米醇溶蛋白及殼聚糖共混合膜對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響

1、www.CRTER.org李春亮，等. 米醇溶蛋白及殼聚糖共混合膜對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響米醇溶蛋白及殼聚糖共混合膜對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響李春亮1，秦 鳳2，李林昌1，唐保明1，李釗偉1(青海大學(xué)附屬醫(yī)院，1骨科，2內(nèi)分泌科，青海省西寧市 810000)引用本文：李春亮，秦鳳，李林昌，唐保明，李釗偉. 米醇溶蛋白及殼聚糖共混合膜對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響J.中國組織工程研究，2016，20(21):3071-3079.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.21.005 ORCID: 0000-0002-0165-911X(李釗偉)文章快速

2、閱讀：玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化李春亮，男，1978年生，山東省鄆城縣人，2014年青海大學(xué)畢業(yè)，碩士，主治醫(yī)師，主要從事干細(xì)胞基礎(chǔ)研究和創(chuàng)傷骨科臨床研究。通訊作者：李釗偉，副主任醫(yī)師，副教授，青海大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，青海省西寧市 810000中圖分類號(hào):R318文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):2095-4344(2016)21-03071-09稿件接受：2016-03-08http:/WWW.殼聚糖含量從0%到100%的一系列玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜隨著殼聚糖含量的增加，復(fù)合膜的拉伸強(qiáng)度、斷裂伸長率、吸水率、親水性增強(qiáng)評(píng)價(jià)其理化性能和細(xì)胞相容性評(píng)價(jià)成骨

3、誘導(dǎo)分化能力殼聚糖改善了復(fù)合膜的親水性，有效促進(jìn)了細(xì)胞黏附、生長及增殖在誘導(dǎo)液作用下，ZC-n復(fù)合膜能夠誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化成骨細(xì)胞，隨著殼聚糖含量的增加，其促進(jìn)分化的效果越明顯 文題釋義：玉米醇溶蛋白：來源于玉米，是一種天然蛋白，又稱醇溶谷蛋白。據(jù)Mckinney分類，可將其分為-zein和-zein，其富含含硫氨基酸，可以形成較強(qiáng)的分子內(nèi)二硫鍵，且與分子之間的疏水鍵一起構(gòu)成了玉米醇溶蛋白成膜的分子基礎(chǔ)。玉米醇溶蛋白具有良好的可降解性、無毒副作用和血液相容性，同時(shí)，還有促進(jìn)骨組織再生的生物活性和易于血管化形成等特性，但是其存在力學(xué)性能差、細(xì)胞黏附性差及親水性不足等缺陷。殼聚糖：是由甲殼素

4、經(jīng)過脫乙酰作用而來，它是由-(14)-2-乙酰胺-2-脫氧-D-葡聚糖和少量的-(14)-2-氨基-2-脫氧-D-葡聚糖組成。一般呈白色或淡黃色半透明狀固體，其分子結(jié)構(gòu)為鏈狀與纖維素相似，易結(jié)晶，具有優(yōu)良的理化性質(zhì)，良好的生物相容性和可降解性等優(yōu)點(diǎn)，還具有可以改善其他材料的力學(xué)性能、親水性和生物相容性等能力。摘要背景：有學(xué)者通過殼聚糖與玉米醇溶蛋白共混改性，制備了玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜，初步評(píng)價(jià)了其理化性能，表明殼聚糖在一定程度上改善了玉米醇溶蛋白的力學(xué)性能和親水性能，由此，作者預(yù)期玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜具有良好細(xì)胞相容性，益于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。目的：探討玉米醇溶蛋白/殼聚糖

5、復(fù)合膜對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響，探索其作為骨組織工程材料的可行性。方法：以60%醋酸為溶劑，通過共混和流延法制備玉米醇溶蛋白/殼聚糖(ZC-n)復(fù)合膜。采用傅里葉紅外光譜分析、力學(xué)性能測(cè)試、吸水率及掃描電鏡等方法來表征其結(jié)構(gòu)與理化性能。利用體外細(xì)胞培養(yǎng)方法評(píng)價(jià)復(fù)合膜的細(xì)胞相容性。通過貼壁分離篩選法分離SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，利用掃描電鏡、熒光標(biāo)記、堿性磷酸酶測(cè)定等方法評(píng)價(jià)玉米醇溶蛋白殼聚糖復(fù)合膜對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響。結(jié)果與結(jié)論：隨著殼聚糖含量的增加，ZC-n復(fù)合膜的拉伸強(qiáng)度得到提高，吸水率及親水性得到增強(qiáng)；殼聚糖具有促進(jìn)細(xì)胞黏附、生長和增殖的作用，即ZC-n膜表現(xiàn)出良好的

6、細(xì)胞相容性；ZC-n膜與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞結(jié)合并將其誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，且隨著殼聚糖含量的增加，其誘導(dǎo)分化的效果越明顯；結(jié)果表明，玉米醇溶蛋白殼聚糖復(fù)合膜在骨組織工程領(lǐng)域中具有一定的應(yīng)用潛能。關(guān)鍵詞：生物材料；材料相容性；玉米醇溶蛋白；殼聚糖；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；生物相容性主題詞：骨髓；間質(zhì)干細(xì)胞；玉米醇溶蛋白；殼聚糖；生物相容性材料；組織工程3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083Li Chun-liang, Master, Attending physician, Department of Orthopedics, Affiliated Hospit

7、al of Qinghai University, Xining 810000, Qinghai Province, ChinaCorresponding author: Li Zhao-wei, Associate chief physician, Associate professor, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Qinghai University, Xining 810000, Qinghai Province, ChinaEffect of zein/chitosan composite membrane on

8、 the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cellsLi Chun-liang1, Qin Feng2, Li Lin-chang1, Tang Bao-ming1, Li Zhao-wei1 (1Department of Orthopedics, 2Department of Endocrinology, Affiliated Hospital of Qinghai University, Xining 810000, Qinghai Province, China)AbstractBACKGROUND:

9、 Some scholars have prepared zein/chitosan composite membrane based on blending methods, and preliminary evaluation of its physical and chemical properties shows that chitosan partly improves the mechanical properties and hydrophilic properties of zein. Therefore, zein/chitosan composite membrane pr

10、esumably has good cytocompatibility, which is beneficial to osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.OBJECTIVE: To explore the effect of zein/chitosan composite membrane on the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into osteoblasts and its feasibility as a bon

11、e tissue-engineered material.METHODS: With 60% acetic acid as solvent, zein/chitosan composite membrane was prepared by blending and casting method. The structure and physicochemical properties of the composite membrane were investigated by Fourier transform infrared spectroscopy, tensile testing, w

12、ater absorption testing and scanning electron microscopy. And the cytocompatibility of the membrane was evaluated by in vitro cell cufture. Besides, bone marrow mesenchymal stem cells from Sprague-Dawley rat were isolated via adherence screening method, and the effects of the composite membrane on t

13、he osteogenic differentiation of these cells were observed by scanning electron microscopy, fluorescent labeling and alkaline phosphatase assay.RESULTS AND CONCLUSION: The tensile strength, water absorption and hydrophilicity of the films were improved with the chitosan increased; chitosan could pro

14、mote cell proliferation indicating the good cytocompatibility of the composite films. Moreover, osteogenic induction occurred in bone marrow mesenchymal stem cells cultured on the composite membrane, and with an increase of chitosan, the induction was promoted. In conclusion, zein/chitosan composite

15、 membrane can be applied widely in the field of bone tissue engineering.Subject headings: Bone Marrow; Mesenchymal Stem Cells; Zein; Chitosan; Biocompatible Materials; Tissue EngineeringCite this article: Li CL, Qin F, Li LC, Tang BM, Li ZW. Effect of zein/chitosan composite membrane on the osteogen

16、ic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(21):3071-3079.3077ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction玉米醇溶蛋白是天然植物蛋白，具有良好的可降解性、血液相容性和無毒副作用，同時(shí)還有促進(jìn)骨組織再生的生物活性和易于血管化形成等特性，但是其存在力學(xué)性能差(易脆)、細(xì)胞黏附性差及親水性不足等缺陷，需進(jìn)一步改性才可能擴(kuò)大其在生物材料領(lǐng)域的應(yīng)用。殼聚糖是自然界

17、中惟一堿性多糖，具有優(yōu)良的理化性質(zhì)，良好的生物相容性和可降解性等優(yōu)點(diǎn)，還具有可以改善其他材料的力學(xué)性能、親水性和生物相容性等能力。有學(xué)者通過殼聚糖與玉米醇溶蛋白共混改性，制備了玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜，初步評(píng)價(jià)了其理化性能，表明殼聚糖在一定程度上改善了玉米醇溶蛋白的力學(xué)性能和親水性能，由此，作者預(yù)期玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜具有良好細(xì)胞相容性，益于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化1-3?；谝陨侠碛桑瑢?shí)驗(yàn)制備殼聚糖改性的玉米醇溶蛋白復(fù)合膜材料，評(píng)價(jià)復(fù)合膜的理化性能，重點(diǎn)評(píng)價(jià)其細(xì)胞相容性，研究其對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用，為其應(yīng)用于骨組織工程領(lǐng)域提供依據(jù)。1 材料和方法 Materials a

18、nd methods 1.1 設(shè)計(jì) 細(xì)胞-材料體外觀察實(shí)驗(yàn)。1.2 時(shí)間及地點(diǎn) 于2015年7至10月在青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室完成。1.3 材料1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取4-6周齡SD大鼠20只，雌雄不限，體質(zhì)量(68.7±5.52) g，購自青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。1.3.2 試劑 -甘油磷酸鈉、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、地塞米松、吲哚美辛、胰島素、青鏈霉素(Sigma)；高糖、低糖DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)；抗壞血酸(青海中諾生物)；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(Gibio)；二甲基亞砜(上?；瘜W(xué)試劑有限公司)；磷酸鹽緩沖液(青海中諾生物)；玉米醇溶蛋白(西寧市日月辰用輔料有限公司

19、)；殼聚糖(南通興成生物制品廠)；胰蛋白酶(吉諾生物科技有限公司)；醋酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；氨水(青海中天化工責(zé)任有限公司)；其余試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?.4 實(shí)驗(yàn)方法1.4.1 玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜的制備 以玉米醇溶蛋白和殼聚糖為主要原料，以醋酸為其溶劑，制備玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜。具體方法如下：將玉米醇溶蛋白與殼聚糖分別溶于60%的醋酸水溶液中，制備成3%的玉米醇溶蛋白醋酸溶液和3%的殼聚糖醋酸溶液，將上述兩種溶液按一定的比例共混，室溫下機(jī)械攪拌至完全溶解，經(jīng)紗布過濾后于4 下以6 000×g速率離心脫氣10 min，得到玉米醇溶蛋白/殼聚糖共混液。將共混液

20、倒入方形塑料平皿內(nèi)，室溫下靜置12 h，然后轉(zhuǎn)至 40 烘箱中干燥8 h，揭膜，再經(jīng)流水沖洗，貼膜干燥，保存于干燥器中備用。樣品編號(hào)為ZC-n，其中，Z 表示玉米醇溶蛋白(zein)，C表示殼聚糖(chitosan)；n表示玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜中殼聚糖所占含量百分比(n為0，10，30，50，70，90和100)。例如，當(dāng)n=10時(shí)，表示為玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜中殼聚糖的原始固含量為10%。1.4.2 玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜的結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì) 采用TNZ1-5700型傅里葉紅外光譜儀記錄膜表面的紅外光譜圖，掃描范圍為4 000-600 cm-1。玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜經(jīng)過液氮冷

21、凍(10 min)，折斷，真空干燥后，將各樣品的斷面分別粘貼于銅臺(tái)上，經(jīng)離子濺射儀噴金鍍膜后，用掃描電子顯微鏡觀察其斷面形態(tài)。加速電壓為25 kV。將已真空干燥的復(fù)合膜切成1 cm×3 cm大小的膜片，稱質(zhì)量(m1)，浸入含有去離子水的玻璃容器中，室溫靜置48 h，小心取出，用濾紙吸去表面水分，稱質(zhì)量(m2)。吸水率(Q)按下式計(jì)算：Q=(m2-m1)/m1 × 100%，其中每個(gè)樣品測(cè)3次，取其平均值。將已真空干燥的復(fù)合膜切成1 cm×3 cm大小的膜片，稱質(zhì)量(m1)，將其浸入到體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇溶液的玻璃容器中，室溫靜置24 h，用濾紙吸去表面乙醇溶液，再

22、置于真空干燥6 h，稱質(zhì)量(m2)。質(zhì)量變化(Mloss)按以下式計(jì)算：Mloss=(m1-m2)/m1×100%，其中每個(gè)樣品測(cè)3次，取其平均值。再取出浸泡后的復(fù)合膜經(jīng)過液氮冷凍 (10 min)，折斷，真空干燥后，將各樣品的段面粘貼于銅臺(tái)上，經(jīng)離子濺射儀噴金鍍膜后，用掃描電子顯微鏡觀察其斷面形態(tài)。加速電壓為20 kV。將玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜裁制成10 cm×1 cm長條，將其裝在含有飽和碳酸鉀水溶液的干燥器內(nèi)平衡7 d，樣品在蒸餾水中浸泡1 h后測(cè)量的值則是相對(duì)濕態(tài)下的拉伸強(qiáng)度及斷裂伸長率，按照GB4456-84標(biāo)準(zhǔn)用電子拉力機(jī)檢測(cè)復(fù)合膜在K2CO3氛圍下及浸泡蒸

23、餾水后的拉伸強(qiáng)度及斷裂伸長率，拉伸速率為50 mm/min。每個(gè)樣品測(cè)試3次以上，取平均值。1.4.3 玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜的生物學(xué)性能評(píng)價(jià) 依據(jù)ISO10993-5系列標(biāo)準(zhǔn)4，通過CCK-8 法評(píng)價(jià)玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜的細(xì)胞相容性。1.4.4 玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響 參照文獻(xiàn)5-6方法進(jìn)行熒光顯微鏡觀察和電鏡觀察及堿性磷酸酶測(cè)定。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)：取4-6周齡SD大鼠經(jīng)頸椎脫位法處死，乙醇浸泡10 min，取長骨(肱骨、股骨、脛骨)，剔除肌肉組織，在超凈工作臺(tái)內(nèi)清洗3-5次，剪掉長骨兩端，暴露骨髓腔，用5 mL注射器吸取5 mL沖洗液(

24、體積分?jǐn)?shù)為3%胎牛血清+97%PBS)沖洗骨髓腔(兩端沖洗)。收集液體至離心管，1 500 r/min離心5 min，棄上清重懸細(xì)胞，以1×108 L-1細(xì)胞濃度接種于培養(yǎng)瓶中，加適量DMEM培養(yǎng)基，在培養(yǎng)瓶上標(biāo)記動(dòng)物種屬、細(xì)胞類別、原代、日期，每3 d換液。當(dāng)細(xì)胞生長至80%融合時(shí)胰酶消化、收集、離心，以1×108 L-1細(xì)胞濃度接種于培養(yǎng)瓶中。熒光標(biāo)記：取出高壓滅菌的樣品，分別放入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。加1 mL培養(yǎng)基于復(fù)合膜上，放入37 的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中浸潤4 h。將第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制成細(xì)胞懸液1.6 mL(細(xì)胞濃度約2×107 L-1)，在復(fù)合膜表

25、面滴加細(xì)胞懸液200 L，并且在空白孔中加入同樣濃度同體積的細(xì)胞作為陰性對(duì)照組，放入37 的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。觀察細(xì)胞貼壁情況，待細(xì)胞達(dá)到70%-80%融合后，將培養(yǎng)基換成成骨誘導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo)，每3 d換液，共誘導(dǎo)21 d。將樣品用PBS洗3次，將鈣黃綠素溶解在二甲基亞砜中得到0.5 g/L的鈣黃綠素溶液，取500 L鈣黃綠素溶液滴加至樣品上，37 下孵育 30 min，去除溶液用PBS漂洗3次，熒光顯微鏡觀察。掃描電鏡觀察：取出高壓滅菌的樣品，分別放入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加1 mL培養(yǎng)基于復(fù)合膜上，放入 37的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中浸潤4 h。將第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制成細(xì)胞懸液1.

26、6 mL(細(xì)胞濃度約2×107 L-1)，再在復(fù)合膜表面滴加細(xì)胞懸液200 L，在空白孔中加入同樣濃度同體積的細(xì)胞作為陰性對(duì)照組，放入37 的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。觀察細(xì)胞貼壁情況，待細(xì)胞達(dá)到70%-80%融合后，將培養(yǎng)基換成成骨誘導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo)，每3 d換液，共誘導(dǎo)21 d。將樣品用PBS漂洗2次，再加入適量的2.5%戊二醛溶液于4 下固定過夜，然后用PBS漂洗2次，取出樣品，用錫箔紙包裹并做好標(biāo)記，置于液氮浸泡10 min，真空干燥、黏臺(tái)、鍍金后，用掃描電鏡觀察樣品表面的細(xì)胞形態(tài)并照相。堿性磷酸酶測(cè)定：將ZC-n膜分別剪成0.2 cm× 0.2 cm的薄片，用錫

27、箔紙包裹并做好標(biāo)記，于121 高壓滅菌30 min后，分別放入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。將第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制成細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度約2×107 L-1)，每組5孔，每孔100 L細(xì)胞懸液接種于復(fù)合膜上，在空白孔中加入同樣濃度和同體積的細(xì)胞作為陰性對(duì)照組，放入37 的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，移去培養(yǎng)液，每孔再加入100 L成骨誘導(dǎo)液，每3 d換液1次，7 d后取出樣品，吸去成骨誘導(dǎo)液，用PBS漂洗1次或2次，配制含NaHCO3(0.1 mol/L)的MgCl2溶液 2.0 mmol/L，用該溶液(50 mL)溶解對(duì)硝基酚磷酸二鈉(0.062 g)制備成底物反應(yīng)液，加

28、入上述96孔板中 (100 L/孔)，37 孵育1 h，當(dāng)顏色變黃時(shí)，再加入終止液NaOH(0.1 mol/L)，靜止5 min后，將上述反應(yīng)終止液移至另一96孔板中，用酶標(biāo)儀檢測(cè)405 nm處的吸光度值。1.5 主要觀察指標(biāo) 玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜的結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)。玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜的生物學(xué)性能。玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的能力。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示，采用t 檢驗(yàn)，用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，P < 0.05為差異有顯著性意義。2 結(jié)果 Results 2.1 玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜的結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)

29、2.1.1 傅里葉紅外光譜分析(FTIR) 圖1為玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜的表面紅外光譜圖。實(shí)驗(yàn)顯示，隨著殼聚糖含量的增加，酰胺和酰胺向高波數(shù)移動(dòng)，其結(jié)果證明玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜形成了較強(qiáng)的氫鍵。2.1.2 掃描電鏡觀察斷面結(jié)構(gòu) 圖2所示為玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜斷面掃描電鏡圖片。純的玉米醇溶蛋白(ZC-0)斷面結(jié)構(gòu)較為均一，隨著殼聚糖含量的增加，斷面上出現(xiàn)一些紋理結(jié)構(gòu)和鱗片結(jié)構(gòu)。這種較大鱗片狀的斷面結(jié)構(gòu)，表明樣品分子鏈之間相互作用增加，在拉伸或扭曲時(shí)不易斷裂。2.1.3 吸水率 圖3所示為玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜的吸水率曲線。復(fù)合膜在0.5 h左右吸收水分快速上升，0.5 h后吸

30、收峰上升非常緩慢，8 h后膜吸水基本達(dá)到平衡。隨著殼聚糖含量的增加，復(fù)合膜的吸水率增加進(jìn)而達(dá)到平衡。達(dá)到平衡時(shí)，復(fù)合膜的吸水率從ZC-10的60%左右上升到了ZC-90的130%左右。2.1.4 復(fù)合膜在乙醇中的溶解率 圖4所示為玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜在體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇中浸泡 24 h的失質(zhì)量率。純殼聚糖在乙醇中失質(zhì)量率幾乎為0%，即幾乎無質(zhì)量損失，而純玉米醇溶蛋白在乙醇中失質(zhì)量率接近100%，即完全溶解。圖5所示為玉米醇溶蛋白/殼聚糖膜在乙醇浸泡后的斷面掃描電鏡圖。玉米醇溶蛋白以顆粒狀在ZC-n復(fù)合膜中呈均勻分布。同時(shí)，隨著殼聚糖含量的增加，孔隙逐漸減少且孔徑變小。2.1.5 力學(xué)性

31、能測(cè)試 圖6所示為玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜在飽和碳酸鉀氛圍平衡后和在水中浸泡后的拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長率。在飽和K2CO3 氛圍下平衡1周后，隨著殼聚糖含量從0%到100%，膜材料的拉伸強(qiáng)度從7.5%逐漸升至111.2%，而斷裂伸長率則由1.2%緩慢升至35%。隨著殼聚糖含量從0%到100%，拉伸強(qiáng)度在9.8%-28.9%之間，而斷裂伸長率在1.5%-122.1%之間。這一趨勢(shì)與飽和K2CO3氛圍下平衡1周后力學(xué)性能趨勢(shì)大致相同。2.2 玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜的生物學(xué)性能 表1 所示為經(jīng)分離提純的第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與ZC-n 復(fù)合膜的浸提液共培養(yǎng)1，3，5，7 d的細(xì)胞增殖活性與培養(yǎng)時(shí)間

32、的關(guān)系。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，細(xì)胞與浸提液共培養(yǎng)第1天和第3天，樣品ZC-n組的細(xì)胞增殖率與空白對(duì)照組差異無顯著性意義，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長至第5天和第7天，所有樣品組的吸光度值隨之增加，其中第5天的ZC-0組(P=0.019)及第7天的ZC-0組(P=0.029)、ZC-10組(P=0.014)、ZC-90組(P=0.003)、ZC-100組(P=0.011)的細(xì)胞增殖率均高于空白對(duì)照組(P < 0.05)。2.3 玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化2.3.1 熒光標(biāo)記 圖7為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與ZC-n復(fù)合膜共培養(yǎng)后分化為成骨細(xì)胞的光鏡圖。在誘導(dǎo)組中，細(xì)胞數(shù)量隨著殼聚糖含量的增

33、加而逐漸增多，這是由于含大量親水基團(tuán)的殼聚糖改善了玉米醇溶蛋白的疏水性，使該復(fù)合膜能有效地吸附蛋白質(zhì)，進(jìn)而增強(qiáng)了該膜的細(xì)胞黏附性。圖8所示為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與ZC-n復(fù)合膜共培養(yǎng)后分化為成骨細(xì)胞的熒光圖，在熒光顯微鏡下，鈣黃綠素標(biāo)記的細(xì)胞發(fā)綠色熒光。隨著殼聚糖含量的增加，熒光強(qiáng)度相對(duì)增強(qiáng)，這是由于殼聚糖改善了復(fù)合膜的親水性。2.3.2 掃描電鏡觀察結(jié)果 圖9所示為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與ZC-n 復(fù)合膜共培養(yǎng)后分化為成骨細(xì)胞的掃描電鏡圖。非誘導(dǎo)組中細(xì)胞大部分呈梭形、圓形且表面較光滑，隨著殼聚糖含量增加，細(xì)胞數(shù)量逐漸增多且無鈣化結(jié)節(jié)現(xiàn)象。誘導(dǎo)組中，從ZC-0到ZC-100，其細(xì)胞出現(xiàn)堆積且形態(tài)鋪展，體

34、積增大，尤其從ZC-50到ZC-100，出現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié)沉淀現(xiàn)象。而ZC-0至ZC-30效果不是很明顯，可能是因?yàn)闅ぞ厶呛繙p少，導(dǎo)致復(fù)合膜親水性減弱，從而減少了細(xì)胞的吸附。2.3.3 堿性磷酸酶含量 如表2所示，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與ZC-n復(fù)合膜共培養(yǎng)分化為成骨細(xì)胞后堿性磷酸酶含量的變化，隨著殼聚糖含量的增加，非誘導(dǎo)組與誘導(dǎo)組的吸光度值均呈增加趨勢(shì)，且誘導(dǎo)組的吸光度值均高于非誘導(dǎo)組，即差異有顯著性意義(P < 0.05)。3 討論 Discussion玉米醇溶蛋白(Zein)來源于玉米，是一種天然蛋白，又稱醇溶谷蛋白。據(jù)Mckinney分類，可將其分為-zein和-zein7，其富含含硫氨基

35、酸，可以形成較強(qiáng)的分子內(nèi)二硫鍵，且與分子之間的疏水鍵一起構(gòu)成了玉米醇溶蛋白成膜的分子基礎(chǔ)。該蛋白平均相對(duì)分子質(zhì)量一般為25 000-45 000，分子呈棒狀結(jié)構(gòu)。玉米醇溶蛋白以其優(yōu)良的成膜特性、可降解性、良好的穩(wěn)定性及安全性決定了玉米醇溶蛋白具有廣泛的應(yīng)用。近年來，玉米醇溶蛋白在生物醫(yī)藥領(lǐng)域已得到廣泛的應(yīng)用。比如，Sousa等8探究了玉米醇溶蛋白(微觀粒子)在藥物運(yùn)輸方面的應(yīng)用，將該蛋白粒子分別與四環(huán)素、吲哚美辛、阿莫西林相互作用，并利用核磁共振技術(shù)檢測(cè)該蛋白粒子與3種藥物的親和力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白粒子具有顯著的親和力；另外，制備成藥物釋放載體，不僅可以延遲藥物釋放，而且不受胃酸破壞的同時(shí)到達(dá)作

36、用部位。玉米醇溶蛋白也可作為生物活性肽，用酶將玉米醇溶蛋白水解可獲得抗氧化肽，這種多肽具有降血壓、降血脂及抗癌等多種保健功能。由于玉米醇溶蛋白具有良好的生物相容性，可降解性及無毒副作用，因此滿足生物材料的基本要求。例如，Salerno等9構(gòu)建了聚己內(nèi)酯/玉米醇溶蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架材料，評(píng)估其在骨組織工程中的應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果顯示，該支架材料具有較好的降解性能、力學(xué)性能、細(xì)胞黏附性(MG63細(xì)胞)，且該材料促進(jìn)了成骨分化。同時(shí)，該蛋白在食品、化學(xué)工業(yè)等也有廣泛的應(yīng)用。從ZC-0(純玉米醇溶蛋白)的紅外光譜圖可以看出，其含酰胺和酰胺的特征吸收峰分別為1 643 cm-1和1 520 cm-1，而

37、ZC-100(純殼聚糖)則含有-OH、-NH2等官能團(tuán)10。由于不同比例玉米醇溶蛋白和殼聚糖結(jié)合且在靜電相互作用力下，酰胺和酰胺的吸收峰分別從1 643 cm-1和1 520 cm-1逐漸位移至1 651 cm-1和 1 581 cm-1。此外，殼聚糖出現(xiàn)1 148 cm-1吸收峰，且該吸收峰從1 148 cm-1位移至1 169 cm-1。殼聚糖提高了材料的親水性，這是因?yàn)橛衩状既艿鞍缀罅渴杷园被?，而含有大量親水基團(tuán)的殼聚糖將疏水性氨基酸基體包裹，使水分子更好的與材料結(jié)合，親水材料可能有利于細(xì)胞黏附和生長。因此，可以改變殼聚糖含量來調(diào)節(jié)ZC-n復(fù)合膜的親/疏水性，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞在其表面的

38、黏附性和生長行為。玉米醇溶蛋白易溶解于乙醇而殼聚糖不溶解11，純殼聚糖在乙醇中失質(zhì)量率幾乎為0%，即幾乎無質(zhì)量損失，而純玉米醇溶蛋白在乙醇中失質(zhì)量率接近100%，即完全溶解。在乙醇中，樣品干質(zhì)量的變化反映了原樣品中玉米醇溶蛋白的含量，但是失質(zhì)量率并不完全等于原樣中玉米醇溶蛋白的固含量，這可能一方面因?yàn)橹苽鋾r(shí)的樣品損失(如：過濾、離心)，另一方面可能少量的玉米醇溶蛋白在此條件下與殼聚糖結(jié)合緊密，而沒有完全從復(fù)合膜中溶解出來。例如，殼聚糖為50%的膜可能有部分玉米醇溶蛋白未溶解，而是與殼聚糖發(fā)生了較強(qiáng)的相互作用，這從ZC-50 的掃描電鏡斷面照片和力學(xué)性能可得到進(jìn)一步證實(shí)。玉米醇溶蛋白以顆粒狀在Z

39、C-n 復(fù)合膜中呈均勻分布。同時(shí)，隨著殼聚糖含量的增加，孔隙逐漸減少且孔徑變小。在飽和K2CO3 氛圍下平衡1周后，隨著殼聚糖含量從0%到100%，膜材料的拉伸強(qiáng)度從7.5%逐漸升至111.2%，而斷裂伸長率則由1.2%緩慢升至35%。殼聚糖含量為90%時(shí)，力學(xué)強(qiáng)度達(dá)到最大值，這是由于純殼聚糖強(qiáng)度較高12，干態(tài)較脆，表明玉米醇溶蛋白較均勻分布在殼聚糖中且達(dá)到一定的增強(qiáng)作用，使其力學(xué)強(qiáng)度甚至高于純殼聚糖膜。樣品在水中浸泡1 h后，其拉伸強(qiáng)度明顯降低， 140120100806040200吸水率(%)0 10 20 30 40 501 800 1 600 1 400 1 200 1 000 800

40、時(shí)間(h)波數(shù)(cm-1)圖3 ZC-n 復(fù)合膜的吸水率Figure 3 Water absorption of zein/chitosan composite membrane圖注：隨著殼聚糖含量的增加，玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜的吸水率增加進(jìn)而達(dá)到平衡。圖1 ZC-n復(fù)合膜的表面紅外光譜Figure 1 Surface infrared spectra of zein/chitosan composite membrane圖注：隨著殼聚糖含量的增加，酰胺和酰胺向高波數(shù)移動(dòng)，表明玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜形成了較強(qiáng)的氫鍵。圖2 ZC-n復(fù)合膜斷面的掃描電鏡照片F(xiàn)igure 2 Section

41、 of zein/chitosan composite membrane under scanning electron圖注：隨著殼聚糖含量的增加，玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜斷面上出現(xiàn)一些紋理結(jié)構(gòu)和鱗片結(jié)構(gòu)，表明樣品分子鏈之間相互作用增加，在拉伸或扭曲時(shí)不易斷裂(放大倍數(shù)：上排×1 000；下排×5 000)。ZC-0 ZC-10 ZC-30 ZC-50 ZC-70 ZC-90 ZC-100100806040200溶解率(%)ZC-0 ZC-10 ZC-30 ZC-50 ZC-70 ZC-90 ZC-100圖4 ZC-n復(fù)合膜的溶解率(乙醇)Figure 4 Dissolu

42、tion rate of zein/chitosan composite membrane in alcohol圖注：純殼聚糖在乙醇中失質(zhì)量率幾乎為0%，即幾乎無質(zhì)量損失，而純玉米醇溶蛋白在乙醇中失質(zhì)量率接近100%，即完全溶解。ZC-10 ZC-30 ZC-50 ZC-70 ZC-90 ZC-100圖5 浸泡在體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇后ZC-n復(fù)合膜斷面的掃描電鏡照片(×1 000)Figure 5 Section of zein/chitosan composite membrane immersed in 75% alcohol (scanning electron microsc

43、opy, x1 000)圖注：隨著殼聚糖含量的增加，玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜的孔隙逐漸減少且孔徑變小。圖6 ZC-n 復(fù)合膜的拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長率Figure 6 Tensile strength and elongation at break of zein/chitosan composite membrane圖注：隨著殼聚糖含量從0%到100%，膜材料的拉伸強(qiáng)度從7.5%逐漸升至111.2%，而斷裂伸長率則由1.2%緩慢升至35%。隨著殼聚糖含量從0%到100%，拉伸強(qiáng)度在9.8%- 28.9%之間，而斷裂伸長率在1.5%-22.1%之間。這一趨勢(shì)與飽和K2CO3 氛圍下平衡1周后力學(xué)

44、性能趨勢(shì)大致相同。斷裂伸長率(%)(%)拉伸強(qiáng)度斷裂伸長率拉伸強(qiáng)度(MPa)殼聚糖含量 (%)干態(tài)拉伸強(qiáng)度斷裂伸長率殼聚糖含量 (%)相對(duì)濕態(tài)拉伸強(qiáng)度(MPa)斷裂伸長率(%)圖7 玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的光鏡圖(×400)Figure 7 Osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells induced by zein/chitosan composite membrane under light microscope (×400)圖注：細(xì)胞數(shù)量隨著殼聚糖含量的

45、增加而逐漸增多，這是由于含大量親水基團(tuán)的殼聚糖改善了玉米醇溶蛋白的疏水性，使該復(fù)合膜能有效地吸附蛋白質(zhì)，進(jìn)而增強(qiáng)了該膜的細(xì)胞黏附性。非誘導(dǎo)組 誘導(dǎo)組 非誘導(dǎo)組 誘導(dǎo)組圖8 玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的熒光圖(×400)Figure 8 Osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells induced by zein/chitosan composite membrane by fluorescent labeling method (×400)圖注：隨著殼聚糖含量的增

46、加，熒光強(qiáng)度相對(duì)增強(qiáng)，這是由于殼聚糖改善了復(fù)合膜的親水性。非誘導(dǎo)組 誘導(dǎo)組 非誘導(dǎo)組 誘導(dǎo)組圖9 玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的掃描電鏡圖(×1 000)Figure 9 Osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells induced by zein/chitosan composite membrane under scanning electron microscopy (×1 000)圖注：非誘導(dǎo)組中細(xì)胞大部分呈梭形、圓形且表面較光滑，隨著殼聚糖含量增加，細(xì)胞數(shù)

47、量逐漸增多且無鈣化結(jié)節(jié)現(xiàn)象。誘導(dǎo)組中，從ZC-0到ZC-100，其細(xì)胞出現(xiàn)堆積且形態(tài)鋪展，體積增大，尤其從ZC-50到ZC-100，出現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié)沉淀現(xiàn)象。ZC-0 ZC-10 ZC-30 ZC-50 ZC-70 ZC-90 ZC-100非誘導(dǎo)組誘導(dǎo)組3079ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH斷裂伸長率卻顯著上升。隨著殼聚糖含量從0%到100%，拉伸強(qiáng)度在9.8%-28.9%之間，而斷裂伸長率在1.5%-122.1%之間。這一趨勢(shì)與飽和K2CO3氛圍下平衡1周后力學(xué)性能趨勢(shì)大致相同。在拉伸強(qiáng)度中，ZC-10、ZC-30 和ZC-50 的強(qiáng)度略低于純

48、玉米醇溶蛋白，這可能是因?yàn)榧冇衩状既艿鞍妆绕渌ぞ哂懈玫哪退?。?xì)胞毒性試驗(yàn)是評(píng)價(jià)生物醫(yī)用材料安全性的方法之一12。CCK-8中的WST-8被細(xì)胞中的脫氫酶還原為水表1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在ZC-n復(fù)合膜材料浸提液中培養(yǎng)的增殖活性 (±s，n=20，%)Table 1 Cell viability of bone marrow mesenchymal stem cells cultured in the zein/chitosan composite membrane extracts at different time points表注：與空白對(duì)照組比較，aP < 0.05。

49、ZC-n：Z表示玉米醇溶蛋白；C表示殼聚糖；n表示殼聚糖所占百分比。組別1 d3 d5 d7 d空白對(duì)照組100.00±0.00100.00±0.00100.00±0.00100.00±0.00ZC-0107.82±9.25109.94±9.31113.56±9.87a114.62±10.12aZC-10105.12±9.17109.87±9.29110.56±9.62115.26±10.09aZC-3099.85±9.02101.25±8.96103.6

50、9±9.14101.69±9.13ZC-50102.36±8.93102.14±8.98102.35±8.96101.99±9.02ZC-70100.58±8.91101.18±8.94101.97±8.95103.15±9.04ZC-9097.98±8.89106.89±9.23107.12±9.67116.89±10.08aZC-100101.29±8.92103.68±9.18105.62±9.49114.96±

51、;10.04a表2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞結(jié)合材料誘導(dǎo)成骨后堿性磷酸酶含量變化 (±s，n=20，吸光度值)Table 2 Activities of alkaline phosphatase of bone marrow mesenchymal stem cells after indued by zein/chitosan composite membrane組別非誘導(dǎo)組誘導(dǎo)組空白對(duì)照組0.500±0.0321.72±0.11aZC-00.620±0.0430.890±0.062aZC-100.680±0.0420.880±0

52、.061aZC-300.660±0.0450.780±0.052aZC-500.790±0.0541.68±0.12aZC-701.12±0.092.25±0.19aZC-901.21±0.101.96±0.13aZC-1000.890±0.0782.69±0.21a表注：與空白對(duì)照組比較，aP < 0.05。ZC-n：Z表示玉米醇溶蛋白；C表示殼聚糖；n表示殼聚糖所占百分比。溶性的黃色甲臜，甲臜物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，可通過檢測(cè)490 nm 處的吸光度值來反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量，因此CCK-

53、8是目前被用于檢測(cè)細(xì)胞毒性的常用方法之一，具有重復(fù)性好、高靈敏度、操作簡便等諸多優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，ZC-n復(fù)合膜的浸提液能促進(jìn)細(xì)胞增殖，無毒副作用，且細(xì)胞數(shù)量隨著殼聚糖含量增加而增多，因此玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜具有良好的細(xì)胞相容性。在非誘導(dǎo)組中，細(xì)胞數(shù)量隨著殼聚糖含量的增加而逐漸增多，這是由于含大量親水基團(tuán)的殼聚糖改善了玉米醇溶蛋白的疏水性，使該復(fù)合膜能有效地吸附蛋白質(zhì)，進(jìn)而增強(qiáng)了該膜的細(xì)胞黏附性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在成骨誘導(dǎo)液作用下，隨著殼聚糖含量的增加，細(xì)胞堆積沉淀越為顯著，尤其從ZC-50到ZC-100發(fā)現(xiàn)有明顯的細(xì)胞鋪展、堆積且形態(tài)不規(guī)則，可見結(jié)節(jié)沉積。此外，還發(fā)現(xiàn)

54、在不加誘導(dǎo)液情況下，ZC-100自身促進(jìn)了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長與增殖，同時(shí)也出現(xiàn)細(xì)胞堆積，這是由于純殼聚糖有較強(qiáng)的親水性，能有效促進(jìn)細(xì)胞生長與增殖(快速)。隨著殼聚糖含量的增加，熒光強(qiáng)度相對(duì)增強(qiáng)，這是由于殼聚糖改善了復(fù)合膜的親水性。與非誘導(dǎo)組空白對(duì)照相比，誘導(dǎo)組空白對(duì)照的細(xì)胞出現(xiàn)堆積且熒光較強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)顯示，隨著殼聚糖含量增加，細(xì)胞成集落生長且沉淀堆積尤為明顯。非誘導(dǎo)組中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞大部分呈梭形、圓形且表面較光滑，隨著殼聚糖含量增加，細(xì)胞數(shù)量逐漸增多且無鈣化結(jié)節(jié)現(xiàn)象。誘導(dǎo)組中從ZC-0到ZC-100，其細(xì)胞出現(xiàn)堆積且形態(tài)鋪展，體積增大，尤其從ZC-50到ZC-100，出現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié)沉淀現(xiàn)象。Z

55、C-0至ZC-30效果不是很明顯，可能是因?yàn)闅ぞ厶呛繙p少，導(dǎo)致復(fù)合膜親水性減弱，從而減少了細(xì)胞的吸附。在誘導(dǎo)液作用下，ZC-n復(fù)合膜與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞結(jié)合并將其誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，且隨著殼聚糖含量的增加，分化效果越為明顯，尤其是ZC-n(n=50，70，90，100)分化效果顯著。在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向成骨分化中，堿性磷酸酶是成骨細(xì)胞表面的一種標(biāo)志性酶，隨著細(xì)胞分化程度增加，堿性磷酸酶表達(dá)增加。實(shí)驗(yàn)采用對(duì)硝基酚磷酸二鈉作為堿性磷酸酶的反應(yīng)底物，在堿性磷酸酶的作用下，釋放出的對(duì)硝基苯酚(4-NPP)在堿性溶液中分子重排，可形成水溶性醌類產(chǎn)物(黃色)，且在405 nm處有吸收峰13-15。隨著殼

56、聚糖含量的增加，非誘導(dǎo)組與誘導(dǎo)組的吸光度值均呈增加趨勢(shì)，且誘導(dǎo)組的吸光度值均高于非誘導(dǎo)組，差異有顯著性意義(P < 0.05)，這是由于殼聚糖提高了復(fù)合膜的親水性，易于蛋白質(zhì)的吸附，從而促進(jìn)細(xì)胞生長與增殖，在誘導(dǎo)液作用下，堿性磷酸酶表達(dá)逐漸增加。綜上所述，實(shí)驗(yàn)制備了殼聚糖含量從0%到100%的一系列玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜，并表征了其結(jié)構(gòu)和理化性能。結(jié)果表明，隨著殼聚糖含量的增加，復(fù)合膜的拉伸強(qiáng)度增強(qiáng)，斷裂伸長率增加，吸水率增強(qiáng)、親水性增強(qiáng)。殼聚糖改善了復(fù)合膜的親水性，有效促進(jìn)了細(xì)胞黏附、生長及增殖，即ZC-n復(fù)合膜表現(xiàn)出良好的細(xì)胞相容性。在誘導(dǎo)液作用下，ZC-n復(fù)合膜與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞結(jié)合并將其誘導(dǎo)分化成骨細(xì)胞，隨著殼聚糖含量的增加，其促進(jìn)分化的效果越明顯。玉米醇溶蛋白/殼聚糖復(fù)合膜具有較好的力學(xué)性能、生物相容性以及具有誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的功能，有望作為生物材料應(yīng)用于骨組織工程中。作者貢