎片段切除岡崎片段5 端的端的rna引物引物真核生物復(fù)制過程中酶及功能真核生物復(fù)制過程中酶及功能pol （或（或pol ）填補(bǔ)岡崎片段之間的空隙填補(bǔ)岡崎片段之間的空隙dna連接酶連接酶 封口封口rpa 穩(wěn)定解旋后的單鏈穩(wěn)定解旋后的單鏈dna解旋酶解旋酶 復(fù)制叉的形成和移動必不可少復(fù)制叉的形成和移動必不可少拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶 釋放復(fù)制叉前進(jìn)時產(chǎn)生的扭曲應(yīng)力釋放復(fù)制叉前進(jìn)時產(chǎn)生的扭曲應(yīng)力(三三) 引發(fā)和延伸發(fā)生引發(fā)和延伸發(fā)生dna聚合酶聚合酶 / 轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)換 識別染色體識別染色體dna復(fù)制起點(diǎn)和復(fù)制起點(diǎn)和d

33、na局部解旋后，局部解旋后，pol /引發(fā)酶復(fù)合物結(jié)合于復(fù)制起點(diǎn)，這一步引發(fā)酶復(fù)合物結(jié)合于復(fù)制起點(diǎn)，這一步叫做叫做引發(fā)體組裝引發(fā)體組裝。 引發(fā)體組裝引發(fā)體組裝包括包括dna解旋酶解旋酶與與pol /引發(fā)酶引發(fā)酶相相互作用?；プ饔?。1. 解旋酶與解旋酶與pol /引發(fā)酶相互作用組裝引發(fā)體引發(fā)酶相互作用組裝引發(fā)體 前導(dǎo)鏈：出現(xiàn)在引發(fā)后期前導(dǎo)鏈：出現(xiàn)在引發(fā)后期 后隨鏈：發(fā)生于每個岡崎片段合成之際后隨鏈：發(fā)生于每個岡崎片段合成之際 發(fā)生發(fā)生dna聚合酶聚合酶 / 轉(zhuǎn)換的原因是轉(zhuǎn)換的原因是pol 不具備不具備持續(xù)合成能力持續(xù)合成能力 dna聚合酶聚合酶 / 轉(zhuǎn)換的轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵蛋白是關(guān)鍵蛋白是rfc2. d

34、na聚合酶聚合酶 / 轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)換真核真核dna聚聚合酶轉(zhuǎn)換和合酶轉(zhuǎn)換和后隨鏈合成后隨鏈合成首先首先rnase h利用核酸內(nèi)切酶活性切割連接在岡利用核酸內(nèi)切酶活性切割連接在岡崎片段崎片段5 端的端的rna片段，在片段，在rna-dna引物連接點(diǎn)旁留下引物連接點(diǎn)旁留下1個核糖核苷酸；個核糖核苷酸；然后然后fen1利用利用53 核酸外切酶活性切除這最后一核酸外切酶活性切除這最后一個核糖核苷酸。個核糖核苷酸。(四四) 切除切除rna引物有兩種機(jī)制引物有兩種機(jī)制解旋酶解旋酶dna2具有依賴具有依賴dna的的atpase和和35 解旋酶解旋酶活性，其解旋作用可以使前一個岡崎片段的活性，其解旋作用可以使前一個

35、岡崎片段的5 端引物形成端引物形成“蓋子蓋子”結(jié)構(gòu)，再由結(jié)構(gòu)，再由fen1的內(nèi)切酶活性切除引物。的內(nèi)切酶活性切除引物。依賴依賴rnase h/fen1切除方式：切除方式：依賴依賴dna2/fen1切除方式：切除方式：切除切除rna引物的兩種機(jī)制引物的兩種機(jī)制rnase h/fen1dna2/fen1真核所有染色體真核所有染色體dna復(fù)制僅僅出現(xiàn)在細(xì)胞復(fù)制僅僅出現(xiàn)在細(xì)胞周期的周期的s期期，而且只能復(fù)制一次。，而且只能復(fù)制一次。( (五五) ) 真核染色體在每個細(xì)胞周期中只能復(fù)制真核染色體在每個細(xì)胞周期中只能復(fù)制一次一次1. 前復(fù)制復(fù)合物在前復(fù)制復(fù)合物在g1期形成而在期形成而在s期被激活期被激活真

36、核細(xì)胞真核細(xì)胞dna復(fù)制的起始分兩步進(jìn)行，即復(fù)制的起始分兩步進(jìn)行，即復(fù)復(fù)制基因的選擇制基因的選擇和和復(fù)制起點(diǎn)的激活。復(fù)制起點(diǎn)的激活。復(fù)制基因（復(fù)制基因（replicator）是指是指dna復(fù)制起始復(fù)制起始所所必需的必需的全部全部dna序列序列。 復(fù)制基因的選擇復(fù)制基因的選擇出現(xiàn)于出現(xiàn)于g1期期，基因組的每個復(fù)，基因組的每個復(fù)制基因位點(diǎn)均組裝制基因位點(diǎn)均組裝前復(fù)制復(fù)合物（前復(fù)制復(fù)合物（pre-replicative complex，pre-rc）。 復(fù)制起點(diǎn)的激活復(fù)制起點(diǎn)的激活出現(xiàn)于細(xì)胞進(jìn)入出現(xiàn)于細(xì)胞進(jìn)入s期期以后，這一以后，這一階段將階段將激活激活pre-rc，募集若干復(fù)制基因結(jié)合蛋，募集若干

37、復(fù)制基因結(jié)合蛋白和白和dna聚合酶，并起始聚合酶，并起始dna解旋。解旋。在原核細(xì)胞中，復(fù)制基因的識別與在原核細(xì)胞中，復(fù)制基因的識別與dna解解旋、募集旋、募集dna聚合酶偶聯(lián)進(jìn)行。而在真核細(xì)胞聚合酶偶聯(lián)進(jìn)行。而在真核細(xì)胞中，這兩個階段相分離可以確保每個染色體在中，這兩個階段相分離可以確保每個染色體在每個細(xì)胞周期中僅復(fù)制一次。每個細(xì)胞周期中僅復(fù)制一次。orc至少募集兩種解旋酶加載至少募集兩種解旋酶加載蛋白蛋白cdc6和和cdt1。復(fù)制起點(diǎn)識別復(fù)合物（復(fù)制起點(diǎn)識別復(fù)合物（originrecognition complex，orc）識別并結(jié)合復(fù)制基因。識別并結(jié)合復(fù)制基因。三種蛋白質(zhì)一起募集真核細(xì)胞

38、三種蛋白質(zhì)一起募集真核細(xì)胞解旋酶解旋酶mcm2-7。前復(fù)制復(fù)合物（前復(fù)制復(fù)合物（pre-rc）的形成）的形成pre-rc磷酸化導(dǎo)致在復(fù)制起點(diǎn)組裝其他復(fù)制因子磷酸化導(dǎo)致在復(fù)制起點(diǎn)組裝其他復(fù)制因子并起始復(fù)制，復(fù)制因子包括并起始復(fù)制，復(fù)制因子包括3種種dna聚合酶。聚合酶。dna聚合酶在復(fù)制起點(diǎn)按一定順序組裝：首先聚合酶在復(fù)制起點(diǎn)按一定順序組裝：首先pol 和和pol 結(jié)合，然后是結(jié)合，然后是pol /引發(fā)酶。引發(fā)酶。在在s期期，pre-rc被蛋白激酶（被蛋白激酶（ddk和和cdk）磷）磷酸化，從而被激活。酸化，從而被激活。pre-rc的激活的激活和組裝真核和組裝真核dna復(fù)制叉復(fù)制叉（1）激活）激

39、活pre-rc，以起始，以起始dna復(fù)制；復(fù)制；（2）抑制形成新的）抑制形成新的pre-rc。2. cdk控制控制pre-rc的形成和激活的形成和激活真核細(xì)胞通過依賴細(xì)胞周期蛋白的蛋白激真核細(xì)胞通過依賴細(xì)胞周期蛋白的蛋白激酶（酶（cyclin-dependent kinases，cdk）嚴(yán)格控制）嚴(yán)格控制pre-rc的形成和激活。的形成和激活。cdk功能：功能：在每個細(xì)胞周期過程中，僅有一次機(jī)會形成在每個細(xì)胞周期過程中，僅有一次機(jī)會形成pre-rc，也僅有一次機(jī)會激活，也僅有一次機(jī)會激活pre-rc。pre-rc在被激活后即解體，所暴露的復(fù)制基在被激活后即解體，所暴露的復(fù)制基因可形成新的因可形

40、成新的pre-rc并迅速結(jié)合并迅速結(jié)合orc。但在。但在s、g2和和m期，高活性的期，高活性的cdk抑制抑制pre-rc的其他組分的其他組分結(jié)合結(jié)合orc。只有當(dāng)染色體分離和細(xì)胞分裂完成時，。只有當(dāng)染色體分離和細(xì)胞分裂完成時，cdk的活性消失，新的的活性消失，新的pre-rc才能形成。才能形成。( (六六) )端粒酶確保染色體末端復(fù)制完整端粒酶確保染色體末端復(fù)制完整 前導(dǎo)鏈前導(dǎo)鏈產(chǎn)生產(chǎn)生完整完整的子染色單體。的子染色單體。后隨鏈后隨鏈3 3 端留下端留下縮短的縮短的未復(fù)制的未復(fù)制的ssdna區(qū)區(qū)。端粒（端粒（telomeres）由富含由富含tg的重復(fù)序列組成。的重復(fù)序列組成。人的端粒重復(fù)序列為

41、人的端粒重復(fù)序列為5-ttaggg-3 。這些重復(fù)序列多為雙鏈，但每個染色體的這些重復(fù)序列多為雙鏈，但每個染色體的3端比端比5 端長，形成單鏈端長，形成單鏈ssdna。這一特殊結(jié)構(gòu)可解決。這一特殊結(jié)構(gòu)可解決染色體末端復(fù)制問題。染色體末端復(fù)制問題。端粒酶（端粒酶（telomerase）是一種核糖核蛋白（是一種核糖核蛋白（rnp），），由由rna和蛋白質(zhì)組成。和蛋白質(zhì)組成。端粒酶以自己的端粒酶以自己的rna組分作為模板，以染色體的組分作為模板，以染色體的3 端端ssdna（后隨鏈模板）（后隨鏈模板）為引物，將端粒序列添加為引物，將端粒序列添加于染色體的于染色體的3 端。這些新合成的端。這些新合成的

42、dna為單鏈為單鏈。 dna聚合酶聚合酶 ：催化合成催化合成dna dna解旋酶（解旋酶（helicase）：）：解開解開dna雙螺旋，暴露雙螺旋，暴露復(fù)制模板鏈復(fù)制模板鏈 引發(fā)酶引發(fā)酶 ：引發(fā)，即合成引發(fā)，即合成rna引物，利用引物引物，利用引物3-oh開始延伸開始延伸 dna連接酶：連接酶：連結(jié)岡崎片段連結(jié)岡崎片段 其他酶和蛋白因子其他酶和蛋白因子小結(jié)：小結(jié)：dna復(fù)制需要多種酶參與復(fù)制需要多種酶參與如：起穩(wěn)定作用的單鏈如：起穩(wěn)定作用的單鏈dna結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白（ssb）和改變）和改變dna超螺旋狀態(tài)的超螺旋狀態(tài)的dna拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase）等）等dna聚合酶的

43、聚合酶的合成前誤差控制合成前誤差控制(presynthetic error control)和和校正控制校正控制(proofreading control)功能。功能。細(xì)胞修復(fù)系統(tǒng)細(xì)胞修復(fù)系統(tǒng)是是dna復(fù)制高度忠實(shí)性的重要因素。復(fù)制高度忠實(shí)性的重要因素。復(fù)制起始利用引物復(fù)制起始利用引物也是確保也是確保dna復(fù)制忠實(shí)性的重要復(fù)制忠實(shí)性的重要機(jī)制之一。機(jī)制之一。dna復(fù)制具有高度忠實(shí)性復(fù)制具有高度忠實(shí)性 dna復(fù)制是雙向復(fù)制復(fù)制是雙向復(fù)制 一個起點(diǎn)，兩個復(fù)制叉，雙向復(fù)制。一個起點(diǎn)，兩個復(fù)制叉，雙向復(fù)制。 兩個起點(diǎn)，兩個生長點(diǎn)，單向復(fù)制。兩個起點(diǎn)，兩個生長點(diǎn)，單向復(fù)制。 一個起點(diǎn)，一個復(fù)制叉，單向復(fù)

44、制。一個起點(diǎn)，一個復(fù)制叉，單向復(fù)制。dna鏈的合成鏈的合成3種方式：種方式：線粒體線粒體dna的的d環(huán)（環(huán)（d-loop）復(fù)制）復(fù)制噬菌體的滾環(huán)（噬菌體的滾環(huán)（rolling circle）復(fù)制）復(fù)制 三、線粒體和噬菌體三、線粒體和噬菌體dna復(fù)制具有特殊方式復(fù)制具有特殊方式（一）（一）線粒體線粒體dna按按d環(huán)方式復(fù)制環(huán)方式復(fù)制環(huán)形、雙螺旋環(huán)形、雙螺旋dna分子分子兩條鏈一條為重鏈（兩條鏈一條為重鏈（h鏈），另一條為輕鏈（鏈），另一條為輕鏈（l鏈）鏈）dntpdna-pol 線粒體線粒體dna分子特點(diǎn)：分子特點(diǎn)：l有特異的復(fù)制起點(diǎn)；有特異的復(fù)制起點(diǎn)；l環(huán)形線粒體環(huán)形線粒體dna兩條鏈（兩條鏈

45、（h和和l）的復(fù)制不同步）的復(fù)制不同步d環(huán)或取代環(huán)（環(huán)或取代環(huán)（displacement loop）：線粒體）：線粒體dna復(fù)制開始以復(fù)制開始以h鏈作為模板合成新的鏈作為模板合成新的l鏈，取鏈，取代原來的代原來的l鏈并和鏈并和h鏈互補(bǔ)，而原來的鏈互補(bǔ)，而原來的l鏈則保持鏈則保持單鏈狀態(tài)，形成類似英文字母單鏈狀態(tài)，形成類似英文字母d的區(qū)域；的區(qū)域；l兩條鏈具有不同的復(fù)制起點(diǎn)和相反的合成方向；兩條鏈具有不同的復(fù)制起點(diǎn)和相反的合成方向；l線粒體線粒體dna復(fù)制也需要復(fù)制也需要rna引物引物。線粒體線粒體dna復(fù)制特點(diǎn)：復(fù)制特點(diǎn)：（二）噬菌體（二）噬菌體dna按滾環(huán)方式復(fù)制按滾環(huán)方式復(fù)制環(huán)形雙螺旋環(huán)形

46、雙螺旋dna分子分子一條為模板鏈，另一條為非模板一條為模板鏈，另一條為非模板鏈鏈e.coli 噬菌體噬菌體dna的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：僅以一條鏈作為模板合成若干環(huán)形僅以一條鏈作為模板合成若干環(huán)形dna分子拷貝分子拷貝噬菌體噬菌體dna復(fù)制的方式是滾環(huán)復(fù)制復(fù)制的方式是滾環(huán)復(fù)制噬菌體噬菌體dna復(fù)制特點(diǎn)：復(fù)制特點(diǎn)： 噬菌體噬菌體dna復(fù)制首先由它自己編碼的復(fù)制首先由它自己編碼的a蛋蛋白在白在非模板鏈非模板鏈上造成缺口，再以所產(chǎn)生的游離上造成缺口，再以所產(chǎn)生的游離3 端羥基作為引物，并在宿主細(xì)胞的端羥基作為引物，并在宿主細(xì)胞的dna聚合聚合酶、解旋酶和酶、解旋酶和ssb蛋白等作用下合成新鏈

47、，新蛋白等作用下合成新鏈，新鏈和模板鏈互補(bǔ)并取代了原來的非模板鏈。這鏈和模板鏈互補(bǔ)并取代了原來的非模板鏈。這種復(fù)制方式稱為滾環(huán)復(fù)制種復(fù)制方式稱為滾環(huán)復(fù)制 。滾環(huán)復(fù)制：滾環(huán)復(fù)制：3 -oh5 -p5 5 5 3 3 3 3 5滾環(huán)復(fù)制滾環(huán)復(fù)制5 5 3 3 5 雙螺旋雙螺旋dna在復(fù)制起點(diǎn)解鏈不一定導(dǎo)致兩條在復(fù)制起點(diǎn)解鏈不一定導(dǎo)致兩條鏈同時復(fù)制，也可能利用一條鏈作為模板起鏈同時復(fù)制，也可能利用一條鏈作為模板起始始dna合成。合成。雙螺旋雙螺旋dna的兩條的兩條dna鏈的復(fù)制起點(diǎn)也可能鏈的復(fù)制起點(diǎn)也可能處于不同的位置。處于不同的位置。滾環(huán)復(fù)制和滾環(huán)復(fù)制和d環(huán)不對稱復(fù)制的存在說明：環(huán)不對稱復(fù)制的存在

48、說明：dnadna的反轉(zhuǎn)錄合成的反轉(zhuǎn)錄合成reverse transcription第三節(jié)第三節(jié)rna腫瘤病毒腫瘤病毒 dna原病毒（或前病毒）原病毒（或前病毒） rna腫瘤病毒腫瘤病毒temin等提出，原病毒（等提出，原病毒（provirus）dna是是rna腫瘤病毒在復(fù)制過程中的中間物。腫瘤病毒在復(fù)制過程中的中間物。*反轉(zhuǎn)錄的發(fā)現(xiàn)發(fā)展了中心法則反轉(zhuǎn)錄的發(fā)現(xiàn)發(fā)展了中心法則dna中間模板分子（中間模板分子（mrna）蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)中心法則：中心法則：反轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)發(fā)展了中心法則反轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)發(fā)展了中心法則反轉(zhuǎn)錄病毒反轉(zhuǎn)錄病毒（retroviruses ）： rna病毒，病毒，含有含有反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)

49、錄酶反轉(zhuǎn)錄：反轉(zhuǎn)錄：在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下以在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下以rna為模板合成為模板合成dna的過程。的過程。rna指導(dǎo)的指導(dǎo)的dna聚合酶活性；聚合酶活性；dna指導(dǎo)的指導(dǎo)的dna聚合酶活性；聚合酶活性；rnase h的活性是指它能夠從的活性是指它能夠從53 和和35 兩個方向水解兩個方向水解dna-rna雜合分子中的雜合分子中的rna。一、一、反轉(zhuǎn)錄酶以反轉(zhuǎn)錄酶以trna為引物合成雙鏈為引物合成雙鏈cdna反轉(zhuǎn)錄酶有反轉(zhuǎn)錄酶有3種酶的活性：種酶的活性：反轉(zhuǎn)錄酶的結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)錄酶的結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)錄病毒反轉(zhuǎn)錄病毒rna基因組和原病毒基因組和原病毒反轉(zhuǎn)錄病毒反轉(zhuǎn)錄病毒rna基因組基因組轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈c

50、dna的途徑的途徑二、反轉(zhuǎn)錄病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的主要活動二、反轉(zhuǎn)錄病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的主要活動（一）（一）反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cdna（二）（二）雙鏈雙鏈cdna插入宿主染色體形成原病毒插入宿主染色體形成原病毒原病毒或前病毒：原病毒或前病毒：存在于真核染色體中和反轉(zhuǎn)存在于真核染色體中和反轉(zhuǎn)錄病毒錄病毒rna基因組相對應(yīng)的基因組相對應(yīng)的雙鏈雙鏈dna序列。序列。gag基因基因編碼幾種病毒核心蛋白（衣殼蛋白）編碼幾種病毒核心蛋白（衣殼蛋白）;pol基因基因編碼編碼3種酶：反轉(zhuǎn)錄酶、蛋白酶和整合酶種酶：反轉(zhuǎn)錄酶、蛋白酶和整合酶;env基因基因編碼插入病毒外膜磷脂雙層中的糖蛋白。編碼插入病毒外膜磷

51、脂雙層中的糖蛋白。（三）原病毒（三）原病毒dna轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生病毒rna具有自我復(fù)制能力的反轉(zhuǎn)錄病毒基因組具有自我復(fù)制能力的反轉(zhuǎn)錄病毒基因組含有含有3個基因：個基因：直接翻譯產(chǎn)生多蛋白直接翻譯產(chǎn)生多蛋白gag和和gag-pol。含有包裝信號，因此構(gòu)成完整的病毒基因組。含有包裝信號，因此構(gòu)成完整的病毒基因組。大約一半初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)過剪接加工形成大約一半初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)過剪接加工形成gag-pol mrna和和env mrna。原病毒初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有原病毒初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有3種重要功能：種重要功能：初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物多蛋白初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物多蛋白gag-pol，經(jīng)過蛋白酶水，經(jīng)過蛋白酶水解，可產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄酶、蛋白

52、酶和整合酶。解，可產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄酶、蛋白酶和整合酶。多蛋白多蛋白gag經(jīng)過加工，生成經(jīng)過加工，生成4種病毒衣殼蛋白。種病毒衣殼蛋白。env基因編碼的基因編碼的env蛋白，經(jīng)過加工以后插入病蛋白，經(jīng)過加工以后插入病毒外膜磷脂雙層。毒外膜磷脂雙層。這些病毒蛋白和病毒這些病毒蛋白和病毒rna基因組可以迅速組裝基因組可以迅速組裝成許多新的反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。成許多新的反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。（四）病毒（四）病毒rna經(jīng)翻譯和包裝形成反轉(zhuǎn)錄經(jīng)翻譯和包裝形成反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒病毒顆粒dna損傷修復(fù)損傷修復(fù) dna damage and repair第四節(jié)第四節(jié) 一、一、多種因素通過不同形式可引起多種因素通過不同形式可引起dn

53、a損傷損傷 堿基開環(huán)和糖苷鍵斷裂引起堿基丟失堿基開環(huán)和糖苷鍵斷裂引起堿基丟失 輻射或氧化損傷等引起堿基改變輻射或氧化損傷等引起堿基改變 化學(xué)因素可引起核苷酸插入或缺失化學(xué)因素可引起核苷酸插入或缺失 輻射和化學(xué)損傷可引起輻射和化學(xué)損傷可引起dnadna鏈斷裂鏈斷裂 物理和化學(xué)因素可引起物理和化學(xué)因素可引起dnadna鏈間或鏈內(nèi)交聯(lián)鏈間或鏈內(nèi)交聯(lián) 其一，導(dǎo)致復(fù)制或轉(zhuǎn)錄障礙其一，導(dǎo)致復(fù)制或轉(zhuǎn)錄障礙其二，導(dǎo)致復(fù)制后產(chǎn)生基因突變其二，導(dǎo)致復(fù)制后產(chǎn)生基因突變dna損傷的結(jié)果損傷的結(jié)果: 二、二、dna損傷損傷修復(fù)系統(tǒng)有多種類型修復(fù)系統(tǒng)有多種類型dna聚合酶（y-家族），如e.coli：umuc嘧啶二聚體、

54、無嘌呤位點(diǎn)跨損傷dna合成e.coli：reca和recbcd雙鏈斷裂重組修復(fù)e.coli：uvra, uvrb, uvrc, uvrd人：xpc, xpa, xpd, ercci-xpf, xpg嘧啶二聚體，堿基烷基化核苷酸切除修復(fù)dna糖苷酶（即dna糖基水解酶）堿基損傷堿基切除修復(fù)嘧啶二聚體直接修復(fù)e.coli：muts, mutl, muth人：msh, mlh, pms 復(fù)制差錯錯配修復(fù)酶損傷修復(fù)系統(tǒng)的類型修復(fù)對象：修復(fù)對象：將將dna中因紫外線照射而形成的嘧啶中因紫外線照射而形成的嘧啶二聚體分解二聚體分解。機(jī)制：機(jī)制：細(xì)胞內(nèi)光裂合酶（細(xì)胞內(nèi)光裂合酶（photolyases）分子中生

55、）分子中生色基團(tuán)次甲四氫葉酸吸收光子并將色基團(tuán)次甲四氫葉酸吸收光子并將fadh2激活生激活生成的激發(fā)型成的激發(fā)型fadh2，再將電子轉(zhuǎn)移給嘧啶二聚體，再將電子轉(zhuǎn)移給嘧啶二聚體，使其還原。使其還原。分布：分布：分布廣泛，除哺乳動物外均有之。分布廣泛，除哺乳動物外均有之。（一）（一）直接修復(fù)（直接修復(fù)（direct repair）利用修復(fù)酶）利用修復(fù)酶簡單地逆轉(zhuǎn)簡單地逆轉(zhuǎn)dna損傷損傷光復(fù)活修復(fù)系統(tǒng)光復(fù)活修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)對象：修復(fù)對象：dna中被甲基化修飾的鳥嘌呤（中被甲基化修飾的鳥嘌呤（o6-甲甲基鳥嘌呤，與基鳥嘌呤，與t配對）。配對）。機(jī)制：機(jī)制：將甲基轉(zhuǎn)移到酶蛋白活性中心的將甲基轉(zhuǎn)移到酶蛋白活性

56、中心的cys殘基側(cè)殘基側(cè)鏈上，使鳥嘌呤復(fù)原，避免發(fā)生突變。鏈上，使鳥嘌呤復(fù)原，避免發(fā)生突變。特點(diǎn)：特點(diǎn)：dna甲基轉(zhuǎn)移酶一旦接受甲基就不再具有甲基轉(zhuǎn)移酶一旦接受甲基就不再具有催化活性催化活性 ，修復(fù)代價高昂，修復(fù)代價高昂 。o o6 6- -甲基鳥嘌呤甲基鳥嘌呤dnadna甲基轉(zhuǎn)移酶修復(fù)甲基轉(zhuǎn)移酶修復(fù) 糖苷酶（糖苷酶（glycosylases）識別、切除受損堿基，產(chǎn)生識別、切除受損堿基，產(chǎn)生ap位點(diǎn)（位點(diǎn)（apurinic or apyrimidinic site）。）。 ap內(nèi)切酶內(nèi)切酶在在ap位點(diǎn)的位點(diǎn)的5端切斷磷酸二酯鍵。端切斷磷酸二酯鍵。 ap外切酶外切酶再切割再切割ap位點(diǎn)的位點(diǎn)的3

57、端。端。 dna聚合酶聚合酶填補(bǔ)產(chǎn)生的缺口。填補(bǔ)產(chǎn)生的缺口。 最后最后dna連接酶連接酶連接。連接。（二）堿基切除系統(tǒng)修復(fù)切除受損堿基（二）堿基切除系統(tǒng)修復(fù)切除受損堿基堿基切除修復(fù)（堿基切除修復(fù)（base excision repair, ber）對象：對象：受損的堿基受損的堿基修復(fù)系統(tǒng)：修復(fù)系統(tǒng)：e.coli堿基切除修復(fù)系統(tǒng)堿基切除修復(fù)系統(tǒng)切除胞嘧啶自發(fā)脫氨基產(chǎn)生的尿嘧啶切除胞嘧啶自發(fā)脫氨基產(chǎn)生的尿嘧啶 胞嘧啶脫氨基產(chǎn)生的尿嘧啶；胞嘧啶脫氨基產(chǎn)生的尿嘧啶； 氧化的鳥嘌呤（氧化的鳥嘌呤（oxog）；）； 脫氨基的腺嘌呤；脫氨基的腺嘌呤； 開環(huán)堿基；開環(huán)堿基； 碳原子之間雙鍵變成單鍵的堿基等。碳

58、原子之間雙鍵變成單鍵的堿基等。 dnadna糖苷酶識別的異常堿基包括：糖苷酶識別的異常堿基包括：功能：功能：利用利用dna糖苷酶糖苷酶切除切除dna復(fù)制復(fù)制前前未去除的未去除的損傷堿基損傷堿基。自動防故障（自動防故障（fail-safe）系統(tǒng)）系統(tǒng)堿基切除修復(fù)系統(tǒng)切除鳥嘌呤氧化產(chǎn)物堿基切除修復(fù)系統(tǒng)切除鳥嘌呤氧化產(chǎn)物oxogdna聚合酶聚合酶和和連接酶連接酶以未損傷的以未損傷的dna鏈為模鏈為模板修補(bǔ)缺口。板修補(bǔ)缺口。（三）核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)（三）核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)識別識別dna雙螺旋雙螺旋變形變形核苷酸切除修復(fù)（核苷酸切除修復(fù)（nucleotide excision repair, ner）系

59、統(tǒng)識別系統(tǒng)識別dna雙螺旋形狀的變形。雙螺旋形狀的變形。e.coli的的ner主要由主要由4種種蛋白質(zhì)組成：蛋白質(zhì)組成：uvrauvrbuvrcuvrd uvra識別識別dna雙螺旋結(jié)構(gòu)變形雙螺旋結(jié)構(gòu)變形uvrb負(fù)責(zé)解鏈，募集核酸內(nèi)切酶負(fù)責(zé)解鏈，募集核酸內(nèi)切酶uvrcuvrc在損傷部位的兩側(cè)切斷在損傷部位的兩側(cè)切斷dna鏈鏈uvrd去除這兩個切點(diǎn)之間的去除這兩個切點(diǎn)之間的dna片段片段dna聚合酶聚合酶和連接酶填補(bǔ)缺口和連接酶填補(bǔ)缺口核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng) xpc蛋白負(fù)責(zé)發(fā)現(xiàn)蛋白負(fù)責(zé)發(fā)現(xiàn)dna雙螺旋中的變形雙螺旋中的變形 xpa 和和xpd蛋白具有解旋酶活性蛋白具有解旋酶活性 核

60、酸酶核酸酶ercc1-xpf切割損傷部位切割損傷部位5側(cè)，側(cè)，xpg切割切割3側(cè)側(cè) dna聚合酶和連接酶負(fù)責(zé)填補(bǔ)產(chǎn)生的缺口聚合酶和連接酶負(fù)責(zé)填補(bǔ)產(chǎn)生的缺口高等真核生物的高等真核生物的ner作用：作用：ner不僅能夠修復(fù)整個基因組中的損傷，而不僅能夠修復(fù)整個基因組中的損傷，而且能拯救因轉(zhuǎn)錄模板鏈損傷而暫停轉(zhuǎn)錄的且能拯救因轉(zhuǎn)錄模板鏈損傷而暫停轉(zhuǎn)錄的rna聚合聚合酶，即參與酶，即參與轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)（轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)（transcription-coupled repair）。作用方式：作用方式：ner蛋白質(zhì)被募集于暫停的蛋白質(zhì)被募集于暫停的rna聚合酶。聚合酶。轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)的意義：轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)的意義：將修